KAPITEL I

A.

Ein Bestand gilt als amtlich anerkannt frei von enzootischer Rinderleukose, wenn folgende Anforderungen erfüllt sind:

i)

Es liegen weder klinische Befunde noch Laborergebnisse vor, die auf enzootische Rinderleukose im Bestand schließen lassen, und in den letzten zwei Jahren ist kein Fall von enzootischer Rinderleukose bestätigt worden, und

ii)

alle über 24 Monate alten Tiere haben auf zwei Tests, die innerhalb der letzten zwölf Monate im Abstand von mindestens vier Monaten nach Maßgabe dieses Anhangs durchgeführt wurden, negativ reagiert; oder

iii)

der Bestand erfüllt die unter Ziffer i) genannten Anforderungen und liegt in einem amtlich anerkannt leukosefreien Mitgliedstaat oder Gebiet eines Mitgliedstaats.

B.

Der Status der amtlich anerkannten Leukosefreiheit eines Bestandes bleibt erhalten, wenn folgende Voraussetzungen erfüllt sind:

i)

Die Anforderung gemäß Abschnitt A Ziffer i) ist weiterhin erfüllt.

ii)

Alle in den Bestand aufgenommenen Tiere stammen aus einem amtlich anerkannt leukosefreien Bestand.

iii)

Alle über 24 Monate alten Tiere haben im Test, der nach Maßgabe von Kapitel II alle drei Jahre durchgeführt wird, weiterhin negativ reagiert.

iv)

In einem Bestand aufgenommene Zuchttiere, die aus einem Drittland stammen, sind gemäß Richtlinie 72/462/EWG eingeführt worden.

C.

Der Status der amtlich anerkannten Leukosefreiheit eines Bestands wird ausgesetzt, wenn die Anforderungen gemäß Abschnitt B nicht erfüllt sind oder wenn aufgrund von Labortests oder klinischer Anzeichen bei einem oder mehreren Tieren Verdacht auf Leukose besteht und das (die) betreffende(n) Tier(e) unverzüglich geschlachtet wird (werden).

D.

Der Status bleibt ausgesetzt, bis folgende Anforderungen erfüllt sind:

1.

Sofern nur ein einziges Tier eines amtlich anerkannt leukosefreien Bestandes auf einen der Tests gemäß Kapitel II positiv reagiert hat oder bei einem einzigen Tier eines Bestands aus anderen Gründen Verdacht auf eine Infektion besteht, gelten folgende Bestimmungen:

i)

Der Reagent und — falls es sich um eine Kuh handelt — ihre Kälber ist/sind unter veterinärbehördlicher Aufsicht zur Schlachtung zu führen.

ii)

Alle Tiere des Bestands, die älter als zwölf Monate sind, müssen auf zwei serologische Tests, die im Abstand von mindestens vier und höchstens zwölf Monaten und frühestens drei Monate nach Entfernen des Reagenten und etwaiger Nachkommen nach Maßgabe von Kapitel II durchgeführt worden sind, negativ reagieren.

iii)

Es wurde eine epidemiologische Untersuchung mit negativem Ergebnis durchgeführt, und alle Kontaktbestände wurden den Maßnahmen gemäß Ziffer ii) unterzogen.

Die zuständige Behörde kann jedoch eine Ausnahme von der Verpflichtung, das Kalb einer infizierten Kuh zu schlachten, gewähren, wenn das Kalb unmittelbar nach seiner Geburt von der Mutter abgesondert wurde. In diesem Fall ist das Kalb an die Anforderungen gemäß Nummer 2 Ziffer iii) gebunden.

2.

Sofern mehrere Tiere eines amtlich anerkannt leukosefreien Bestands auf einen der Tests gemäß Kapitel II positiv reagiert haben oder bei mehreren Tieren eines Bestands aus anderen Gründen Verdacht auf eine Infektion besteht, gelten folgende Bestimmungen:

i)

Alle Reagenten und — falls es sich um Kühe handelt — ihre Kälber sind unter veterinärbehördlicher Aufsicht zur Schlachtung zu führen.

ii)

Alle über zwölf Monate alten Tiere müssen auf zwei Tests, die im Abstand von mindestens vier und höchstens zwölf Monaten nach Maßgabe von Kapitel II durchzuführen sind, negativ reagieren.

iii)

Alle anderen Tiere des Bestands sind zu identifizieren und dürfen den Betrieb erst verlassen, wenn sie den 24. Lebensmonat erreicht haben und nach Erreichung dieses Alters gemäß den Bestimmungen des Kapitels II untersucht worden sind; die zuständige Behörde kann jedoch gestatten, daß die betreffenden Tiere unter amtlicher Überwachung direkt der Schlachtung zugeführt werden.

iv)

Es wurde eine epidemiologische Untersuchung mit negativem Ergebnis durchgeführt, und alle Kontaktbestände wurden den Maßnahmen gemäß Ziffer ii) unterzogen.

Die zuständige Behörde kann jedoch eine Ausnahme von der Verpflichtung, das Kalb einer infizierten Kuh zu töten, gewähren, wenn das Kalb unmittelbar nach seiner Geburt von der Mutter abgesondert wurde. In diesem Fall ist das Kalb an die Anforderungen gemäß Nummer 2 Ziffer iii) gebunden.

E.

Nach dem Verfahren des Artikels 17 kann auf der Grundlage der gemäß Artikel 8 gemachten Angaben bestimmt werden, daß ein Mitgliedstaat oder ein Teil eines Mitgliedstaats als frei von enzootischer Rinderleukose gilt, sofern folgende Anforderungen erfüllt sind:

a)

Alle Anforderungen des Abschnitts A sind erfüllt, und mindestens 99,8 % der Rinderbestände sind amtlich anerkannt leukosefreie Bestände,

oder

b)

in dem betreffenden Mitgliedstaat oder dem betreffenden Teil eines Mitgliedstaats ist in den letzten drei Jahren kein Fall von enzootischer Rinderleukose bestätigt worden, und Tumore, bei denen der Verdacht besteht, daß sie durch enzootische Rinderleukose verursacht sind, unterliegen der Meldepflicht, und die betreffenden Fälle sind zu untersuchen, und

im Fall eines Mitgliedstaats: Alle über 24 Monate alten Tiere in mindestens 10 % der Bestände, nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, sind in den letzten 24 Monaten nach Maßgabe von Kapitel II mit negativem Ergebnis getestet worden, und

im Fall eines Teils eines Mitgliedstaats: Alle über 24 Monate alten Tiere sind in den letzten 24 Monaten nach Maßgabe von Kapitel II mit negativem Ergebnis getestet worden,

oder

c)

es wurde in einem anderen Verfahren mit einer Nachweissicherheit von 99 % festgestellt, daß weniger als 0,2 % der Bestände infiziert sind.

F.

Der Status der amtlich anerkannten Leukosefreiheit eines Mitgliedstaats oder eines Gebiets eines Mitgliedstaats bleibt erhalten, wenn

a)

alle im Hoheitsgebiet des betreffenden Mitgliedstaats oder in dem betreffenden Gebiet geschlachteten Rinder einer amtlichen Fleischuntersuchung unterzogen werden und jeder dabei festgestellte möglicherweise durch das ERL-Virus verursachte Tumor zur Laboruntersuchung gebracht wird;

b)

der betreffende Mitgliedstaat die Kommission über das Auftreten der enzootischen Rinderleukose in dem betreffenden Gebiet unterrichtet;

c)

alle in einer der Untersuchungen gemäß Kapitel II positiv reagierenden Rinder getötet werden und der betreffende Bestand bis zum Wiedererlangen seines Status gemäß Abschnitt D gesperrt wird und

d)

alle über zwei Jahre alten Rinder in den ersten fünf Jahren nach Erreichung des Status entweder einmal gemäß Kapitel II oder nach einer anderen Methode getestet worden sind, die mit 99prozentiger Sicherheit beweist, daß weniger als 0,2 % des Bestands infiziert wurden. Für den Fall jedoch, daß in dem betreffenden Mitgliedstaat oder Gebiet seit mindestens drei Jahren in einem von 10000 Beständen kein Fall von enzootischer Rinderleukose gemeldet worden ist, kann nach dem Verfahren des Artikels 17 beschlossen werden, die Häufigkeit der routinemäßigen serologischen Untersuchung zu senken, sofern alle über zwölf Monate alten Rinder in mindestens 1 % der Bestände, nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, einem gemäß Kapitel II durchgeführten Test unterzogen wurden.

G.

Der Status der amtlich anerkannten Leukosefreiheit eines Mitgliedstaats oder eines Teils eines Mitgliedstaats wird nach dem Verfahren des Artikels 17 ausgesetzt, wenn die Untersuchungen gemäß Abschnitt F erkennen lassen, daß sich die Seuchenlage in einem amtlich anerkannt leukosefreien Mitgliedstaat oder Teil eines Mitgliedstaats nachweislich wesentlich verändert hat.

Der Status der amtlich anerkannten Leukosefreiheit kann nach dem Verfahren des Artikels 17 wiedererlangt werden, sofern die nach demselben Verfahren aufgestellten Anforderungen erfüllt sind.

KAPITEL II

Die enzootische Rinderleukose (ERL) wird nachgewiesen im Immundiffusionstest nach Maßgabe der Bestimmungen gemäß den Abschnitten A und B oder im Enzymimmunoassay (ELISA) nach Maßgabe der Bestimmung gemäß Abschnitt C. Die Immunodiffusionstechnik kann nur im Einzeltest angewandt werden. Werden die Testergebnisse gerechtfertigterweise in Frage gestellt, so wird als zusätzliche Kontrolle ein Agar-Gel-Immundiffusionstest durchgeführt. AGID und ELISA werden anhand des E05-Serums standardisiert, das amtliches Standardserum der Union wird und bereitgestellt wird von:

Friedrich-Loeffler-Institut

Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit

OIE-Referenzlabor für Enzootische Bovine Leukose (EBL)

Südufer 10

17493 Greifswald — Insel Riems

Deutschland

A.

Agar-Gel-Immundiffusion zum Nachweis der enzootischen Rinderleukose

1.

Das Testantigen muss Glykoproteine des ERL-Virus enthalten. Das Antigen ist anhand des E05-Serums zu standardisieren.

2.

Die gemäß Artikel 6a benannten staatlichen Institute, nationalen Referenzlaboratorien oder amtlichen Institute für die Koordinierung der Standards und Diagnosemethoden der Tests auf enzootische Rinderleukose müssen die Zuständigkeit für die Eichung des Standard-Arbeitsantigens des Labors anhand des E05-Serums erhalten.

3.

Die im Labor verwendeten Standardantigene müssen den gemäß Artikel 6a benannten staatlichen Instituten, nationalen Referenzlaboratorien oder amtlichen Instituten mindestens einmal jährlich zur Prüfung gegen das E05-Serum zur Verfügung gestellt werden. Von dieser Standardisierung abgesehen kann das verwendete Antigen gemäß der Methode in Abschnitt B geeicht werden.

4.

Reagenzien:

a)

Antigen: Das Antigen muss ERL-Virus-spezifische Glykoproteine enthalten und muss anhand des E05-Serums standardisiert worden sein;

b)

das Testserum;

c)

ein bekanntes positives Kontrollserum;

d)

Agar-Gel:

—

0,8 % Agar,

—

8,5 % NaCl,

—

0,05 M Tris-Puffer, pH 7,2;

—

15 ml dieses Agar werden in eine Petrischale von 85 mm Durchmesser gegeben, was eine Agar-Tiefe von 2,6 mm ergibt.

5.

Nach dem Testschema sieben bis zum Boden der Schale reichende Vertiefungen, die frei von Feuchtigkeit sein müssen, in den Agar stanzen; das Schema besteht aus einer zentralen Vertiefung, um die kreisförmig sechs weitere Vertiefungen angeordnet sind.

Durchmesser der zentralen Vertiefung: 4 mm;

Durchmesser der Randvertiefung: 6 mm;

Abstand zwischen zentraler Vertiefung und Randvertiefungen: 3 mm.

6.

Die zentrale Vertiefung mit Standardantigen, die Randvertiefungen 1 und 4 (siehe B.3) mit dem bekannten Positivserum und die Vertiefungen 2, 3, 5 und 6 mit dem Testserum soweit auffüllen, bis der Schalenboden nicht mehr zu sehen ist.

7.

Daraus ergeben sich folgende Mengen:

—

Antigen: 32 μl,

—

Kontrollserum: 73 μl,

—

Testserum: 73 μl.

8.

Für 72 Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 27 °C) in geschlossener feuchter Atmosphäre inkubieren.

9.

Das Testergebnis kann nach 24 und nach 48 Stunden abgelesen werden, ein endgültiges Ergebnis liegt jedoch erst nach 72 Stunden vor.

a)

Ein Testserum ist positiv, wenn es mit dem ERL-Antigen eine deutlich sichtbare Präzipitationslinie bildet, die Präzipitate ineinander übergehen und vollständig verschmelzen, das Antiserum also mit der Kontrollprobe identisch ist;

b)

ein Testserum ist negativ, wenn es mit dem ERL-Antigen keine deutlich sichtbare Präzipitationslinie bildet und die Linie des Kontrollserums nicht biegt;

c)

die Reaktion ist nicht eindeutig,

i)

wenn das Testserum die Linie des Kontrollserums zur das ERL-Antigen enthaltenen Vertiefung hin biegt, ohne jedoch eine sichtbare Präzipitationslinie mit dem Antigen zu bilden, oder

ii)

wenn das Testserum weder als negativ noch als positiv abgelesen werden kann.

Bei fraglichen Ergebnissen kann der Test mit Konzentratserum wiederholt werden.

10.

Es können andere Vertiefungsanordnungen oder Testschemata verwendet werden, wenn das E05-Serum, 1:10 in negativem Serum verdünnt, sich als positiv nachweisen lässt.

B.

Verfahren der Antigenstandardisierung

1.

Reagenzien und Geräte

a)

40 ml 1,6 %iger Agarose in 0,05 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,2 mit 8,5 % NaCl;

b)

15 ml eines Rinderleukoseserums, das nur Antikörper gegen ERL-Virus-Glykoproteine enthält, 1:10 verdünnt in 0,05 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,2 mit 8,5 % NaCl;

c)

15 ml eines Rinderleukoseserums, das nur Antikörper gegen ERL-Virus-Glykoproteine enthält, 1:5 verdünnt in 0,05 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,2 mit 8,5 % NaCl;

d)

vier Kunststoff-Petrischalen von 85 mm Durchmesser;

e)

eine Lochstanze mit 4 bis 6 mm Durchmesser;

f)

ein Referenzantigen;

g)

das zu standardisierende Antigen;

h)

ein Wasserbad (56 °C).

2.

Verfahrensweise

1,6 %ige Agarose in Tris/HCl-Puffer durch vorsichtiges Erhitzen auf 100 °C lösen. Lösung und die Rinderleukoseserum-Verdünnungen für etwa eine Stunde ins Wasserbad (56 °C) stellen.

15 ml der auf 56 °C erhitzten Agarose-Lösung mit den 15 ml Rinderleukoseserum, 1:10 verdünnt, mischen, kurz schütteln und jeweils 15 ml in zwei Petrischalen füllen. Das Verfahren mit dem 1:5 verdünnten Rinderleukoseserum wiederholen.

Agarose erstarren lassen, und wie folgt Löcher in das Agarose-Gel stanzen:

3.

Zugabe von Antigen

a)

Petrischalen 1 und 3:

i)

Vertiefung A — unverdünntes Referenzantigen,

ii)

Vertiefung B — 1:2 verdünntes Referenzantigen,

iii)

Vertiefung C und E — Referenzantigen,

iv)

Vertiefung D — unverdünntes Testantigen;

b)

Petrischalen 2 und 4:

i)

Vertiefung A — unverdünntes Testantigen,

ii)

Vertiefung B — 1:2 verdünntes Testantigen,

iii)

Vertiefung C — 1:4 verdünntes Testantigen,

iv)

Vertiefung D — 1:8 verdünntes Testantigen.

4.

Zusätzliche Anweisungen

a)

Den Versuch mit zwei Serumverdünnungen (1:5 und 1:10) durchführen, um die bestmögliche Präzipitation zu erzielen.

b)

Ist der Präzipitationsdurchmesser mit beiden Verdünnungen zu klein, das Serum weiter verdünnen.

c)

Ist der Präzipitationsdurchmesser mit beiden Verdünnungen zu groß und zu schwach, eine schwächere Serumverdünnung verwenden.

d)

Die Endkonzentration der Agarose muss 0,8 %, die der Seren 5 % bzw. 10 % betragen.

e)

Die gemessenen Durchmesser in das folgende Koordinatensystem einzeichnen. Die Verdünnung des Testantigens, die den gleichen Durchmesser hat wie das Bezugsantigen, ist die Arbeitsverdünnung.

C.

Enzymimmunoassay (ELISA) zum Nachweis der enzootischen Rinderleukose

1.

Reagenzien und Geräte:

a)

Festphasen-Mikroplatten, Küvetten oder sonstige Festphasen;

b)

das Antigen, mit oder ohne Hilfe von polyklonalen oder monoklonalen bindungsstarken Antikörpern an die feste Phase gebunden. Ist das Antigen direkt an den Festphasenantikörper gebunden, so sind alle Testproben mit positiven Reaktionen erneut gegen das Kontrollantigen zu testen. Das Kontrollantigen sollte mit dem Antigen identisch sein, allerdings ohne ERL-Virus-Antigene. Sind bindungsstarke Antikörper an die feste Phase gebunden, so dürfen die Antikörper nur auf Antigene gegen Rinderleukoseviren reagieren;

c)

die zu untersuchende Körperflüssigkeit;

d)

eine entsprechende positive und negative Kontrolle;

e)

Konjugat;

f)

ein dem verwendeten Enzym entsprechendes Substrat;

g)

erforderlichenfalls eine Stopplösung;

h)

Lösungen zur Verdünnung der Testproben für die Herstellung der Reagenzien und zum Waschen;

i)

ein für das gewählte Substrat geeignetes Ablesegerät.

2.

Standardisierung und Empfindlichkeit des Tests

Der ELISA-Test muss so empfindlich sein, dass das E05-Serum positiv reagiert, wenn es 10-mal (Serumproben) bzw. 250-mal (Milchproben) so stark verdünnt wird wie die Lösung, die sich aus der Zusammenfassung von Einzelproben in Pools ergibt. Bei Versuchen, in denen Proben (Serum und Milch) einzeln getestet werden, muss das im Verhältnis 1:10 (im Negativserum) oder 1:250 (in Negativmilch) verdünnte E05-Serum positiv reagieren, wenn es in derselben Verdünnung wie die Einzelproben getestet wird. Die in Abschnitt A Nummer 2 angeführten amtlichen Institute sind für die Qualitätskontrolle des ELISA-Verfahrens zuständig und bestimmen insbesondere, wie viele Einzelproben aus jeder Produktionspartie auf der Grundlage des für das E05-Serum erhaltenen Titers in Pools zusammenzufassen sind.

3.

Voraussetzungen für die Verwendung des ELISA-Tests zum Nachweis der enzootischen Rinderleukose

a)

Das ELISA-Verfahren kann bei Serum- oder Milchproben angewandt werden.

b)

Werden ELISA-Testmethoden zur Bescheinigung im Sinne des Artikels 6 Absatz 2 Buchstabe c oder zur Feststellung und Erhaltung des Bestandsstatus gemäß Anhang D Teil I angewendet, so sind die Serum- oder Milchproben so zur Sammelprobe zusammenzufassen, dass die zur Untersuchung genommenen Proben zweifelsfrei den unter die Sammelprobe fallenden einzelnen Tieren zugeordnet werden können. Etwaige Bestätigungstests sind an bei einzelnen Tieren genommenen Proben durchzuführen.

c)

Werden ELISA-Testmethoden zur Untersuchung von Sammelmilchproben verwendet, so müssen diese aus Milch gebildet werden, die in einem Betrieb mit mindestens 30 % laktierenden Milchkühen gesammelt wurde. Etwaige Bestätigungstests sind an Serum- oder Milchproben einzelner Tiere durchzuführen.