Die nachstehenden Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von ND-Viren sind Mindestrichtlinien für die Seuchendiagnose.

Für die Verfahren zur Bestätigung und Differentialdiagnose der Geflügelpest gilt folgende Begriffsbestimmung:

Die Geflügelpest ist eine Infektionskrankheit, die von einem Influenza-A-Virus mit einem intravenösen Pathogenitätsindex in sechs Wochen alten Hühnern von 1,2 oder mehr verursacht wird, bzw. eine Influenza-A-Infektion der Virussubtypen H5 oder H7, bei der im Rahmen einer Nukleotid-Sequenzanalyse das Vorhandensein multipler basischer Aminosäuren im Spaltbereich des Hämagglutinins nachgewiesen wurde.

KAPITEL 1

1.

Probenmaterial

Kloakenabstriche (oder Fäzes) sowie Luftröhrenabstriche von erkrankten Vögeln; Fäzes oder Darminhalt, Hirngewebe, Luftröhre, Lungen, Leber, Milz sowie andere eindeutig infizierte Organe kürzlich verendeter Tiere.

2.

Behandlung des Probenmaterials

Die unter Nummer 1 genannten Organe und Gewebe können gepoolt werden; nur Fäkalmaterial ist unbedingt gesondert zu behandeln. Abstriche sollten ganz in ein antibiotisches Medium getaucht, Fäkalproben und Organe in antibiotischem Medium (im geschlossenen Blender oder unter Verwendung von Stößel und Mörser und sterilem Sand) homogenisiert und zu 10 bis 20 % w/v suspendiert werden. Die Suspensionen sind für rund 2 Stunden bei Umgebungstemperatur (bei 4 °C entsprechend länger) stehen zu lassen und danach durch Zentrifugieren zu klären (z. B. 800—1000 g für 10 Minuten).

3.

Antibiotisches Medium

Verschiedene Laboratorien haben antibiotische Medien in unterschiedlicher Zusammensetzung erfolgreich angewandt; für ein bestimmtes Land können die Laboratorien gemäß Anhang II zu Rate gezogen werden. Für Fäkalproben sind Antibiotika in hoher Konzentration erforderlich; als typische Mischung gilt: 10000 Einheiten/ml Penicillin, 10 mg/ml Streptomycin, 0,25 mg/ml Gentamycin und 5000 Einheiten/ml Mycostatin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Für Gewebe und Luftröhrenabstriche können diese Mengen bis auf ein Fünftel verringert werden. Gegen Chlamydienorganismen können 50 mg/ml Oxytetracyclin zugegeben werden. Bei der Herstellung des Mediums ist unbedingt der pH-Wert nach Zugabe der Antibiotika zu überprüfen und auf 7,0—7,4 zu korrigieren.

KAPITEL 2

Virusisolierung in embryonierten Hühnereiern

Die Allantoishöhlen von mindestens vier embryonierten Eiern, die 8—10 Tage vorbebrütet wurden, werden mit 0,1—0,2 ml des geklärten flüssigen Überstands beimpft. Im Idealfall sollten diese Eier aus einer spezifiziert pathogenfreien Herde stammen; ansonsten können auch Eier aus einem Bestand verwendet werden, der nachweislich frei von Geflügelpestvirus-Antikörpern ist. Die beimpften Eier werden bei 37 °C aufbewahrt und täglich durchleuchtet. Eier mit toten bzw. absterbenden Embryonen sowie alle anderen Eier sind sechs Tage nach der Beimpfung auf 4 °C abzukühlen, und die Allantois-/Amnionflüssigkeiten auf Hämagglutination zu untersuchen. Läßt sich keine Hämagglutination feststellen, so wird das vorgenannte Verfahren mit unverdünnter Allantois-/Amnionflüssigkeit als Inokulum wiederholt. Wird Hämagglutination festgestellt, so ist im Kulturverfahren zu prüfen, ob eine Bakterienkontamination vorliegt. Sind Bakterien vorhanden, so können die Flüssigkeiten durch einen 450-nm-Membranfilter passiert und nach Zugabe weiterer Antibiotika in embryonierte Eier — wie oben beschrieben — inokuliert werden.

KAPITEL 3

1.

Vorläufige Differenzierung

Da es wesentlich ist, zur Eindämmung der Virusverbreitung möglichst schnell Bekämpfungsmaßnahmen durchzuführen, sollten die regionalen Laboratorien in der Lage sein, zusätzlich zum NDV-Virus isolierte hämagglutinierende Viren als Influenza-Viren des Subtyps H5 bzw. H7 zu identifizieren. Die hämagglutinierenden Flüssigkeiten sollten einen Hämagglutinations-Hemmungstest nach Kapitel 5 und 6 unterzogen werden. Eine positive Hemmung, d. h. 2⁴ oder mehr, mit den für die Subtypen H5 oder H7 des Influenza-A-Virus spezifischen polyklonalen Antiseren, deren Titer mindestens 2⁹ beträgt, würde als vorläufiger Nachweis ausreichen und die Anordnung zwischenzeitlicher Bekämpfungsmaßnahmen rechtfertigen.

2.

Bestätigungsnachweis

Da es 13 Hämagglutinin-Subtypen und 9 Neuraminidase-Subtypen von Influenza-Viren gibt, die ihrerseits variieren, ist es für die einzelnen nationalen Laboratorien weder praktikabel noch kostenwirksam, Antiseren vorrätig zu halten, die einen vollständige Antigen-Charakterisierung von Influenza-Isolaten gestatten. Jedes nationale Laboratorium sollte jedoch

i)

gemäß Kapitel 9 mittels Doppeldiffusion zum Nachweis des Gruppenantigens das Isolat als Influenza-A-Virus bestätigen (Immunfluoreszenz- oder der ELISA-Test können zum Nachweis von Gruppenantigenen verwendet werden, wenn das nationale Laboratorium diese Verfahren vorzieht);

ii)

bestimmen, ob das Isolat vom Subtyp H5 bzw. H7 ist oder nicht;

iii)

einen intravenösen Pathogenitätstest gemäß Kapitel 7 dieses Anhangs an sechs Wochen alten Hühnern durchführen. Ein Pathogenitätsindex von über 1,2 läßt auf das Vorliegen des Virus schließen, und die Bekämpfungsmaßnahmen sind in vollem Umfang durchzuführen (es wäre sinnvoll, wenn die nationalen Laboratorien durch Plaquetests gemäß Kapitel 8 die Fähigkeit eines Isolats, in Zellkulturen Plaques zu bilden, bestimmen würden).

Die nationalen Laboratorien sollten dem gemeinschaftlichen Referenzlabor unverzüglich alle Geflügelpest- und alle H5- und H7-Isolate zur umfassenden Charakterisierung zuleiten.

3.

Weitere Typendifferenzierung und Charakterisierung von Isolaten

Alle von den nationalen Laboratorien erhaltenen hämagglutinierenden Viren werden im EG-Referenzlaboratorium weiteren Antigen- und Genstudien unterzogen, um den Befugnissen und Aufgaben des Referenzlabors entsprechend weitere Erkenntnisse über den Seuchenverlauf in der Gemeinschaft zu gewinnen. Darüber hinaus obliegt dem gemeinschaftlichen Referenzlabor die umfassende Antigentypisierung aller eingegangenen Influenza-Viren. Bei Viren des Subtyps H5 bzw. H7, deren intravenöser Pathogenitätsindex nicht über 1,2 liegt, ist im Rahmen einer Nukleotid-Sequenzanalyse des Hämagglutiningens ferner zu bestimmen, ob im Spaltbereich des Hämagglutininproteins multiple basische Aminosäuren vorhanden sind. Viren, die trotz niedriger Pathogenitätsindizes keine multiplen basischen Aminosäuren im Spaltbereich vorweisen, erfordern umfassende Bekämpfungsmaßnahmen gegen die Geflügelpest.

KAPITEL 4

1. Im Rahmen von Tilgungsprogrammen, bei denen der Subtyp H des Seuchenvirus bereits bekannt ist oder bei denen das homologe Virus als Antigen verwendet wird, kann die serologische Überwachung zur Infektionsermittlung im Wege von Hämagglutinations-Hemmungstests gemäß Kapitel 5 und 6 erfolgen. Ist der Hämagglutinin-Subtyp nicht bekannt, so kann eine Influenza-A-Virusinfektion durch die Ermittlung von Antikörpern nachgewiesen werden, die gegen die gruppenspezifischen Antigene gerichtet sind. Dazu können entweder die Doppeldiffusion (Kapitel 9) oder der ELISA herangezogen werden (problematisch beim ELISA ist die Wirtsspezifität des Tests, da Wirtsimmunoglobuline nachgewiesen werden müssen). Bei Wasservögeln fallen Doppeldiffusionstests selten positiv aus und, sofern der Subtyp nicht bekannt ist, sollte man sich wahrscheinlich damit begnügen, Wasservögel auf Antikörper gegen die Subtypen H5 und H7 zu untersuchen.

2.

a)

Probenmaterial

Bei Beständen von weniger als 20 Vögeln sollten Blutproben von allen Tieren, bei größeren Beständen von 20 Tieren entnommen werden. (Sind mindestens 25 % des Bestands positiv, so wird auf diese Weise, ungeachtet der Bestandsgröße, mit über 99%iger Wahrscheinlichkeit mindestens ein Positivserum ermittelt.) Nach Gerinnung des Blutes wird das Serum zwecks Untersuchung entfernt.

b)

Antikörperprüfung

Die einzelnen Serumproben werden im Rahmen der Standard-Hämagglutinations-Hemmungstests nach Kapitel 6 auf ihre Fähigkeit geprüft, die Hämagglutination durch Virusantigen zu hemmen.

Es ist umstritten, ob 4 oder 8 Hämagglutinin-Einheiten (HAU) für den Hämagglutinations-Hemmungstest (HI-Test) verwendet werden sollen. Beides dürfte vertretbar sein, so daß die Entscheidung den nationalen Laboratorien überlassen werden sollte.

Von dem verwendeten Antigen hängt jedoch ab, ab wann ein bestimmtes Serum als positiv gilt: Bei 4 HAU gilt jedes Serum mit einem Titer von 2⁴ oder mehr, bei 8 HAU jedes Serum mit einem Titer von 2³ oder mehr als positiv.

KAPITEL 5

Reagenzien

1. Isotonische Salzlösung, phosphatgepuffert (0,05 M) auf einen pH-Wert von 7,0—7,4.

2. Rote Blutkörperchen, von mindestens drei spezifiziert pathogenfreien Hühnern entnommen (ist dies nicht möglich, kann Blut von Vögeln entnommen werden, die regelmäßig überwacht wurden und nachweislich frei von Geflügelpest-Antikörpern sind) und in gleicher Menge Alsever-Lösung gepoolt. Die Blutkörperchen sind vor ihrer Verwendung dreimal in gepufferter Kochsalzlösung zu reinigen. Für den Test wird eine 1 %-Suspension (Hämatokritwert v/v) in gepufferter Kochsalzlösung empfohlen.

3. Als Standardantigene liefert bzw. empfiehlt das Gemeinschaftliche Referenzlabor schwach virulente H5- und H7-Viren.

Verfahren

1. 0,025 ml gepufferte Salzlösung in alle (V-förmigen) Mulden eines Kunststoff-Mikrotitrators träufeln.

2. 0,025 ml Virussuspension (d. h. Allantois-Flüssigkeit) in die erste Mulde geben.

3. Mit einem Mikrotitrationsverdünner über das Testtablett verteilt zweifache Virusverdünnungen (1: 2 bis 1: 4096) herstellen.

4. Weitere 0,025 ml gepufferte Kochsalzlösung in jede Mulde einträufeln.

5. 0,025 ml 1 %ig suspendierte rote Blutkörperchen in alle Mulden geben.

6. Durch Antippen mischen und bei 4 °C aufbewahren.

7. Tablett nach 30—40 Minuten, wenn sich die Kontrollen gesetzt haben, ablesen. Dazu Tablett leicht anheben und auf Vorliegen bzw. Fehlen einer tropfenförmigen Strömung der roten Blutkörperchen prüfen. Mulden ohne Hämagglutination sollten die gleiche Strömungsrate aufweisen wie die virusfreien Kontrollzellen.

8. Als Hämagglutinationstiter gilt die höchste Verdünnung, bei der die roten Blutkörperchen agglutinieren, wobei davon ausgegangen werden kann, daß diese Verdünnung eine hämagglutinierende Einheit (HAU) enthält. Für eine genauere Bestimmung des Hämagglutinationstiters müssen Hämagglutinationstests mit Virusmaterial aus eng aufeinander folgenden Anfangsverdünnungsstufen (d. h. 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6 usw.) durchgeführt werden. Dieses Verfahren empfiehlt sich zur akkuraten Bereitung von Antigenmaterial für Hämagglutinations-Hemmungstests (vgl. Kapitel 6).

KAPITEL 6

Reagenzien

1. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).

2. Virushaltige Allantois-Flüssigkeit, mit gepufferter Kochsalzlösung auf 4 bzw. 8 hämagglutinierende Einheiten (HAU) je 0,025 ml verdünnt.

3. 1 %ig suspendierte rote Blutkörperchen (Hühner).

4. Negatives Hühner-Kontrollserum.

5. Positives Kontrollserum.

Verfahren

1. 0,025 ml gepufferte Kochsalzlösung in alle (V-förmigen) Mulden eines Kunststoff-Mikrotitrators träufeln.

2. 0,025 ml Serum in die Mulde geben.

3. Mit einem Mikrotitrationsverdünner über das Testtablett verteilt zweifache Serumverdünnung herstellen.

4. 0,025 ml verdünnte Allantois-Flüssigkeit mit 4 bzw. 8 HAU zugeben.

5. Durch Antippen mischen und Tablett für mindestens 60 Minuten bei 4 °C bzw. für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren.

6. 0,025 ml 1 %ig suspendierte rote Blutkörperchen in alle Mulden geben.

7. Durch Antippen mischen und bei 4 °C aufbewahren.

8. Testtabletts nach 30—40 Minuten, wenn sich die Kontrollzellen gesetzt haben, ablesen. Dazu Tablett leicht anheben und auf Vorliegen bzw. Fehlen einer tropfenförmigen Strömung achten. Die Strömungsrate sollte der in den Kontrollmulden entsprechen, die lediglich rote Blutkörperchen (0,025 ml) und gepufferte Kochsalzlösung (0,05 ml) enthalten.

9. Als Hemmtiter gilt die höchste Antiserumverdünnung, die 4 bzw. 8 Viruseinheiten vollständig hemmt. (Jeder Test sollte zur Bestätigung der erforderlichen HAU eine Hämagglutinationstitrierung beinhalten.)

10. Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt ab von einem Titerergebnis von weniger als 2³ bei 4 HAU bzw. 2² bei 8 HAU bei negativem Kontrollserum und von einem Titerergebnis, das innerhalb einer Verdünnung des bekannten Titerwertes des positiven Kontrollserums liegt.

KAPITEL 7

1. Infizierte Allantois-Flüssigkeit der niedrigsten verfügbaren Passage, möglichst aus erster Isolierung ohne Selektion, 10^-1 in steriler isotonischer Kochsalzlösung verdünnen.

2. 0,1 ml verdünnten Virus intravenös in jeweils zehn 6 Wochen alte Hühner (spezifiziert pathogenfreie Tiere) injizieren.

3. Die Tiere über einen Zeitraum von zehn Tagen in 24-Stunden-Abständen untersuchen.

4. Dabei jeweils wie folgt bewerten: normal (0), krank (1), schwerkrank (2) bzw. tot (3).

5. Nach folgendem Beispiel Ergebnis aufzeichnen und Index berechnen:

Klinische Symptome	Tag nach der Beimpfung										Insgesamt-bewertung
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
normal	10	2	0	0	0	0	0	0	0	0	12 × 0 = 0
krank	0	4	2	0	0	0	0	0	0	0	6 × 1 = 6
schwerkrank(*)	0	2	2	2	0	0	0	0	0	0	6 × 2 = 12
tot	0	2	6	8	10	10	10	10	10	10	76 × 3 = 228
											Insgesamt = 246
Index = Durchschnittswert je Tier und Prüfung = 246100 = 2,46

KAPITEL 8

1. Um eine optimale Plaquezahl auf dem Testtablett zu gewährleisten, empfiehlt es sich, eine Virusverdünnungsreihe zu verwenden. Zehnfache Verdünnungen bis 10^-7 in gepufferter Kochsalzlösung dürften ausreichen.

2. In Petrischalen von 5 cm Durchmesser konfluierende Zellrasen (Kükenembryozellen) bzw. eine angemessene Zellinie (zum Beispiel Madin-Darby-Rinderniere) bereiten.

3. In jeweils zwei Petrischalen 0,2 ml einer jeden Virusverdünnung zugeben und das Virus 30 Minuten absorbieren lassen.

4. Nach dreimaliger Reinigung mit gepufferter Salzlösung die infizierten Zellen mit einem geeigneten Medium überschichten, das 1 % w/v Agar und gegebenenfalls 0,01 mg/ml Trypsin enthält. Es ist darauf zu achten, daß dem Kulturmedium kein Serum zugegeben wird.

5. Nach 72stündiger Inkubation bei 37 °C dürften die Plaques groß genug sein. Sie werden am besten erkennbar durch Entfernen des überschichteten Agar und durch kristallviolette Anfärbung (0,5 % w/v) des Zellrasens in 25 % v/v Äthanol.

6. Bei Inkubation mit Trypsin im Kulturmedium sollten sämtliche Viren deutlich śichtbare Plaques bilden. Enthält die Überschichtung kein Trypsin, bilden nur hühnerinfizierende Viren Plaques.

KAPITEL 9

Das influenzale Virus wird vorzugsweise anhand der Nukleokapsid- oder Matrix-Antigene nachgewiesen, die allen Influenza-A-Viren gemeinsam sind. Dazu werden generell Immundoppeldiffusions-Tests herangezogen, die entweder konzentrierte Viruspräparate oder Extrakte von infizierter Chorioallantoismembran (CAM) voraussetzen. Geeignete Viruspräparate können gewonnen werden durch einfache Hochgeschwindigkeits-Zentrifugierung infektiöser Allantois-Flüssigkeit und Aufspaltung des Virus, um die internen Nukleokapsid- und Matrix-Antigene durch Behandlung mit dem Detergens Natrium-Lauroyl-Sarkosinat freisetzen zu können. Säurepräzipitation kann ebenfalls verwendet werden; dazu 1N HCl zur infektiösen Allantois-Flüssigkeit geben, um einen endgültigen pH-Wert von 3,5 bis 4,0 zu erreichen, mindestens eine Stunde bei 0 °C kühlen und 10 Minuten mit niedriger Geschwindigkeit bei 1000 g zentrifugieren. Der Überstand kann beseitigt und das virusenthaltende Präzipitat in einer Mindestmenge Glycin-Sarkosyl-Puffer (1 % Natrium-Lauroyl-Sarkosinat, gepuffert auf einen pH-Wert von 0,9 mit 0,5M Glycin) resuspendiert werden. Beide Präparate enthalten Nukleokapsid- und Matrix-Antigene. Beard (1970) erläuterte die Bereitung von nukleokapsid-reichem Antigen aus Chorioallantoismembran, die von infizierten Eiern entfernt wurde. Dieses Verfahren beinhaltet folgende Schritte: Entfernung der Chorioallantoismembran von infizierten hämagglutinin-positiven Eiern; Vermahlen oder Homogenisieren der Membran; dreimaliges Einfrieren und Auftauen mit anschließender Zentrifugierung bei 1000 g für 10 Minuten. Das Pellet beseitigen und den Überstand zur Verwendung als Antigen mit 0,1 % Formalin behandeln. Jedes dieser beiden Antigene kann in Doppeldiffusionstests mit 1 % Agarose oder Agargels mit 8,0 % Natriumchlorid, auf 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 gebracht, verwendet werden. Das Influenza-A-Virus wird bestätigt durch Präzipitationslinien, die dadurch entstehen, daß sich das Testantigen und das bekannte positive Antigen gegen ein bekanntes positives Antiserum richten und zu einer Identitätslinie verschmelzen.