KRITERIEN FÜR DIE PROBENAUFARBEITUNG UND FÜR DIE ANALYSEMETHODEN ZUR AMTLICHEN KONTROLLE DES GEHALTS AN MYKOTOXINEN IN LEBENSMITTELN

1.

EINLEITUNG

1.1.

Vorsichtsmaßnahmen

Da die Verteilung von Mytotoxinen im Allgemeinen nicht homogen ist, müssen die Proben besonders sorgfältig aufbereitet und homogenisiert werden. Die gesamte im Labor eingegangene Probe ist zu homogenisieren, sofern die Homogenisierung vom Labor vorgenommen wird. Während der Analyse auf Aflatoxine sollte Tageslichteinstrahlung so weit wie möglich vermieden werden, da Aflatoxin unter Einfluss von ultraviolettem Licht langsam zerfällt.

1.2.

Berechnung des Verhältnisses Schale/Kern bei ganzen Nüssen

Die mit der Verordnung (EG) Nr. 466/2001 festgesetzten Aflatoxinhöchstgehalte beziehen sich auf den essbaren Teil. Der Aflatoxingehalt im essbaren Teil kann folgendermaßen bestimmt werden:

—

Proben von Nüssen „in der Schale” können geschält werden, und der Aflatoxingehalt wird im essbaren Teil bestimmt.

—

Die Nüsse „in der Schale” können für die Probenaufbereitung verwendet werden. Für Probenahme und Analyse muss das Gewicht des Kerns in der Sammelprobe geschätzt werden. Das Gewicht des Kerns in der Sammelprobe wird nach Festlegung eines geeigneten Faktors für das Verhältnis Schale/Kern bei ganzen Nüssen geschätzt. Mit Hilfe dieses Verhältnisses wird der Anteil Kern an der an mehreren Stellen entnommenen Probe bestimmt, die für das Probenaufbereitungs- und Analyseverfahren verwendet wird.

Etwa 100 ganze Nüsse werden nach dem Zufallsprinzip von der Partie getrennt entnommen oder aus jeder Sammelprobe zur Seite gelegt. Das Verhältnis kann bei jeder Laborprobe ermittelt werden, indem man die ganzen Nüsse wiegt, schält und die Schalen- bzw. Kernanteile gesondert wiegt. Das Verhältnis Schale/Kern kann vom Labor anhand einer Reihe von Proben ermittelt und so bei nachfolgenden Analysen zugrunde gelegt werden. Verstößt eine Laborprobe jedoch gegen einen Höchstgehalt, so ist das Verhältnis für diese Probe unter Zugrundelegung der getrennt entnommenen rund 100 Nüsse zu ermitteln.

2.

BEHANDLUNG DER IM LABOR EINGEGANGENEN PROBE

Jede Laborprobe ist nach einem Verfahren, das nachweislich eine vollständige Homogenisierung gewährleistet, fein zu mahlen und sorgfältig zu mischen. Sofern der Höchstgehalt für die Trockenmasse gilt, ist bei einem Teil der homogenisierten Probe mit Hilfe eines Verfahrens, mit dem die Trockenmasse nachweislich genau bestimmt werden kann, die Trockenmasse zu bestimmen.

3.

PARALLELPROBEN

Die Parallelproben für Durchsetzungs-, Handels- (Rechtfertigungs-) und Schiedszwecke sind aus der homogenisierten Laborprobe zu entnehmen, sofern dies nicht gegen die Probenahmevorschriften des Mitgliedstaats hinsichtlich der Rechte des Lebensmittelunternehmers verstößt.

4.

VOM LABOR ANZUWENDENDE ANALYSEMETHODE UND KONTROLLANFORDERUNGEN AN DAS LABOR

4.1.

Definitionen

Nachstehend eine Reihe der gebräuchlichsten Definitionen, die das Labor verwenden sollte:

r=

Wiederholbarkeit; der Wert, unterhalb dessen man die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Prüfergebnissen, die unter Wiederholbarkeitsbedingungen (d. h. dieselbe Probe, derselbe Prüfer, dasselbe Gerät, dasselbe Labor, kurze Zeitspanne) erzielt werden, mit einer vorgegebenen Wahrscheinlichkeit (im Regelfall 95 %) erwarten darf, so dass r = 2,8 × s_r.

s_r=

Standardabweichung, berechnet aus unter Wiederholbarkeitsbedingungen ermittelten Ergebnissen.

RSD_r=

Relative Standardabweichung, berechnet aus unter Wiederholbarkeitsbedingungen ermittelten Ergebnissen [(s_r / ) × 100].

R=

Reproduzierbarkeit: der Wert, unterhalb dessen man die absolute Differenz zwischen einzelnen Prüfergebnissen, die unter Reproduzierbarkeitsbedingungen (d. h. an identischem Material von Prüfern in verschiedenen Labors nach dem standardisierten Testverfahren) erzielt werden, mit einer vorgegebenen Wahrscheinlichkeit (in der Regel 95 %) erwarten darf, so dass R = 2,8 × s_R.

s_R=

Standardabweichung, berechnet aus unter Reproduzierbarkeitsbedingungen ermittelten Ergebnissen.

RSD_R=

Relative Standardabweichung, berechnet aus unter Reproduzierbarkeitsbedingungen ermittelten Ergebnissen [(s_R / ) × 100].

4.2.

Allgemeine Vorschriften

Die für Lebensmittelkontrollzwecke angewandten analytischen Bestätigungsmethoden müssen den Vorschriften von Anhang III Nummern 1 und 2 der Verordnung (EG) Nr. 882/2004 genügen.

4.3.

Spezifische Anforderungen

4.3.1.

Spezifische Anforderungen an Bestätigungsmethoden

4.3.1.1.

Leistungskriterien

Es wird empfohlen, vollständig validierte Bestätigungsmethoden (d. h. Methoden, die durch Ringversuche für die betreffenden Matrizes validiert wurden) anzuwenden, soweit zweckdienlich und vorhanden. Andere geeignete validierte Bestätigungsmethoden (d. h. Methoden, die intern für relevante Matrizes der fraglichen Warengruppe validiert wurden) können ebenfalls angewandt werden, sofern sie die in den nachstehenden Tabellen angegebenen Leistungskriterien erfüllen. Soweit möglich ist bei intern validierten Methoden zertifiziertes Referenzmaterial für die Validierung zu verwenden.

a)

Leistungskriterien für die Bestimmung von Aflatoxinen

Hinweis:

—

Die Werte gelten sowohl für B₁ als auch für die Summe von B₁ + B₂ + G₁ + G₂.

—

Ist die Summe der einzelnen Aflatoxine B₁ + B₂ + G₁ + G₂ zu bestimmen, so muss das Ansprechen der einzelnen Stoffe auf das Analysesystem entweder bekannt oder äquivalent sein.

Kriterium	Konzentrationsbereich	Empfohlener Wert	Höchster zulässiger Wert
Blindwerte	Alle	Vernachlässigbar	—
Wiederfindungsrate — Aflatoxin M1	0,01-0,05 μg/kg	60 bis 120 %
	> 0,05 μg/kg	70 bis 110 %
Wiederfindungsrate — Aflatoxine B1, B2, G1, G2	< 1,0 μg/kg	50 bis 120 %
	1-10 μg/kg	70 bis 110 %
	> 10 μg/kg	80 bis 110 %
Reproduzierbarkeit (RSDR)	Alle	Gemäß der Horwitz-Gleichung (*)(**)	2 × der nach der Horwitz-Gleichung erzielte Wert (*)(**)
Die Wiederholbarkeit RSDr kann durch Multiplikation der Reproduzierbarkeit RSDR mit 0,66 bei der betreffenden Konzentration berechnet werden.

b)

Leistungskriterien für die Bestimmung von Ochratoxin A

Konzentration μg/kg	Ochratoxin A
	RSDr %	RSDR %	Wiederfindungsrate %
< 1	≤ 40	≤ 60	50 bis 120
≥ 1	≤ 20	≤ 30	70 bis 110

c)

Leistungskriterien für die Bestimmung von Patulin

Konzentration μg/kg	Patulin
	RSDr %	RSDR %	Wiederfindungsrate %
< 20	≤ 30	≤ 40	50 bis 120
20-50	≤ 20	≤ 30	70 bis 105
> 50	≤ 15	≤ 25	75 bis 105

d)

Leistungskriterien für die Bestimmung von Desoxynivalenol

Konzentration μg/kg	Desoxynivalenol
	RSDr %	RSDR %	Wiederfindungsrate %
> 100 - ≤ 500	≤ 20	≤ 40	60 bis 110
> 500	≤ 20	≤ 40	70 bis 120

e)

Leistungskriterien für die Bestimmung von Zearalenon

Konzentration μg/kg	Zearalenon
	RSDr %	RSDR %	Wiederfindungsrate %
≤ 50	≤ 40	≤ 50	60 bis 120
> 50	≤ 25	≤ 40	70 bis 120

f)

Leistungskriterien für die Bestimmung von Fumonisin B₁ und B₂ (getrennt)

Konzentration μg/kg	Fumonisin B1 und B2 (getrennt)
	RSDr %	RSDR %	Wiederfindungsrate %
≤ 500	≤ 30	≤ 60	60 bis 120
> 500	≤ 20	≤ 30	70 bis 110

g)

Leistungskriterien für die Bestimmung von T-2-Toxin und HT-2-Toxin (getrennt)

Konzentration μg/kg	T-2-Toxin und HT-2-Toxin (getrennt)
	RSDr %	RSDR %	Wiederfindungsrate %
15-250	≤ 30	≤ 50	60 bis 130
> 250	≤ 25	≤ 40	60 bis 130

h)

Leistungskriterien für die Bestimmung von Citrinin

Konzentration μg/kg	Citrinin
	RSDr %	Empfohlene RSDR %	Höchste zulässige RSDR %	Wiederfindungsrate %
Alle	0,66 × RSDR	Gemäß der Horwitz-Gleichung (*)(**)	2 × der nach der Horwitz-Gleichung erzielte Wert (*)(**)	70 bis 120

i)

Hinweise zu den Leistungskriterien für die Bestimmung der Mykotoxine

—

Die Nachweisgrenzen der angewandten Analyseverfahren werden nicht angegeben, da die Präzisionswerte bei den betreffenden Konzentrationen angegeben sind.

—

Die Präzisionswerte werden gemäß der Horwitz-Gleichung berechnet, d. h. gemäß der ursprünglichen Horwitz-Gleichung (für Konzentrationen 1,2 × 10^–7 ≤ C ≤ 0,138) (*) und der geänderten Horwitz-Gleichung (für Konzentrationen C < 1,2 × 10^–7) (**).

(*)

Horwitz-Gleichung für Konzentrationen 1,2 × 10^–7 ≤ C ≤ 0,138:

RSD_R = 2^(1-0.5logC)

(Siehe W. Horwitz, L.R. Kamps, K.W. Boyer, J.Assoc.Off.Analy.Chem.,1980, 63, 1344)

(**)

Geänderte Horwitz-Gleichung (*) für Konzentrationen C < 1,2 × 10^–7:

RSD_R = 22 %

(Siehe M. Thompson, Analyst, 2000,125, S. 385-386)

wobei

—

RSD_R die relative Standardabweichung ist, berechnet aus unter Reproduzierbarkeitsbedingungen [(sR/) × 100] ermittelten Ergebnissen;

—

C das Konzentrationsverhältnis (d. h. 1 = 100g/100g, 0,001 = 1000 mg/kg) ist.

Dies ist eine verallgemeinerte Präzisionsgleichung, die sich für die meisten Routineanalysemethoden als unabhängig von Analyt und Matrix und lediglich von der Konzentration abhängig erwiesen hat.

4.3.1.2.

Der „Tauglichkeits” -Ansatz

Im Falle intern validierter Methoden kann zur Beurteilung der Eignung dieser Methoden für die amtliche Kontrolle alternativ ein „Tauglichkeits” -Ansatz⁽¹⁾ herangezogen werden. Für die amtliche Kontrolle taugliche Methoden müssen Ergebnisse bringen, bei denen die Standardmessunsicherheit (u) unter der anhand nachstehender Formel berechneten maximalen Standardmessunsicherheit liegt:UfLOD/22αC2 wobei

—

Uf die maximale Standardmessunsicherheit (μg/kg),

—

LOD die Nachweisgrenze der Methode (μg/kg),

—

α ein konstanter numerischer Faktor, der abhängig von der Konzentration C zu verwenden ist; die zu verwendenden Werte sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt,

—

C die betreffende Konzentration (μg/kg) ist.

Liefert die Analysemethode Ergebnisse mit einer Messunsicherheit, die unter der maximalen Standardunsicherheit liegt, gilt die Methode als gleichermaßen geeignet wie eine Methode, die die Leistungskriterien unter Nummer 4.3.1.1 erfüllt.

Tabelle

Numerische Werte, die für α als Konstante in der unter dieser Nummer aufgeführten Formel abhängig von der jeweiligen Konzentration zu verwenden sind

C (μg/kg)	α
≤ 50	0,2
51-500	0,18
501-1000	0,15
1001-10000	0,12
> 10000	0,1

4.3.2.

Spezifische Anforderungen an semiquantitative Screening-Methoden

4.3.2.1.

Geltungsbereich

Der Geltungsbereich umfasst bioanalytische Methoden, die auf Immunerkennung oder Rezeptorenbindung basieren (z. B. ELISA, Peilstäbe, Seitenstrom-Vorrichtungen, Immunsensoren) und physikalisch-chemische Methoden, die auf Chromatographie oder dem direkten Nachweis durch Massenspektrometrie (z. B. umweltanalytische Massenspektrometrie) basieren. Andere Methoden (z. B. Dünnschichtchromatographie) werden nicht ausgeschlossen, sofern sich die erzeugten Signale unmittelbar auf die betreffenden Mykotoxine beziehen und die Anwendung des hier beschriebenen Prinzips gestatten. Die spezifischen Anforderungen gelten für Methoden, bei denen das Messergebnis ein numerischer Wert ist, beispielsweise eine (relative) Response einer Peilstab-Ablesevorrichtung oder ein Signal bei der Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung, und für die normale Statistikregeln gelten. Die Anforderungen gelten nicht für Methoden, bei denen das Ergebnis kein numerischer Wert ist (z. B. nur eine Linie, die angezeigt wird oder fehlt), da diese andere Validierungsansätze erfordern. Die spezifischen Anforderungen an solche Methoden sind unter Nummer 4.3.3 dargelegt. Das vorliegende Dokument beschreibt Verfahren zur Validierung von Screening-Methoden mittels einer laborübergreifenden Validierung, die Überprüfung der Leistung einer durch eine laborübergreifende Validierung validierten Methode sowie die Validierung einer Screening-Methode durch ein Einzellabor.

4.3.2.2.

Terminologie

„Screening-Zielkonzentration (SZK)” bezeichnet die betreffende Konzentration für den Nachweis des Mykotoxins in einer Probe. Wenn die Einhaltung der vorgeschriebenen Grenzwerte überprüft werden soll, entspricht die SZK dem geltenden Höchstgehalt. Für andere Zwecke oder wenn kein Höchstgehalt festgelegt ist, wird die SZK vom Labor vorgegeben. „Screening-Methode” bezeichnet die Methode zur Auswahl der Proben mit Mykotoxingehalten, welche die SZK mit einer bestimmten Sicherheit übersteigen. Für ein Mykotoxin-Screening wird eine Sicherheit von 95 % als zweckdienlich erachtet. Das Ergebnis der Screening-Analyse ist entweder „negativ” oder „verdächtig” . Screening-Methoden ermöglichen kostengünstig einen hohen Probendurchsatz, wodurch größere Chancen bestehen, neue Fälle mit hoher Exposition und Gesundheitsrisiken für die Verbraucher erkennen. Diese Methoden basieren auf bioanalytischen Verfahren, LC-MS- oder HPLC-Verfahren. Die Ergebnisse der Proben, die den Cut-off-Wert übersteigen, werden anhand einer erneuten vollständigen Analyse der ursprünglichen Probe überprüft, wobei eine Bestätigungsmethode anzuwenden ist. „Negative Probe” bezeichnet eine Probe, deren Mykotoxingehalt mit einer Sicherheit von 95 % unter der SZK liegt (d. h., es besteht eine Wahrscheinlichkeit von 5 %, dass Proben fälschlicherweise als negativ erfasst werden). „Falsch negative Probe” bezeichnet eine Probe, deren Mykotoxingehalt über der SZK liegt, die jedoch als negativ erfasst wurde. „Verdächtige Probe” (Screening positiv) bezeichnet eine Probe, die den Cut-off-Wert (siehe unten) übersteigt und einen Mykotoxingehalt aufweisen kann, der über der SZK liegt. Jedes verdächtige Ergebnis zieht eine Bestätigungsanalyse zur eindeutigen Identifizierung und Quantifizierung des Mykotoxins nach sich. „Falsch verdächtige Probe” bezeichnet eine negative Probe, die jedoch als verdächtig erfasst wurde. „Bestätigungsmethode” bezeichnet eine Methode, die vollständige oder ergänzende Informationen liefert, um das Mykotoxin eindeutig zu identifizieren und in der fraglichen Konzentration zu quantifizieren. „Cut-off-Wert” bezeichnet den durch die Screening-Methode erzeugten Wert (d. h. Ansprechen, Signal oder Konzentration), oberhalb dessen die Probe als „verdächtig” eingestuft wird. Der Cut-off-Wert wird bei der Validierung festgelegt und berücksichtigt die Variabilität der Messung. „Negative Kontrollprobe (Matrixleerprobe)” bezeichnet eine Probe, die bekanntermaßen das beim Screening zu untersuchende Mykotoxin nicht enthält⁽²⁾ (z. B. nachgewiesen durch eine vorherige Bestimmung anhand einer Bestätigungsmethode mit ausreichender Sensitivität). Können keine Leerproben gewonnen werden, so könnte unter Umständen das Material mit dem niedrigsten gegebenen Gehalt verwendet werden, sofern dieser Gehalt den Schluss zulässt, dass die Screening-Methode tauglich ist. „Positive Kontrollprobe” bezeichnet eine Probe, deren Mykotoxingehalt der Screening-Zielkonzentration entspricht, z. B. ein zertifiziertes Referenzmaterial, ein Material mit bekanntem Gehalt (etwa das Testmaterial für Leistungstests) oder ein anderweitig durch eine Bestätigungsmethode ausreichend charakterisiertes Material. Fehlt eine der oben aufgeführten Proben, so kann ein Gemisch aus Proben mit unterschiedlichem Kontaminierungsgrad oder eine im Labor hergestellte und ausreichend charakterisierte dotierte Probe verwendet werden, sofern der Kontaminierungsgrad nachweislich überprüft wurde.

4.3.2.3.

Validierungsverfahren

Ziel der Validierung ist es, die Tauglichkeit der Screening-Methode nachzuweisen. Dies geschieht durch die Bestimmung des Cut-off-Werts sowie die Festlegung der Quote der falsch negativen Proben und der falsch verdächtigen Proben. In diesen beiden Parametern sind Leistungsmerkmale wie Sensitivität, Selektivität und Präzision enthalten. Die Validierung von Screening-Methoden kann laborübergreifend oder durch ein Einzellabor erfolgen. Liegen für eine bestimmte Mykotoxin/Matrix/SZK-Kombination bereits Daten einer laborübergreifenden Validierung vor, so ist eine Überprüfung der Leistungsfähigkeit der Methode in einem Labor ausreichend, indem es die Methode anwendet. Mykotoxine Die Validierung muss für jedes einzelne Mykotoxin erfolgen, das in den Geltungsbereich fällt. Für bioanalytische Methoden, deren Ergebnis eine kombinierte Response für eine bestimmte Mykotoxingruppe (z. B Aflatoxine B₁, B₂, G₁ und G₂; Fumonisine B₁ und B₂) ist, muss die Anwendbarkeit nachgewiesen werden, und die Grenzen der Untersuchung sind im Anwendungsbereich der Methode darzulegen. Bei einer unerwünschten Kreuzreaktivität (z. B. DON-3-Glycosid, 3- oder 15-Acetyl-DON bei immunbasierten Methoden für DON) wird davon ausgegangen, dass hinsichtlich der Zielmykotoxine die Quote der falsch negativen Proben nicht erhöht wird, möglicherweise aber die Quote der falsch verdächtigen Proben. Dieser ungewollte Anstieg wird durch die Bestätigungsanalyse zur eindeutigen Identifizierung und Quantifizierung der Mykotoxine verringert. Matrizes Eine Erstvalidierung sollte für jede Ware oder — wenn die Methode bekanntermaßen für mehrere Waren anwendbar ist — für jede Warengruppe erfolgen. In letzterem Fall ist eine repräsentative und relevante Ware aus der Gruppe auszuwählen (siehe Tabelle A). Probensatz Die für die Validierung erforderliche Mindestzahl an verschiedenen Proben beträgt 20 homogene negative Kontrollproben und 20 homogene positive Kontrollproben, die einen Mykotoxingehalt in Höhe der SZK aufweisen; die Analyse muss unter RSD_Ri-Bedingungen an fünf separaten Tagen erfolgen. Fakultativ können zur Validierung weitere Sätze mit 20 Proben, die andere Gehalte des Mykotoxins aufweisen, herangezogen werden, um zu prüfen, inwieweit die Methode Unterschiede zwischen verschiedenen Mykotoxinkonzentrationen aufzeigen kann. Konzentration Für jede zur Routine-Anwendung vorgesehene SZK muss eine Validierung vorgenommen werden. Die Validierung durch Ringversuche erfolgt nach einem international anerkannten Protokoll für Ringversuche (z. B. ISO 5725:1994 oder IUPAC International Harmonised Protocol), das die Berücksichtigung gültiger Daten aus mindestens acht verschiedenen Labors vorschreibt. Abgesehen hiervon besteht der einzige Unterschied zur Validierung durch ein Einzellabor darin, dass die ≥ 20 Proben je Ware/Gehalt gleichmäßig auf die teilnehmenden Labors verteilt werden können, wobei auf jedes Labor mindestens zwei Proben entfallen.

4.3.2.4.

Bestimmung des Cut-off-Werts und der Quote falsch verdächtiger Ergebnisse bei Leerproben

Die (relativen) Responses bei den negativen und den positiven Kontrollproben dienen als Grundlage für die Berechnung der erforderlichen Parameter. Screening-Methoden, deren Response proportional zur Mykotoxinkonzentration ist Für Screening-Methoden, deren Response proportional zur Mykotoxinkonzentration ist, gilt Folgendes: Cut-off = R_STC — t-Wert_0,05 *SD_STC

R_STC =

mittlere Response der positiven Kontrollproben (bei SZK)

t-Wert:

einseitiger t-Wert für eine Quote falsch negativer Ergebnisse von 5 % (siehe Tabelle B)

SD_STC =

Standardabweichung

Screening-Methoden, deren Response umgekehrt proportional zur Mykotoxinkonzentration ist In ähnlicher Weise wird für Screening-Methoden, deren Response umgekehrt proportional zur Mykotoxinkonzentration ist, der Cut-off-Wert wie folgt bestimmt: Cut-off = R_STC + t-Wert_0,05 *SD_STC Durch die Verwendung dieses spezifischen t-Werts zur Bestimmung des Cut-off-Werts wird die Quote falsch negativer Ergebnisse standardmäßig auf 5 % festgelegt. Bewertung der Tauglichkeit Die Ergebnisse der negativen Kontrollproben werden zur Schätzung der entsprechenden Quote falsch verdächtiger Ergebnisse verwendet. Der t-Wert wird entsprechend dem Fall berechnet, dass ein Ergebnis einer negativen Kontrollprobe über dem Cut-off-Wert liegt und somit fälschlicherweise als verdächtig eingestuft wird.

t-Wert=

(Cut-off — Mittelwert_leer)/SD_leer

für Screening-Methoden, deren Response proportional zur Mykotoxinkonzentration ist, oder

t-Wert=

(Mittelwert_leer — Cut-off)/SD_leer

für Screening-Methoden, deren Response umgekehrt proportional zur Mykotoxinkonzentration ist. Anhand des erzielten t-Werts, basierend auf den aus der Anzahl der Versuche errechneten Freiheitsgraden, kann die Wahrscheinlichkeit falsch verdächtiger Proben bei einer einseitigen Verteilung entweder berechnet (z. B. mittels der Tabellenkalkulationsfunktion „TDIST” ) oder einer Tabelle zur t-Verteilung entnommen werden. Der entsprechende Wert der einseitigen t-Verteilung bestimmt die Quote falsch verdächtiger Ergebnisse. Eine detaillierte Beschreibung dieses Konzepts einschließlich eines Beispiels findet sich in Analytical and Bioanalytical Chemistry DOI 10.1007/s00216 -013-6922-1.

4.3.2.5.

Erweiterung des Anwendungsbereichs der Methode

Werden neue Mykotoxine in den Anwendungsbereich einer bestehenden Screening-Methode aufgenommen, so ist eine vollständige Validierung zum Nachweis der Eignung der Methode vorzunehmen. Kann die Screening-Methode bekanntermaßen oder aller Voraussicht nach bei anderen Waren angewandt werden, so ist die Gültigkeit für diese anderen Waren zu überprüfen. Gehört die neue Ware einer Warengruppe (siehe Tabelle A) an, für die bereits eine Erstvalidierung durchgeführt wurde, so ist eine eingeschränkte Zusatzvalidierung ausreichend. Hierfür sind mindestens 10 homogene negative Kontrollproben und 10 homogene positive (bei SZK) Kontrollproben unter Laborpräzisionsbedingungen zu analysieren. Alle positiven Kontrollproben müssen über dem Cut-off-Wert liegen. Wird dieses Kriterium nicht erfüllt, ist eine vollständige Validierung durchzuführen.

4.3.2.6.

Überprüfung von Methoden, die bereits durch Ringversuche validiert wurden

Bei Screening-Methoden, die bereits durch einen Ringversuch erfolgreich validiert wurden, muss die Leistungsfähigkeit der Methode überprüft werden. Hierfür sind mindestens 6 negative Kontrollproben und 6 positive (bei SZK) Kontrollproben zu analysieren. Alle positiven Kontrollproben müssen über dem Cut-off-Wert liegen. Wird dieses Kriterium nicht erfüllt, so ist vom Labor eine Ursachenanalyse vorzunehmen, um festzustellen, weshalb es die aus dem Ringversuch resultierende Spezifikation nicht einhalten kann. Erst nach Durchführung korrektiver Maßnahmen nimmt das Labor eine erneute Überprüfung der Leistungsfähigkeit der Methode in seinen Räumlichkeiten vor. Ist das Labor nicht in der Lage, die Ergebnisse des Ringversuchs zu überprüfen, muss es seinen eigenen Cut-off-Wert durch eine vollständige Einzellabor-Validierung festlegen.

4.3.2.7.

Kontinuierliche Methodenüberprüfung/laufende Methodenvalidierung

Nach der Erstvalidierung werden zusätzliche Validierungsdaten von mindestens zwei positiven Kontrollproben aus jeder Charge gescreenter Proben erfasst. Bei einer positiven Kontrollprobe handelt es sich um eine bekannte Probe (z. B. eine für die Erstvalidierung verwendete Probe), bei der zweiten um eine andere Ware derselben Warengruppe (falls nur eine Ware analysiert wird, ist statt dessen eine andere Probe derselben Ware zu verwenden). Fakultativ kann eine negative Kontrollprobe in die Analyse mit einbezogen werden. Die Ergebnisse der beiden positiven Kontrollproben werden dem bereits vorhandenen Validierungssatz hinzugefügt. Mindestens einmal jährlich ist der Cut-off-Wert neu festzulegen und die Gültigkeit der Methode neu zu bewerten. Mit der kontinuierlichen Überprüfung der Methode werden mehrere Ziele verfolgt:

—

Qualitätskontrolle für die Charge der gescreenten Proben;

—

Erfassung von Daten über die Robustheit der Methode unter den Bedingungen, die in dem Labor herrschen, das die Methode anwendet;

—

Rechtfertigung der Anwendbarkeit der Methode bei verschiedenen Waren;

—

mögliche Anpassung der Cut-off-Werte, falls im Lauf der Zeit allmählich Abweichungen auftreten.

4.3.2.8.

Validierungsbericht

Der Validierungsbericht muss Folgendes enthalten:

—

eine Erklärung zur SZK

—

eine Erklärung zum erzielten Cut-off-Wert

Hinweis: Der Cut-off-Wert muss dieselbe Anzahl an signifikanten Ziffern aufweisen wie die SZK. Zur Berechnung des Cut-off-Werts verwendete numerische Werte müssen mindestens eine signifikante Ziffer mehr aufweisen als die SZK.

—

Eine Erklärung zur berechneten Quote falsch verdächtiger Proben

—

Eine Erklärung dazu, wie die Quote falsch verdächtiger Proben generiert wurde

Hinweis: Aus der Erklärung zur berechneten Quote falsch verdächtiger Proben geht hervor, ob die Methode tauglich ist, da sie eine Angabe zur Anzahl der Leerproben (oder Proben mit geringem Kontaminationsgehalt), die überprüft werden, enthält.

Tabelle A

Warengruppen für die Validierung von Screening-Methoden

Warengruppen	Warenkategorien	Typische repräsentative Waren für die Kategorie
Hoher Wassergehalt	Fruchtsäfte	Apfelsaft, Traubensaft
	Alkoholische Getränke	Wein, Bier, Obstwein
	Wurzel- und Knollengemüse	Frischer Ingwer
	Pürees auf Getreide- oder Obstbasis	Breie für Säuglinge und Kleinkinder
Hoher Ölgehalt	Schalenfrüchte	Walnüsse, Haselnüsse, Esskastanien
	Ölsaaten und Erzeugnisse daraus	Ölraps, Sonnenblumen, Baumwollsaat, Sojabohnen, Erdnüsse, Sesam usw.
	Ölfrüchte und Erzeugnisse daraus	Öle und Pasten (z. B Erdnussbutter, Tahina)
Hoher Stärke- und/oder Eiweißgehalt und geringer Wasser- und Fettgehalt	Getreidekorn und Erzeugnisse daraus	Weizen, Roggen, Gerste, Mais, Reis, Hafervollkornbrot, Weißbrot, Cracker, Frühstückszerealien, Teigwaren
	Diätetische Erzeugnisse	Trockenpulver für die Zubereitung von Nahrung für Säuglinge und Kleinkinder
Hoher Säuregehalt und hoher Wassergehalt(*)	Zitrusfrüchteerzeugnisse
„Schwierige oder einzigartige Waren” (**)		Kakaobohnen und Erzeugnisse daraus, Kopra und Erzeugnisse daraus Kaffee, Tee Gewürze, Süßholz
Hoher Zuckergehalt und geringer Wassergehalt	Trockenfrüchte	Feigen, Rosinen, Korinthen, Sultaninen
Milch und Milcherzeugnisse	Milch	Kuh-, Ziegen- und Büffelmilch
	Käse	Kuh- und Ziegenkäse
	Molkereiprodukte (z. B. Milchpulver)	Joghurt, Rahm

Tabelle B

Einseitiger t-Wert für eine Quote falsch negativer Ergebnisse von 5 %

Freiheitsgrade	Anzahl der Parallelproben	t-Wert (5 %)
10	11	1,812
11	12	1,796
12	13	1,782
13	14	1,771
14	15	1,761
15	16	1,753
16	17	1,746
17	18	1,74
18	19	1,734
19	20	1,729
20	21	1,725
21	22	1,721
22	23	1,717
23	24	1,714
24	25	1,711
25	26	1,708
26	27	1,706
27	28	1,703
28	29	1,701
29	30	1,699
30	31	1,697
40	41	1,684
60	61	1,671
120	121	1,658
∞	∞	1,645

4.3.3.

Anforderungen an qualitative Screening-Methoden (Methoden, bei denen das Ergebnis kein numerischer Wert ist)

Leitlinien für die Validierung binärer Prüfmethoden werden derzeit in verschiedenen Normungsgremien (z. B. AOAC, ISO) entwickelt. Die AOAC hat erst vor kurzem eine Leitlinie zu dieser Thematik erstellt. Es kann davon ausgegangen werden, dass das Dokument den aktuellen Stand auf diesem Gebiet wiedergibt. Daher sollten Methoden, bei denen binäre Ergebnisse erzielt werden (z. B. Sichtprüfung bei Peilstabtests), nach dieser Richtlinie validiert werden. http://www.aoac.org/imis15_prod/AOAC_Docs/ISPAM/Qual_Chem_Guideline_Final_Approved_031412.pdf

4.4.

Schätzung der Messunsicherheit, Berechnung der Wiederfindungsrate und Angabe der Ergebnisse⁽³⁾

4.4.1.

Bestätigungsmethoden

Das Analyseergebnis ist wie folgt festzuhalten:

a)

Berichtigung um die Wiederfindungsrate, wobei diese anzugeben ist. Eine Berichtigung um die Wiederfindungsrate ist nicht erforderlich, wenn letztere 90-110 % beträgt;

b)

als „x +/- U” , wobei x das Analyseergebnis und U die erweiterte Messunsicherheit bezeichnet und ein Faktor von 2 verwendet wird, der zu einem Konfidenzniveau von ca. 95 % führt.

Bei Lebensmitteln tierischen Ursprungs kann die Messunsicherheit auch durch die Festlegung der Entscheidungsgrenze (CCα) gemäß der Entscheidung 2002/657/EG der Kommission⁽⁴⁾ (Nummer 3.1.2.5 des Anhangs I — der Fall von Stoffen mit einem festgelegten zulässigen Grenzwert) berücksichtigt werden. Liegt jedoch das Analyseergebnis deutlich (> 50 %) unter dem Höchstgehalt oder erheblich über dem Höchstgehalt (d. h. mehr als das Fünffache des Höchstgehalts) — und unter der Bedingung, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden und die Analyse lediglich dem Zweck der Überprüfung der Einhaltung der Rechtsvorschriften dient —, kann das Analyseergebnis ohne Berichtigung um die Wiederfindungsrate angegeben werden, und die Angabe der Wiederfindungsrate und der Messunsicherheit kann in diesen Fällen entfallen. Diese Interpretationsregeln für das Analyseergebnis hinsichtlich Akzeptanz oder Zurückweisung der Partie gelten für das Analyseergebnis bei der für die amtliche Kontrolle entnommenen Probe. Im Falle einer Analyse zu Verteidigungs- oder Schiedszwecken gelten die nationalen Bestimmungen.

4.4.2.

Screening-Methoden

Das Ergebnis des Screenings ist anzugeben als „konform” oder „vermutlich nicht konform” . „Vermutlich nicht konform” bedeutet, dass die Probe den Cut-off-Wert übersteigt und einen Mykotoxingehalt aufweisen kann, der über der SZK liegt. Jedes verdächtige Ergebnis zieht eine Bestätigungsanalyse zur eindeutigen Identifizierung und Quantifizierung des Mykotoxins nach sich. „Konform” bedeutet, dass der Mykotoxingehalt der Probe mit einer Sicherheit von 95 % unter der SZK liegt (d. h., es besteht eine Wahrscheinlichkeit von 5 %, dass Proben fälschlicherweise als negativ erfasst werden). Das Analyseergebnis wird angegeben als „< SZK” , wobei die SZK zu benennen ist.

4.5.

Laborqualitätsnormen

Das Labor muss die Bestimmungen von Artikel 12 der Verordnung (EG) Nr. 882/2004 über amtliche Kontrollen zur Überprüfung der Einhaltung des Lebensmittel- und Futtermittelrechts sowie der Bestimmungen über Tiergesundheit und Tierschutz erfüllen⁽⁵⁾.