Anlage 3 VO (EG) 2009/761

Für L. minor und L. gibba werden unterschiedliche Nährmedien empfohlen. Für L. minor sollte ein modifiziertes schwedisches Standardmedium (SIS) verwendet werden; für L. gibba ist das Medium 20X AAP zu empfehlen. Die Zusammensetzungen beider Medien werden im Folgenden beschrieben. Bei der Herstellung dieser Medien sollten chemische Stoffe in Reagenzien- oder Analysequalität und entionisiertes Wasser verwendet werden.

Schwedisches Standard-Lemna-Nährmedium (SIS)

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Die Stammlösungen I-V werden durch Autoklavieren (120 °C, 15 Minuten) oder durch Membranfiltration (Porengröße ca. 0,2 μm) sterilisiert.

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Die Stammlösung VI (sowie optional Stammlösung VII) ist ausschließlich durch Membranfiltration zu sterilisieren; diese Lösungen sollten nicht autoklaviert werden.

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Sterile Stammlösungen sollten kühl und dunkel gelagert werden. Die Stammlösungen I-V sollten nach sechs Monaten entsorgt werden; die Stammlösung VI (sowie optional Stammlösung VII) kann einen Monat gelagert werden.

Stammlösung Nr.	Substanz	Konzentration in der Stammlösung (g·l–1)	Konzentration im hergestellten Medium (mg·l–1)	Hergestelltes Medium
				Element	Konzentration (mg·l–1)
I	NaNO3 KH2PO4	8,50 1,34	85 13,4	Na; N K; P	32; 14 6,0; 2,4
II	MgSO4 · 7H2O	15	75	Mg; S	7,4; 9,8
III	CaCl2 · 2H2O	7,2	36	Ca; Cl	9,8; 17,5
IV	Na2CO3	4,0	20	C	2,3
V	H3BO3 MnCl2 · 4H2O Na2MoO4 · 2H2O ZnSO4 · 7H2O CuSO4 · 5H2O Co(NO3)2 · 6H2O	1,0 0,20 0,010 0,050 0,0050 0,010	1,00 0,20 0,010 0,050 0,0050 0,010	B Mn Mo Zn Cu Co	0,17 0,056 0,0040 0,011 0,0013 0,0020
VI	FeCl3 · 6H2O Na2-EDTA·2H2O	0,17 0,28	0,84 1,4	Fe —	0,17 —
VII	MOPS (Puffer)	490	490	—	—

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Um einen Liter SIS-Medium herzustellen, werden die folgenden Inhaltsstoffe zu 900 ml entionisiertem Wasser hinzugegeben:

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10 ml Stammlösung I

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5 ml Stammlösung II

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5 ml Stammlösung III

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5 ml Stammlösung IV

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1 ml Stammlösung V

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5 ml Stammlösung VI

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1 ml Stammlösung VII (optional)

Hinweis: Bei bestimmten Prüfsubstanzen kann eine weitere Stammlösung VII (MOPS-Pufferlösung) erforderlich sein (siehe Abschnitt 1.4 letzter Absatz).

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Der pH-Wert wird wahlweise mit 0,1 oder 1 mol HCl oder NaOH auf 6,5 ± 0,2 eingestellt; durch Hinzugabe von entionisiertem Wasser wird ein Volumen von einem Liter hergestellt.

Nährmedium 20X AAP

Die Stammlösungen werden in sterilem destilliertem oder entionisiertem Wasser hergestellt. Sterile Stammlösungen sollten kühl und dunkel gelagert werden. Unter diesen Bedingungen beträgt die Lagerfähigkeit der Stammlösungen mindestens 6-8 Wochen. Für das Medium 20X AAP werden fünf Stamm-Nährlösungen (A1, A2, A3, B und C) hergestellt; dabei sind chemische Stoffe mit Reagenzienqualität zu verwenden. Jeweils 20 ml der Stamm-Nährlösungen werden zu etwa 850 ml entionisiertem Wasser hinzugegeben, um das Nährmedium herzustellen. Der pH-Wert wird wahlweise mit 0,1 oder 1 mol HCl oder NaOH auf 7,5 ± 0,1 eingestellt; durch Hinzugabe von entionisiertem Wasser wird ein Volumen von einem Liter hergestellt. Anschließend wird das Medium durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von (etwa) 0,2 μm in einen sterilen Behälter gefiltert. Das für die Prüfung vorgesehene Nährmedium sollte 1-2 Tage vor der Verwendung hergestellt werden, damit sich der pH-Wert stabilisieren kann. Der pH-Wert des Nährmediums sollte vor der Verwendung geprüft und ggf. durch Zugabe von 0,1 oder 1 M NaOH oder HCl wie oben beschrieben korrigiert werden.

Stammlösung Nr.	Substanz	Konzentration in der Stammlösung (g·l–1)(*)	Konzentration im hergestellten Medium (mg·l–1)(*)	Hergestelltes Medium
				Element	Konzentration (mg·l–1)(*)
A1	NaNO3 MgCl2·6H2O CaCl2·2H2O	26 12 4,4	510 240 90	Na; N Mg Ca	190; 84 58,08 24.04
A2	MgSO4·7H2O	15	290	S	38,22
A3	K2HPO4·3H2O	1,4	30	K; P	9,4;3,7
B	H3BO3 MnCl2·4H2O FeCl3·6H2O Na2EDTA·2H2O ZnCl2 CoCl2·6H2O Na2MoO4·2H2O CuCl2·2H2O	0,19 0,42 0,16 0,30 3,3 mg·l–1 1,4 mg·l–1 7,3 mg·l–1 0,012 mg·l–1	3,7 8,3 3,2 6,0 66 μg·l–1 29 μg·l–1 145 μg·l–1 0,24 μg·l–1	B Mn Fe — Zn Co Mo Cu	0,65 2,3 0,66 — 31 μg·l–1 7,1 μg·l–1 58 μg·l–1 0,080 μg·l–1
C	NaHCO3	15	300	Na; C	220; 43

Fußnote: Die theoretisch geeignete Bicarbonat-Endkonzentration (bei der eine nennenswerte Anpassung des pH-Werts nicht erforderlich ist) liegt bei 15 mg/l (und nicht bei 300 mg/l). Trotzdem wird das Medium 20X-AAP — auch im Ringtest dieser Methode — in einer Konzentration von 300 mg/l verwendet. (I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.

STEINBERG-Medium (nach ISO 20079)

Konzentrationen und Stammlösungen

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Das modifizierte Steinberg-Medium ist in ISO 20079 nur für Lemnaminor vorgesehen (da dort ausschließlich Lemnaminor zugelassen wird); in Tests wurden gute Ergebnisse aber auch mit Lemnagibba erzielt.

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Bei der Herstellung des Mediums sollten chemische Stoffe in Reagenzien- oder Analysequalität und entionisiertes Wasser verwendet werden.

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Das Nährmedium ist aus Stammlösungen oder aus dem 10fach konzentrierten Medium herzustellen, damit ohne Ausfällungen eine größtmögliche Konzentration des Mediums erzielt werden kann.

Tabelle 1

STEINBERG-Medium mit stabilisiertem pH-Wert (modifiziert nach Altenburger)

Substanz		Nährmedium
Makroelemente	Molmasse	mg/l	mmol/l
KNO3	101,12	350,00	3,46
Ca(NO3)2 · 4H2O	236,15	295,00	1,25
KH2PO4	136,09	90,00	0,66
K2HPO4	174,18	12,60	0,072
MgSO4 · 7H2O	246,37	100,00	0,41
Mikroelemente	Molmasse	µg/l	µmol/l
H3BO3	61,83	120,00	1,94
ZnSO4 · 7H2O	287,43	180,00	0,63
Na2MoO4 · 2H2O	241,92	44,00	0,18
MnCl2 · 4H2O	197,84	180,00	0,91
FeCl3 · 6H2O	270,21	760,00	2,81
EDTA-Dinatrium-Dihydrat	372,24	1500,00	4,03

Tabelle 2

Stammlösungen (Makroelemente)

Stammlösung 1:Stammlösung 2:Stammlösung 3:

1. Makroelemente (50fach konzentriert)	g/l
KNO3	17,50
KH2PO4	4,5
K2HPO4	0,63
MgSO4 · 7H2O	5,00
Ca(NO3)2 · 4H2O	14,75

Tabelle 3

Stammlösungen (Mikroelemente)

Stammlösung 4:Stammlösung 5:Stammlösung 6:Stammlösung 7:Stammlösung 8:

2. Mikroelemente (1000fach konzentriert)	mg/l
H3BO3	120,0
ZnSO4 · 7H2O	180,0
Na2MoO4 · 2H2O	44,0
MnCl2 · 4H2O	180,0
FeCl3 · 6H2O	760,00
EDTA-Dinatrium-Dihydrat	1500,00

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Die Stammlösungen 2 und 3 sowie getrennt auch die Stammlösungen 4 bis 7 können zusammengefasst werden. (Dabei sind die jeweils erforderlichen Konzentrationen zu berücksichtigen.)

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Um die Lagerfähigkeit zu verlängern, sind die Stammlösungen 20 Minuten bei 121 °C zu autoklavieren oder einer Sterilfiltration (Porengröße 0,2 µm) zu unterziehen. Für die Stammlösung 8 wird eine Sterilfiltration (0,2 µm) nachdrücklich empfohlen.

Herstellung der Endkonzentration des STEINBERG-Mediums (modifiziert)

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20 ml der Stammlösungen 1, 2 und 3 (siehe Tabelle 2) sind etwa 900 ml entionisiertes Wasser zuzugeben, um eine Ausfällung zu vermeiden.

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1,0 ml der Stammlösungen 4, 5, 6, 7 und 8 werden hinzugegeben (siehe Tabelle 3).

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Der pH-Wert sollte auf 5,5 ± 0,2 eingestellt werden (durch Zugabe eines minimalen Volumens einer NaOH- oder HCl-Lösung).

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Anschließend sind die Lösungen mit Wasser auf ein Volumen von 1000 ml aufzufüllen.

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Wenn die Stammlösungen sterilisiert werden und geeignetes Wasser verwendet wird, ist eine weitere Sterilisierung nicht mehr erforderlich. Wird das endgültige Medium sterilisiert, sollte die Stammlösung 8 nach dem Autoklavieren (20 Minuten bei 121 °C) hinzugegeben werden.

Herstellung des 10fach konzentrierten STEINBERG-Mediums (modifiziert) zur Zwischenlagerung

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20 ml der Stammlösungen 1, 2 und 3 (siehe Tabelle 2) sind etwa 30 ml entionisiertes Wasser zuzugeben, um eine Ausfällung zu vermeiden.

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1,0 ml der Stammlösungen 4, 5, 6, 7 und 8 werden hinzugegeben (siehe Tabelle 3). Anschließend sind die Lösungen mit Wasser auf ein Volumen von 100 ml aufzufüllen.

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Wenn die Stammlösungen sterilisiert werden und geeignetes Wasser verwendet wird, ist eine weitere Sterilisierung nicht mehr erforderlich. Wird das endgültige Medium sterilisiert, sollte die Stammlösung 8 nach dem Autoklavieren (20 Minuten bei 121 °C) hinzugegeben werden.

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Der pH-Wert des Mediums sollte in der Endkonzentration 5,5 ± 0,2 betragen.