TEIL A

1.

Probenahme gemäß Artikel 2

Die in Artikel 2 vorgesehenen Proben bestehen aus mindestens 12 einzelnen Austern der Art Crassostrea gigas. Für die Proben sind geschwächte, offenstehende oder soeben verendete Tiere (ohne Anzeichen der Zersetzung) aus dem Kompartiment mit erhöhter Mortalität auszuwählen.

2.

Probenahme gemäß Artikel 3 Absatz 2 Buchstabe b und Artikel 5 Absatz 1 Buchstabe b und Absatz 2

a)

Probenahmen gemäß Artikel 3 Absatz 2 Buchstabe b umfassen

i)

bei Larven pro Sendung fünf Sammelproben von mindestens 50 mg ganzen Tieren, die zwischen vier und acht Tagen nach der Befruchtung gesammelt wurden, inklusive Schalen;

ii)

bei Jungmuscheln, die kleiner als 6 mm sind, pro Sendung 30 Sammelproben von 300 mg ganzen Tieren inklusive Schalen;

iii)

bei Austern, die größer als 6 mm sind, pro Sendung 150 Einzeltiere.

Es sind anteilmäßig Proben von allen Teilen der Sendung auszuwählen. Sind geschwächte, offenstehende oder soeben verendete Tiere (ohne Anzeichen der Zersetzung) vorhanden, so sind hauptsächlich solche Tiere auszuwählen.

b)

Probenahmen gemäß Artikel 5 Absatz 2 umfassen mindestens 150 Einzeltiere der Art Crassostrea gigas pro Entnahmestelle. Es sind Proben aus allen Zuchtbetrieben oder Weichtierzuchtgebieten in dem Mitgliedstaat oder Kompartiment zu nehmen, das Gegenstand des Programms ist.

Probenahmen gemäß Artikel 5 Absatz 1 Buchstabe b umfassen mindestens 150 Einzeltiere der Art Crassostrea gigas pro Kompartiment.

Bei der Auswahl dieser Tiere werden folgende Kriterien berücksichtigt:

—

Sind geschwächte, offenstehende oder soeben verendete Tiere (ohne Anzeichen der Zersetzung) vorhanden, so sind hauptsächlich solche Tiere auszuwählen. Sind keine solchen Tiere vorhanden, dann werden gesunde Austern ausgewählt, die weniger als 12 Monate alt sind.

—

Bei Probenahmen in Zuchtbetrieben, in denen mehr als eine Wasserquelle zur Produktion verwendet wird, müssen Proben von Tieren aus allen Wasserquellen genommen werden, so dass alle Teile des Zuchtbetriebs anteilmäßig vertreten sind.

—

Bei Probenahmen in Weichtierzuchtgebieten müssen Proben von Tieren an ausreichend vielen (mindestens drei) Entnahmestellen genommen werden, so dass alle Teile des Weichtierzuchtgebietes anteilmäßig vertreten sind, einschließlich natürlicher Muschelbänke im jeweiligen Weichtierzuchtgebiet. Die bei der Auswahl dieser Entnahmestellen zu berücksichtigenden Hauptfaktoren sind: frühere Feststellung von OsHV-1 μvar in dem Gebiet, Bestandsdichte, Wasserströmung, Meerestiefe und Bewirtschaftungspraxis.

c)

Die Proben gemäß Artikel 5 Absatz 2 werden in der Jahreszeit entnommen, in der das Vorkommen von OsHV-1 μvar im jeweiligen Mitgliedstaat oder Kompartiment bekanntermaßen seinen Höhepunkt erreicht. Liegen keine derartigen Angaben vor, so werden die Proben unmittelbar nach dem Zeitraum entnommen, in dem die Wassertemperatur 16 °C übersteigt, bzw. zu der Jahreszeit, in der die Temperatur normalerweise ihren jährlichen Höchststand erreicht.

d)

Die Proben gemäß Artikel 5 Absatz 1 Buchstabe b werden vorzugsweise in der in Buchstabe c genannten Jahreszeit entnommen. Werden Proben außerhalb dieser Jahreszeit entnommen, so müssen die entnommenen Austern während eines für die Feststellung von OsHV-1 μvar ausreichenden Zeitraums unter Bedingungen gehalten werden, die den in Buchstabe c beschriebenen entsprechen, bevor Untersuchungen durchgeführt werden.

TEIL B

1.

Anwendungsbereich

Nachstehend ist eine diagnostische Standardmethode beschrieben, die zur Feststellung von OsHV-1 μvar und zum Nachweis einer Polymerase-Kettenreaktion (im Folgenden „PCR” ) anzuwenden ist. Sie ermöglicht eine Unterscheidung zwischen OsHV-1 und OsHV-1 μvar. Um optimale Reaktionsbedingungen zu schaffen und Anpassungen an die Ausrüstung und die Bedingungen in ihren eigenen Einrichtungen vorzunehmen, dürfen die Laboratorien die in diesem Anhang beschriebenen Methoden gegebenenfalls ändern, sofern eine entsprechende Sensitivität und Spezifität nachgewiesen werden kann.

2.

Begriffsbestimmung

OsHV-1 μvar ist in Artikel 1 dieser Verordnung definiert.

3.

Ausrüstung und Umgebungsbedingungen

Für die Diagnose von OsHV-1 μvar und den Nachweis einer PCR ist die für den PCR-Nachweis übliche Ausrüstung unter denselben Umgebungsbedingungen zu verwenden, also:

—

ein geschlossener Abzug mit einem System zur Erzeugung von UV-Strahlen zur Beseitigung möglicher Kontaminationen bei der Zubereitung des PCR-Gemisches;

—

zwei vollständige Pipettensets (2 μl, 20 μl, 200 μl und 1000 μl), eines für die DNA-Extraktion und eines für die Zubereitung des PCR-Gemisches;

—

drei verschiedene Pipetten: eine Pipette (2 μl) für die Einbringung der Proben in das PCR-Gemisch, eine Pipette (20 μl) für die EtBr-Aufnahme und eine Pipette (20 μl) für die Beladung des Agarose-Gels mit PCR-Produkten;

—

Filterpipettenspitzen (2 μl, 20 μl, 200 μl und 1000 μl) für die DNA-Extraktion, die Zubereitung des PCR-Gemisches und die Einbringung der Proben;

—

Pipettenspitzen (20 μl) für die Aufnahme von EtBr und für die Beladung des Agarose-Gels mit Amplifikationsprodukten;

—

ein Thermocycler für die Amplifikation;

—

ein horizontales Elektrophoresesystem für die Elektrophorese von PCR-Produkten;

—

ein UV-Tisch zur Beobachtung der PCR-Produkte nach der Agarose-Gel-Elektrophorese;

—

ein System, das Bilder des Gels liefert.

Der Manipulator muss während aller unten beschriebenen Schritte einen Laborkittel und Handschuhe tragen. Der Laborkittel und die Handschuhe sind vorzugsweise nach jedem Hauptschritt (DNA-Extraktion, Zubereitung des PCR-Gemisches, Einbringung der Probe, Amplifikation und Beladung des Gels) zu wechseln. Es wird empfohlen, die einzelnen Schritte in unterschiedlichen Räumen durchzuführen. Insbesondere sollten die Amplifikation und die Beladung des Gels/Elektrophorese in einem anderen Raum stattfinden als die DNA-Extraktion, die Zubereitung des PCR-Gemisches und die Verteilung der DNA.

4.

Verfahren

4.1

Zubereitung der Proben

Lebende oder soeben verendete Austern (ohne Anzeichen der Zersetzung), die zuvor eingefroren werden können, werden für die DNA-Extraktion aufbereitet. Die Proben werden je nach ihrer Größe unterschiedlich behandelt:

a)

Bei Larven werden Sammelproben von 50 mg ganzer Tiere (einschließlich Schalen) mit 200 μl destilliertem Wasser zermahlen und bei 1000 g 1 Minute lang zentrifugiert.

b)

Bei Jungmuscheln, die kleiner als 6 mm sind, werden Sammelproben von 300 mg ganzer Tiere (einschließlich Schalen) mit 1200 μl destilliertem Wasser zermahlen und bei 1000 g 1 Minute lang zentrifugiert.

c)

Bei Jungmuscheln, die zwischen 6 und 15 mm groß sind, werden alle Weichteile jedes Tieres einzeln zermahlen.

d)

Bei Tieren, die größer als 15 mm sind, werden Teile der Kiemen und des Mantels isoliert.

Die DNA-Extraktion erfolgt mithilfe des QIAamp® DNA Mini Kits (QIAGEN) nach dem Protokoll für Gewebeproben. Die weitere Zubereitung der Probe erfolgt in der folgenden Reihenfolge:

1.

100 μl der in den Buchstaben a und b genannten Aufschwemmungsproben oder 10 bis 50 mg der in den Buchstaben c und d genannten Gewebeproben in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugengefäß geben und 180 μl Gewebelysepuffer hinzufügen.

2.

20 μl Proteinase-K hinzufügen, (auf einem Vortex) kräftig mischen und bei 56 °C inkubieren, bis das Gewebe vollständig lysiert ist (über Nacht). Während der Inkubation die Probe mehrmals gründlich (auf einem Vortex) mischen, um die Probe zu dispergieren. Das 1,5-ml-Mikrozentrifugengefäß kurz zentrifugieren, um Tropfen vom Deckelinneren zu entfernen.

3.

200 μl Lysepuffer zu der Probe geben, 15 Sekunden lang auf einem Vortex kräftig mischen und die Probe 10 Minuten lang bei 70 °C inkubieren. Das 1,5-ml-Mikrozentrifugengefäß kurz zentrifugieren, um Tropfen vom Deckelinneren zu entfernen.

4.

200 μl Ethanol (96–100 %) zur Probe geben und 15 Sekunden lang auf einem Vortex mischen. Das 1,5-ml-Mikrozentrifugengefäß kurz zentrifugieren, um Tropfen vom Deckelinneren zu entfernen.

5.

Die Mischung aus Schritt 4 vorsichtig — ohne den oberen Rand zu benetzen — auf die QIAamp-Spinsäule (in einem 2-ml-Collection-Tube) geben. Das Gefäß verschließen und 1 Minute lang bei 10000 min^-1 zentrifugieren. Anschließend die QIAamp-Spinsäule in ein sauberes 2-ml-Collection-Tube (im Kit enthalten) setzen und das benutzte Gefäß mitsamt Filtrat entsorgen.

6.

Die QIAamp-Spinsäule vorsichtig öffnen und 500 μl Waschpuffer 1 hinzugeben, ohne den oberen Rand zu benetzen. Das Gefäß verschließen und 1 Minute lang bei 10000 min^-1 zentrifugieren. Anschließend die QIAamp-Spinsäule in ein sauberes 2-ml-Collection-Tube (im Kit enthalten) setzen und das benutzte Collection Tube mitsamt Filtrat entsorgen.

7.

Die QIAamp-Spinsäule vorsichtig öffnen und 500 μl Waschpuffer 2 hinzugeben, ohne den oberen Rand zu benetzen. Das Gefäß verschließen und 3 Minuten lang bei maximaler Drehzahl (14000 min^-1) zentrifugieren.

8.

(Optional:) Anschließend die QIAamp-Spinsäule in ein neues 2-ml-Collection-Tube (nicht im Kit enthalten) setzen und das benutzte Collection Tube mitsamt Filtrat entsorgen. 1 Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit (14000 min^-1) zentrifugieren.

9.

Anschließend die QIAamp-Spinsäule in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugengefäß (nicht im Kit enthalten) setzen und das Collection Tube mitsamt Filtrat entsorgen. Die QIAamp-Spinsäule vorsichtig öffnen und 100 μl destilliertes Wasser auf die Säule geben. 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren und die Spinsäule anschließend 1 Minute lang bei 10000 min^-1 zentrifugieren.

10.

Qualität und Effizienz der Extraktion prüfen (beispielsweise durch OD-Messung (260 nm) mit einem Spektrophotometer oder nach der Elektrophorese in Agarose-Gel).

11.

Proben soweit verdünnen, dass die endgültige DNA-Konzentration 50-100 ng/μl beträgt.

12.

DNA-Lösungen bis zur Durchführung von PCR-Analysen bei 4 °C aufbewahren.

Für die DNA-Extraktion können auch andere im Handel erhältliche Kits verwendet werden, sofern sie nachweislich ähnliche Ergebnisse erzielen.

4.2

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

4.2.1

Reagenzien

—

10x-Puffer (mit Taq-DNA-Polymerase geliefert),

—

MgCl₂ (DNA-Polymerase) (25 mM),

—

Taq-DNA-Polymerase (Goldstar, Eurogentec) 5 U/μl,

—

dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20 mM), vor Verwendung zehnfach verdünnen (auf 2 mM),

—

dH₂O (destilliertes H₂O ohne DNA und RNA).

4.2.2

Primer

Die nachstehenden Primer⁽¹⁾ sind zu verwenden:

CF (10 μM),

CR (10 μM).

4.2.3

PCR-Gemisch

Das PCR-Gemisch für jedes Gefäß besteht aus:

	Volumen je Gefäß	Endgültige Konzentration
Puffer (10x)	5 μl	1x
MgCl2 (25 mM)	5 μl	2,5 mM
dNTP (2 mM)	5 μl	0,2 mM
CF (10 μM)	1 μl	0,2 μM
CR (10 μM)	1 μl	0,2 μM
Taq-Polymerase (5 U/μl)	0,5 μl	2,5 U
dH2O	31,5 μl

—

49 μl dieses PCR-Gemisches in jedes PCR-Gefäß füllen;

—

jedem Gefäß 1 μl extrahierter DNA (50-100 ng/μl) hinzufügen.

4.2.4

Kontrollen

Es werden zwei Arten von Kontrollen verwendet:

—

Negativkontrollen bestehen aus dH₂O (1 μl auf 49 μl PCR-Gemisch). Sie sollen potenzielle reaktive Kontaminationen des Arbeitsumfelds aufzeigen. Eine Negativkontrolle sollte nach jeweils zehn Proben oder nach jeder Probenserie durchgeführt werden.

—

Positivkontrollen bestehen aus Plasmid-DNA, die die Zielgenomregion CF-CR von OsHV-1 enthält. Sie sollen die Effizienz der PCR-Reaktion prüfen. Eine Positivkontrolle sollte nach jeder PCR-Analyse durchgeführt werden. Positivkontrollen sind beim Gemeinschaftlichen Referenzlaboratorium verfügbar.

4.2.5

Amplifikation

Amplifikationszyklen werden in einem Thermocycler durchgeführt.

—

Anfängliche Denaturierung: 2 Minuten bei 94 °C,

—

Amplifikation: 35 Zyklen (1 Minute bei 94 °C, 1 Minute bei 50 °C und 1 Minute bei 72 °C),

—

abschließende Elongation: 5 Minuten bei 72 °C.

4.3

Elektrophorese

4.3.1

Reagenzien

—

50x-TAE-Puffer (kann direkt gebrauchsfertig gekauft werden):

Trisbase (40 mM) 242 g,

Eisessig (40 mM) 57,1 ml,

Na₂EDTA.2H₂O (1 mM) 18,61 g,

dH₂O für 1 Liter,

pH 8 einstellen;

—

Agarose-Gel 2,5 % in 1x-TAE-Puffer

Ethidiumbromid (0,5 μg/ml), nach Abkühlen des Gels hinzugefügt;

—

Beladung mit blauem Farbstoff:

Bromophenolblau 0,25 %,

Xylen-Zyanol FF 0,25 %,

Saccharose 40 %,

bei 4 °C aufbewahren;

sechsfach verdünnt verwenden (2 μl blauer Beladungspuffer für 10 μl PCR-Produkte).

—

Molekulargewichtsmarker:

SmartLadder SF (Eurogentec): ein gebrauchsfertiger Molekulargewichtsmarker mit neun regelmäßigen Banden von 100 bis 1000 bp.

4.3.2

Herstellung von Agarose-Gel

1.

2,5 g Agarose abwiegen, 100 ml 1x-TAE-Puffer hinzufügen und erhitzen, bis die Mischung schmilzt.

2.

Nach Abkühlen der Lösung Ethidiumbromid hinzufügen (5 μl für 100 ml Agarose-Gel) und die Lösung in eine spezifische Form mit Kämmen füllen (um Probetaschen zu bilden).

3.

Wenn das Gel polymerisiert ist, werden die Kämme entfernt; das Gel wird in ein horizontales Elektrophoresesystem gefüllt, das so viel 1x-TAE-Puffer enthält, dass das Agarose-Gel vollständig bedeckt ist.

4.

10 μl PCR-Produkte werden mit 2 μl blauem Farbstoff (6x) vermischt und in die Probetaschen gefüllt.

5.

Eine Probetasche ist für den Molekulargewichtsmarker bestimmt (5 μl).

6.

Je nach Menge und Konzentration des Gels wird eine elektrische Spannung zwischen 50 und 150 Volt zwischen 30 Minuten und 1 Stunde angelegt.

7.

Das Gel wird unter UV-Licht beobachtet.

4.4

Auswertung

Kommt in einer Probe OsHV-1 μvar vor, so ist das daran zu erkennen, dass sich auf 2,5 %igem Agarose-Gel eine Bande der entsprechenden Größe (157 bp anstatt 173 bp bei OsHV-1) bildet und alle Negativkontrollen negativ sowie alle Positivkontrollen positiv sind.

TEIL C

Folgende Faktoren, die die Risiken der Ausbreitung der Krankheit beeinflussen, sind bei der Festlegung eines Sperrgebiets gemäß Artikel 2 Absatz 2 zu berücksichtigen:

a)

Anzahl, Rate und Verteilung der Mollusken im befallenen Zuchtbetrieb oder Weichtierzuchtgebiet,

b)

Abstand und Dichte benachbarter Zuchtbetriebe oder Weichtierzuchtgebiete,

c)

Nähe zu Verarbeitungsbetrieben, Kontaktbetrieben oder Kontakt-Weichtierzuchtgebieten,

d)

Arten im Zuchtbetrieb oder Weichtierzuchtgebiet,

e)

Bewirtschaftungsmethoden im betroffenen Zuchtbetrieb oder Weichtierzuchtgebiet und in den benachbarten Zuchtbetrieben oder Weichtierzuchtgebieten und

f)

hydrodynamische Bedingungen und andere epizootiologisch bedeutsame Faktoren.