Nachweismethoden

KAPITEL I

Die Referenzmethode zur Untersuchung von Proben zum Nachweis von Trichinen ist ISO 18743:2015.

KAPITEL II

A.

Die mechanisch unterstützte Methode der künstlichen Verdauung von Sammelproben/Sedimentationstechnik

1.

Geräte und Reagenzien

a)

Messer oder Schere zur Probeentnahme;

b)

mit 50 Quadraten markierte Tabletts zur Aufbewahrung von Proben von je ca. 2 g Fleisch oder andere Instrumente, welche die Rückverfolgbarkeit der Proben auf gleichwertige Weise sicherstellen;

c)

Fleischwolf oder elektrischer Mixer;

d)

Stomacher Lab-blender 3 500 Thermo-Modell;

e)

Plastiktüten für Stomacher Lab-blender;

f)

2 Liter fassende Scheidetrichter, möglichst mit Teflonstopfen (Sicherheitsverschluss);

g)

Stative, Ringe und Klammern;

h)

Siebe, Maschenweite 180 Mikron, Außendurchmesser 11 cm mit Maschen aus rostfreiem Stahl oder Messing;

i)

Plastiktrichter mit mindestens 12 cm Innendurchmesser zum Einhängen der Siebe;

j)

100-ml-Glasmessbecher;

k)

ein Thermometer, das im Bereich von 20 °C bis 70 °C auf ± 0,5 °C genau ist;

l)

ein Vibrator, z. B. ein Elektrorasierer ohne Kopf;

m)

ein Elektrorelais, das jede Minute an- bzw. ausschaltet;

n)

Trichinoskop mit Horizontaltisch oder Stereomikroskop mit einstellbarem Durchlicht;

o)

Petrischalen mit einem Durchmesser von ca. 90 mm, die mit einem Raster aus ca. 1 cm großen Quadraten versehen sind, oder eine gleichwertige Vorrichtung zur Larvenzählung gemäß Nummer 6.14 der Norm ISO 18743:2015;

p)

17,5 %ige Salzsäure;

q)

Pepsin mit folgender Stärke:

—

in Pulver- oder Granulatform: 1:10000 NF (US National Formulary) entsprechend 1:12500 BP (British Pharmacopoeia) und entsprechend 2000 FIP (Fédération Internationale de Pharmacie);

—

in flüssiger Form: stabilisiertes flüssiges Pepsin mit mindestens 660 Einheiten/ml (Europäisches Arzneibuch).

Es können andere Pepsinaktivitäten zugrunde gelegt werden, sofern die Endaktivität im Verdauungssaft einer Aktivität von 10 g mit einer Stärke von 1:10000 NF entspricht, wie unter Nummer 5.3 der Norm ISO 18743:2015 vorgeschrieben;

r)

eine Reihe von 10-Liter-Gefäßen zur Dekontamination der Geräte, beispielsweise mit Formol, und für die Verdauungsflüssigkeit, wenn ein positiver Befund festgestellt wird;

s)

eine kalibrierte Waage zum Abwiegen von Proben und/oder Pepsin (auf ± 0,1 g genau).

2.

Probenahme und zu verarbeitende Mengen

Wie unter Nummer 4.2 der Norm ISO 18743:2015 vorgeschrieben (vgl. auch deren Anhänge A und B für nähere Einzelheiten).

3.

Verfahren

I.

Mahlen

Durch vorheriges Mahlen der Fleischproben in einem Fleischwolf wird der Verdauungsprozess verbessert. Wird ein elektrischer Mixer verwendet, muss dieser drei- bis viermal für jeweils etwa eine Sekunde betätigt werden.

II.

Verdauungsverfahren

Bei diesem Verfahren können vollständige Ansätze (gleichzeitige Untersuchung von 100 g Proben) oder Ansätze von weniger als 100 g untersucht werden.

a)

Vollständige Ansätze (gleichzeitige Untersuchung von 100 Proben):

i)

In den Stomacher Lab-blender 3 500 werden zwei ineinandergesteckte Plastiktüten eingesetzt und der Temperaturregler auf 40 bis 41 °C eingestellt.

ii)

1,5 Liter Wasser, auf 40 bis 41 °C vorgewärmt, werden in die innere Plastiktüte gefüllt.

iii)

25 ml einer 17,5 %igen Salzsäurelösung werden dem Wasser im Stomacher zugesetzt.

iv)

Von jeder Einzelprobe gemäß Nummer 2 werden 100 Proben von ca. 1 g (bei 25 bis 30 °C) hinzugefügt.

v)

Schließlich werden 6 g Pepsin oder 18 ml flüssiges Pepsin hinzugefügt. Diese Reihenfolge ist streng einzuhalten, um die Zersetzung des Pepsins zu vermeiden.

vi)

Der Stomacher bearbeitet dann 25 Minuten lang den Inhalt des Beutels.

vii)

Dann wird der Plastikbeutel dem Stomacher entnommen und die Verdauungsflüssigkeit durch das Sieb in einen 3-Liter-Kolben abgefiltert.

viii)

Der Plastikbeutel wird mit rund 100 ml Wasser ausgewaschen, mit denen anschließend das Sieb gespült wird und die dabei dem Filtrat im Kolben hinzugefügt werden.

ix)

Bis zu 15 Einzelproben können einer Sammelprobe von 100 Proben hinzugefügt und zusammen mit diesen untersucht werden.

b)

Kleinere Ansätze (weniger als 100 Proben):

i)

In den Stomacher Lab-blender 3 500 werden zwei ineinandergesteckte Plastiktüten eingesetzt und der Temperaturregler auf 40 bis 41 °C eingestellt.

ii)

Die Verdauungsflüssigkeit wird durch Mischen von 1,5 Liter Wasser und 25 ml 17,5 %iger Salzsäure hergestellt. 6 g Pepsin werden hinzugefügt; das Ganze wird bei 40 bis 41 °C gemischt. Diese Reihenfolge ist streng einzuhalten, um die Zersetzung des Pepsins zu vermeiden.

iii)

Von der Verdauungsflüssigkeit wird eine Menge, die jeweils 15 ml pro Gramm Probenmaterial entspricht (z. B. werden für 30 Proben 30 × 15 ml oder 450 ml benötigt) abgemessen und in den inneren der beiden Plastikbeutel gegeben, zusammen mit den Fleischproben von je ca. 1 g (bei 25 bis 30 °C), die jeder der einzelnen Proben gemäß Nummer 2 entnommen wurden.

iv)

Wasser von ca. 41 °C wird in den äußeren Beutel gegossen, bis in den beiden Beuteln ein Volumen von zusammen 1,5 Litern erreicht ist. Der Stomacher bearbeitet dann 25 Minuten lang den Inhalt des Beutels.

v)

Dann wird der Plastikbeutel dem Stomacher entnommen und die Verdauungsflüssigkeit durch das Sieb in einen 3-Liter-Kolben abgefiltert.

vi)

Der Plastikbeutel wird mit rund 100 ml Wasser (bei 25 bis 30 °C) ausgewaschen, mit denen anschließend das Sieb gespült wird und die dann dem Filtrat im Kolben hinzugefügt werden.

III.

Isolierung der Larven durch Sedimentation

—

Eis (300 bis 400 g Eisflocken, Eispulver oder gemahlenes Eis) wird der Verdauungsflüssigkeit zugesetzt, bis ein Volumen von rund 2 Litern erreicht ist. Die Verdauungsflüssigkeit wird so lange gerührt, bis das Eis geschmolzen ist. Bei kleineren Ansätzen (vgl. Ziffer II Buchstabe b) ist die Eismenge entsprechend herabzusetzen.

—

Die gekühlte Verdauungsflüssigkeit wird in einen 2-Liter-Scheidetrichter, der mit einem an separater Klemme befestigten Vibrator versehen ist, abgefüllt.

—

Der Scheidetrichter wird 30 Minuten lang zur Sedimentation stehen gelassen, wobei 1 Minute Vibration und 1 Minute Pause abwechseln.

—

Nach 30 Minuten wird eine Probe von 60 ml des Sediments schnell in einen 100-ml-Messzylinder auslaufen gelassen (der Trichter wird nach Verwendung mit Seifenlösung gespült).

—

Die 60-ml-Probe wird mindestens 10 Minuten lang stehen gelassen, danach wird der Überstand durch Absaugen entfernt, bis ein Volumen von 15 ml verbleibt, das auf Vorhandensein von Larven untersucht wird.

—

Für das Absaugen kann eine Plastikspritze, die mit einem Plastikröhrchen versehen ist, verwendet werden. Das Röhrchen muss so lang sein, dass 15 ml im Messzylinder verbleiben, wenn beim Absaugen die Flanke der Spritze auf den Zylinderrand gesetzt wird.

—

Die verbleibenden 15 ml werden in eine Petrischale oder eine gleichwertige Vorrichtung zur Larvenzählung gegossen und mit dem Trichinoskop bzw. dem Stereomikroskop untersucht.

—

Der Messzylinder wird mit 5 bis 10 ml Leitungswasser ausgespült, und dieses Spülwasser wird der Probe hinzugefügt.

—

Die Sedimente müssen untersucht werden, sobald sie vorbereitet sind. Die Untersuchung darf unter keinen Umständen auf den nächsten Tag verschoben werden.

Sind die Sedimente nicht klar, so sind sie wie folgt zu klären:

—

Die endgültige Probe von 60 ml wird in einen Messzylinder gegossen und 10 Minuten stehen gelassen. 45 ml des Überstands werden durch Absaugen entfernt, das verbleibende Volumen von 15 ml wird mit Leitungswasser auf 45 ml aufgefüllt.

—

Nach einer weiteren Absetzzeit von 10 Minuten werden 30 ml des Überstands abgesaugt und die verbleibenden 15 ml werden in eine Petrischale oder eine gleichwertige Vorrichtung zur Larvenzählung gegossen und mit dem Trichinoskop bzw. dem Stereomikroskop untersucht.

—

Der Messzylinder wird mit 10 ml Leitungswasser gespült; dieses Spülwasser wird ebenfalls der in der Petrischale bzw. der gleichwertigen Vorrichtung zur Larvenzählung befindlichen Probe hinzugefügt und mit dem Trichinoskop bzw. dem Stereomikroskop untersucht.

IV.

Positive oder nicht eindeutige Ergebnisse

Ergibt die Untersuchung einer Sammelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis, so wird jedem Schwein eine weitere Probe von 20 g entnommen, wie unter Nummer 4.2 der Norm ISO 18743:2015 vorgeschrieben (vgl. auch deren Anhänge A und B für nähere Einzelheiten). Die jeweils 20 g schweren Proben von fünf Schweinen werden zusammengefasst und nach dem in diesem Kapitel angegebenen Verfahren untersucht. Auf diese Weise werden Proben von 20 Gruppen zu je fünf Schweinen untersucht. Werden in einer Gruppenprobe von fünf Schweinen Trichinen nachgewiesen, so ist von jedem Schwein dieser Gruppe eine weitere Probe von 20 g zu entnehmen und nach dem in diesem Kapitel angegebenen Verfahren einzeln zu untersuchen. Parasitenproben müssen zur Konservierung und zur Identifizierung der Erregerart im EU-Referenzlabor oder im nationalen Referenzlabor in 70-90 %igem Ethylalkohol (Endkonzentration) aufbewahrt werden. Zum Dekontaminierungsverfahren siehe Nummer 12 der Norm ISO 18743:2015.

B.

Die mechanisch unterstützte Methode der künstlichen Verdauung von Sammelproben/ „On-Filter-Isolation” -Technik

1.

Gerätschaften und Reagenzien

Wie in Abschnitt A 1 vorgeschrieben. Sonstige Geräte:

a)

1-Liter-Gelman-Trichter mit Filterhalter (Durchmesser 45 mm);

b)

Filterscheiben, bestehend aus: rundem Sieb aus rostfreiem Stahl mit Maschengröße von 35 Mikron (Scheibendurchmesser: 45 mm), zwei Gummiringen aus 1 mm dickem Gummi (Außendurchmesser: 45 mm, Innendurchmesser: 38 mm); das runde Sieb wird zwischen den beiden Gummiringen angebracht und mit einem für beide Materialien geeigneten Zweikomponentenkleber angeklebt;

c)

3-Liter-Erlenmeyerkolben mit seitlichem Rohr zum Absaugen;

d)

Filterpumpe;

e)

Plastikbeutel von mindestens 80 ml Inhalt;

f)

Schweißgerät für Plastikbeutel;

g)

Rennilase, 1:150000 Soxhlet/Einheiten je g.

2.

Probenahme

Wie unter Nummer 4.2 der Norm ISO 18743:2015 vorgeschrieben (vgl. auch deren Anhänge A und B für nähere Einzelheiten).

3.

Verfahren

I.

Mahlen

Durch vorheriges Mahlen der Fleischproben in einem Fleischwolf wird der Verdauungsprozess verbessert. Wird ein elektrischer Mixer verwendet, muss dieser drei- bis viermal für jeweils etwa eine Sekunde betätigt werden.

II.

Verdauungsverfahren

Bei diesem Verfahren können vollständige Ansätze (gleichzeitige Untersuchung von 100 g Proben) oder Ansätze von weniger als 100 g untersucht werden.

a)

Vollständige Ansätze (gleichzeitige Untersuchung von 100 Proben)

Siehe Abschnitt A 3 II a.

b)

Kleinere Ansätze (weniger als 100 Proben)

Siehe Abschnitt A 3 II b.

III.

Isolierung der Larven durch Filtern

a)

Eis (300 bis 400 g Eisflocken, Eispulver oder gemahlenes Eis) wird der Verdauungsflüssigkeit zugesetzt, bis ein Volumen von rund 2 Liter erreicht ist. Bei kleineren Sammelproben ist die Eismenge entsprechend herabzusetzen.

b)

Die Verdauungsflüssigkeit wird so lange gerührt, bis das Eis geschmolzen ist. Die gekühlte Verdauungsflüssigkeit wird mindestens 3 Minuten stehen gelassen, damit die Larven sich einrollen können.

c)

Der Gelman-Trichter mit Filterhalter wird mit einer Filterscheibe auf einen Erlenmeyerkolben montiert, der an eine Filterpumpe angeschlossen ist.

d)

Die Verdauungsflüssigkeit wird in den Gelman-Trichter gegossen und gefiltert. Gegen Ende des Filterungsvorgangs kann der Durchgang der Verdauungslösung durch den Filter mithilfe der Filterpumpe unterstützt werden. Das Absaugen muss unmittelbar bevor der Filter trocken wird, d. h., wenn noch 2 bis 5 ml im Trichter verbleiben, eingestellt werden.

e)

Sobald die gesamte Verdauungsflüssigkeit gefiltert ist, wird die Filterscheibe entfernt, in einen 80 ml Plastikbeutel gegeben, in den 15 bis 20 ml Rennilase-Lösung gegossen werden. Die Rennilase-Lösung besteht aus 2 g Rennilase in 100 ml Leitungswasser.

f)

Der Plastikbeutel wird zweifach verschweißt und in einen Stomacher zwischen den inneren und den äußeren Beutel gegeben.

g)

Der Stomacher bearbeitet dann 3 Minuten lang den Inhalt des Beutels, z. B. eine vollständige oder unvollständige Sammelprobe.

h)

Nach 3 Minuten wird der Plastikbeutel zusammen mit Filterscheibe und Rennilase-Lösung aus dem Stomacher entfernt und mit einer Schere geöffnet. Die Flüssigkeit wird in eine Petrischale oder eine gleichwertige Vorrichtung zur Larvenzählung gegossen. Der Beutel wird mit 5 bis 10 ml Wasser ausgewaschen, das ebenfalls in die Petrischale bzw. die gleichwertige Vorrichtung zur Larvenzählung gegossen und mit dem Trichinoskop bzw. dem Stereomikroskop untersucht wird.

i)

Die Sedimente müssen untersucht werden, sobald sie vorbereitet sind. Die Untersuchung darf unter keinen Umständen auf den nächsten Tag verschoben werden.

Anmerkung: Die Filterscheiben dürfen nur verwendet werden, wenn sie vollständig sauber sind. Die Filterscheiben dürfen nie in unsauberem Zustand trocknen. Zum Säubern können sie über Nacht in Rennilase-Lösung gelegt werden. Vor der Verwendung sind sie im Stomacher in Rennilase-Lösung zu reinigen.

IV.

Positive oder nicht eindeutige Ergebnisse

Wie unter Buchstabe A Nummer 3 Ziffer IV festgelegt.

C.

Das automatische Verdauungsverfahren für Sammelproben bis zu 35 g

1.

Geräte und Reagenzien

a)

Messer oder Schere zur Probeentnahme;

b)

mit 50 Quadraten markierte Tabletts zur Aufbewahrung von Proben von je ca. 2 g Fleisch oder andere Instrumente, welche die Rückverfolgbarkeit der Proben auf gleichwertige Weise sicherstellen;

c)

Trichomatic-35^®-Mixer mit Filtereinsatz;

d)

8,5 %ige Salzsäurelösung (± 0,5 Gewichtsprozent);

e)

transparente Polykarbonatmembranfilter mit 50 mm Durchmesser und 14 Mikron Porengröße;

f)

Pepsin mit folgender Stärke:

—

in Pulver- oder Granulatform: 1:10000 NF (US National Formulary) entsprechend 1:12500 BP (British Pharmacopoeia) und entsprechend 2000 FIP (Fédération Internationale de Pharmacie);

—

in flüssiger Form: stabilisiertes flüssiges Pepsin mit mindestens 660 Einheiten/ml (Europäisches Arzneibuch).

Es können andere Pepsinaktivitäten zugrunde gelegt werden, sofern die Endaktivität im Verdauungssaft einer Aktivität von 10 g mit einer Stärke von 1:10000 NF entspricht, wie unter Nummer 5.3 der Norm ISO 18743:2015 vorgeschrieben;

g)

eine kalibrierte Waage zum Abwiegen von Proben und/oder Pepsin (auf ± 0,1 g genau);

h)

Pinzette mit flacher Spitze;

i)

eine Reihe von Objektträgern für die Mikroskopie mit einer Seitenlänge von mindestens 5 cm oder eine Reihe von Petrischalen mit einem Durchmesser von mindestens 6 cm, deren Boden mit einem spitzen Gegenstand in Quadrate von 10 × 10 mm eingeteilt ist;

j)

ein (Stereo-)Durchlichtmikroskop (15- bis 60-fache Vergrößerung) oder ein Trichinoskop mit Horizontaltisch;

k)

ein Eimer zum Auffangen der flüssigen Abfälle;

l)

eine Reihe von 10-Liter-Gefäßen zur Dekontamination der Geräte, beispielsweise mit Formol, und für die Verdauungsflüssigkeit, wenn ein positiver Befund festgestellt wird;

m)

ein Thermometer, das im Bereich von 20 bis 70 °C auf ± 0,5 °C genau ist.

2.

Probenahme

Wie unter Nummer 4.2 der Norm ISO 18743:2015 vorgeschrieben (vgl. auch deren Anhänge A und B für nähere Einzelheiten).

3.

Verfahren

I.

Verdauungsverfahren

a)

Der Mischer mit dem Filtereinsatz wird positioniert, der Abfallschlauch angeschlossen und zum Eimer geführt.

b)

Beim Einschalten des Mixers beginnt das Aufheizen.

c)

Zuvor ist das Bodenventil unter der Reaktionskammer zu öffnen und wieder zu schließen.

d)

Dann werden bis zu 35 Proben von jeweils etwa 1 g (bei 25 bis 30 °C) hinzugefügt, die gemäß Nummer 2 aus jeder einzelnen Probe entnommen werden. Es ist darauf zu achten, dass größere Sehnenstücke entfernt werden, da diese den Membranfilter verstopfen könnten.

e)

Eine mit dem Mixer verbundene Flüssigkeitskammer wird bis zum Rand gefüllt (etwa 400 ml).

f)

Die kleinere verbundene Flüssigkeitskammer wird bis zum Rand mit Salzsäure (8,5 %) gefüllt (etwa 30 ml).

g)

Ein Membranfilter wird unter den Grobfilter im Filterhalter in den Filtereinsatz gesetzt.

h)

Schließlich werden 7 g Pepsin oder 21 ml flüssiges Pepsin hinzugefügt. Diese Reihenfolge ist streng einzuhalten, um die Zersetzung des Pepsins zu vermeiden.

i)

Der Deckel der Reaktions- und der Flüssigkeitszellen wird geschlossen.

j)

Jetzt wird die Digestionszeit eingestellt. Eine kurze Digestionsdauer (5 Minuten) ist für Schweine im normalen Schlachtalter, für andere Proben eine längere Dauer (8 Minuten) einzustellen.

k)

Wird der Startknopf des Mixers betätigt, beginnt die automatische Aufbereitung und Verdauung, gefolgt von der Filtration. Das Verfahren ist nach 10 bis 13 Minuten abgeschlossen und kommt automatisch zum Stillstand.

l)

Der Deckel der Reaktionskammer wird geöffnet, wenn sichergestellt ist, dass die Kammer leer ist. Befinden sich noch Schaum oder Verdauungsflüssigkeit in der Kammer, ist das Verfahren gemäß Abschnitt V zu wiederholen.

II.

Isolierung der Larven

a)

Der Filterhalter wird abgenommen, und der Membranfilter wird auf einen Objektträger oder eine Petrischale übertragen.

b)

Der Membranfilter wird mit einem (Stereo-)Mikroskop oder einem Trichinoskop untersucht.

III.

Reinigungsgerät

a)

Ist das Ergebnis positiv, wird die Reaktionskammer des Mixers zu zwei Dritteln mit kochendem Wasser gefüllt. Die verbundene Flüssigkeitskammer wird mit gewöhnlichem Leitungswasser gefüllt, bis die untere Markierung bedeckt ist. Die Reinigung erfolgt dann automatisch. Der Filterhalter wird zusammen mit den übrigen Gerätschaften dekontaminiert, z. B. durch Formolbehandlung.

b)

Am Ende des Tages wird die Flüssigkeitskammer im Mixer mit Wasser gefüllt und ein Standardprogramm durchgeführt.

IV.

Verwendung von Membranfiltern

Jeder Polycarbonat-Membranfilter darf höchstens fünfmal verwendet werden. Der Filter ist vor der nächsten Benutzung zu wenden. Außerdem ist der Filter nach jeder Benutzung auf etwaige Schäden zu untersuchen, die eine Weiterverwendung ausschließen würden.

V.

Bei unvollständiger Verdauung anzuwendendes Verfahren, wenn keine Filtration erfolgen kann

Nachdem der Mixer einen automatischen Zyklus gemäß Abschnitt I durchlaufen hat, wird der Deckel der Reaktionskammer geöffnet und geprüft, ob Schaum oder Flüssigkeitsreste in der Kammer verblieben sind. Ist dies der Fall, wird wie folgt weiterverfahren:

a)

Das Bodenventil unter der Reaktionskammer wird geschlossen.

b)

Der Filterhalter wird abgenommen, und der Membranfilter wird auf einen Objektträger oder eine Petrischale übertragen.

c)

In den Filterhalter wird ein neuer Membranfilter gesteckt; der Filterhalter wird wieder befestigt.

d)

Die Flüssigkeitskammer des Mixers wird mit Wasser gefüllt, bis die untere Markierung bedeckt ist.

e)

Der automatische Reinigungszyklus wird durchgeführt.

f)

Nach Abschluss des Reinigungszyklus wird der Deckel der Reaktionskammer geöffnet; es wird überprüft, ob sich noch Flüssigkeitsreste darin befinden.

g)

Ist die Kammer leer, wird der Filterhalter abgenommen; der Membranfilter wird mit einer Pinzette auf einen Objektträger oder eine Petrischale übertragen.

h)

Die beiden Membranfilter werden gemäß Abschnitt II geprüft. Können die Filter nicht untersucht werden, ist der gesamte Verdauungsprozess mit einer längeren Verdauungszeit gemäß Abschnitt I zu wiederholen.

VI.

Positive oder nicht eindeutige Ergebnisse

Wie unter Buchstabe A Nummer 3 Ziffer IV festgelegt.

D.

Magnetrührverfahren für die künstliche Verdauung von Sammelproben/ „On-Filter-Isolation” -Technik und Larvennachweis mittels eines Latexagglutinationstests

Dieses Verfahren wird nur für die Untersuchung des Fleisches von Hausschweinen als gleichwertig erachtet.

1.

Geräte und Reagenzien

a)

Messer oder Schere und Pinzette zur Probenahme;

b)

mit 50 Quadraten markierte Tabletts zur Aufbewahrung von Proben von je ca. 2 g Fleisch oder andere Instrumente, welche die Rückverfolgbarkeit der Proben auf gleichwertige Weise sicherstellen;

c)

Mixer, mit scharfer Klinge. Falls die Proben schwerer als 3 g sind, ist ein Fleischwolf mit Öffnungen von 2 bis 4 mm Größe oder eine Schere zu verwenden. Im Fall von Gefrierfleisch oder Zunge (nach Entfernung der unverdaulichen Oberflächenschicht) ist ein Fleischwolf erforderlich, und die Größe der Proben muss erheblich gesteigert werden;

d)

Magnetrührer mit temperaturgeregelter Heizplatte und Teflonbeschichteten Rührstäben von ungefähr 5 cm Länge;

e)

3 Liter fassende Glasbecher;

f)

Siebe, Maschenweite 180 Mikron, Außendurchmesser 11 cm, mit Maschen aus rostfreiem Stahl;

g)

Filtrationsgerät aus Stahl für Maschenfilter einer Größe von 20 μm mit einem Stahltrichter;

h)

Vakuumpumpe;

i)

Metall- oder Kunststoffbehälter, Fassungsvermögen 10 bis 15 Liter, zum Auffangen der Verdauungsflüssigkeit;

j)

ein 3D-Schüttler;

k)

Aluminiumfolie;

l)

25 %ige Salzsäure;

m)

Pepsin mit folgender Stärke:

—

in Pulver- oder Granulatform: 1:10000 NF (US National Formulary) entsprechend 1:12500 BP (British Pharmacopoeia) und entsprechend 2000 FIP (Fédération Internationale de Pharmacie);

—

in flüssiger Form: stabilisiertes flüssiges Pepsin mit mindestens 660 Einheiten/ml (Europäisches Arzneibuch).

Es können andere Pepsinaktivitäten zugrunde gelegt werden, sofern die Endaktivität im Verdauungssaft einer Aktivität von 10 g mit einer Stärke von 1:10000 NF entspricht, wie unter Nummer 5.3 der Norm ISO 18743:2015 vorgeschrieben;

n)

Leitungswasser, auf 46 bis 48 °C erhitzt;

o)

eine kalibrierte Waage zum Abwiegen von Proben und/oder Pepsin (auf ± 0,1 g genau);

p)

Pipetten in verschiedenen Größen (1, 10 und 25 ml), Mikropipetten entsprechend den Anweisungen des Herstellers der Latexagglutinationstests sowie Pipettenhalter;

q)

Nylon-Maschenfilter (20 μm) mit einem zum Filtrationsgerät passenden Durchmesser;

r)

Zange aus Kunststoff oder Stahl (10 bis 15 cm);

s)

konische Phiolen (15 ml);

t)

ein in die konischen Phiolen passendes Pistill mit einem konischen Stopfen aus Teflon oder Stahl;

u)

ein Thermometer, das im Bereich von 20 bis 70 °C auf ± 0,5 °C genau ist;

v)

Latexagglutinationskarten aus dem Trichin-L-Antigen-Test-Kit, das unter dem Code EURLP_D_001/2011 validiert wurde;

w)

Pufferlösung mit Konservierungsstoff (Probenverdünnungsmittel) aus dem Trichin-L-Antigen-Test-Kit, das unter dem Code EURLP_D_001/2011 validiert wurde;

x)

Puffer, ergänzt durch einen Konservierungsstoff (Negativkontrolle) aus dem Trichin-L-Antigen-Test-Kit, das unter dem Code EURLP_D_001/2011 validiert wurde;

y)

Puffer, ergänzt durch Trichinella-spiralis-Antigene und einen Konservierungsstoff (Positivkontrolle) aus dem Trichin-L-Antigen-Test-Kit, das unter dem Code EURLP_D_001/2011 validiert wurde;

z)

Puffer mit Polystyrolpartikeln, beschichtet mit Antikörpern und ergänzt durch einen Konservierungsstoff (Latexperlen) aus dem Trichin-L-Antigen-Test-Kit, das unter dem Code EURLP_D_001/2011 validiert wurde;

aa)

Wegwerfstäbchen.

2.

Probenahme

Wie unter Nummer 4.2 der Norm ISO 18743:2015 vorgeschrieben (vgl. auch deren Anhänge A und B für nähere Einzelheiten).

3.

Verfahren

I.

Vollständige Ansätze (gleichzeitige Untersuchung von Proben mit einem Gesamtgewicht von 100 g)

a)

16 ± 0,5 ml 25 %ige Salzsäure (0,2 % Endkonzentration) wird in einen 3-l-Behälter mit 2,0 l ± 200 ml Leitungswasser gegeben, auf 46 bis 48 °C vorerhitzt; ein Rührstab wird im Behälter platziert, der Behälter wird auf die vorgeheizte Platte gestellt und der Rührvorgang gestartet.

b)

10 ± 1 g Pepsinpulver (oder 30 ± 3 ml flüssiges Pepsin) werden hinzugefügt.

c)

100-115 g Proben, die gemäß Nummer 2 zusammengestellt wurden, werden im Mixer mit 150 ml ± 15 ml vorerhitztem Verdauungspuffer zerkleinert.

d)

Das zerkleinerte Fleisch wird in einen 3-l-Behälter gegeben, der Wasser, Pepsin und Salzsäure enthält.

e)

Das Schneidewerk des Mixers wird mehrfach in die Verdauungsflüssigkeit des Behälters eingetaucht, und die Mixerschüssel wird mit einer kleinen Menge der Verdauungsflüssigkeit ausgespült, um noch anhängendes Fleisch zu entfernen.

f)

Der Behälter wird mit Aluminiumfolie abgedeckt.

g)

Der Magnetrührer ist so einzustellen, dass er während des gesamten Rührvorgangs eine konstante Temperatur von 44 bis 46 °C hält. Während des Rührvorgangs muss die Verdauungsflüssigkeit so schnell drehen, dass ein tiefer zentraler Wirbel entsteht, ohne dass Flüssigkeit herausspritzt.

h)

Die Verdauungsflüssigkeit wird gerührt, bis die Fleischpartikel verschwinden (etwa 30 Minuten). Danach wird das Rührgerät abgeschaltet und die Verdauungsflüssigkeit durch das Sieb in den Sedimentierungsfilter zur Sedimentation gegossen. Bei der Verarbeitung bestimmter Fleischarten (Zunge, Wildfleisch usw.) können längere Verdauungszeiten erforderlich sein (nicht mehr als 60 Minuten).

i)

Der Verdauungsvorgang gilt als zufriedenstellend, wenn nicht mehr als 5 % des ursprünglichen Gewichts der Probe auf dem Sieb bleiben.

j)

Der Nylon-Maschenfilter (20 μm) wird auf dem Filterhalter angebracht. Der konische Filtrationstrichter aus Stahl wird mithilfe des Blockiersystems am Filterhalter befestigt und das Stahlsieb (Maschenweite 180 μm) auf dem Trichter angebracht. Die Vakuumpumpe wird an den Filterhalter und den Metall- bzw. Kunststoffbehälter angeschlossen, damit die Verdauungsflüssigkeit aufgefangen werden kann.

k)

Das Rühren wird gestoppt und die Verdauungsflüssigkeit durch das Sieb in den Filtrationstrichter gegossen. Der Behälter wird mit ca. 250 ml warmem Wasser gespült. Nach der Filtration der Verdauungsflüssigkeit wird die Spülflüssigkeit in die Filtrationsrampe gegossen.

l)

Die Filtrationsmembran wird mit der Pinzette an einer Seite gehalten. Die Membran wird mindestens 4-fach gefaltet und in die 15 ml fassende konische Phiole eingeführt. Die konische Phiole ist entsprechend dem Pistill zu wählen.

m)

Die Filtrationsmembran wird in der 15 ml fassenden konischen Phiole mithilfe des Pistills nach unten geschoben, anschließend wird durch Vorwärts- und Rückwärtsbewegen des Pistills (ca. 20-mal) starker Druck auf die Membran ausgeübt; dabei sollte sich das Pistill entsprechend den Anweisungen des Herstellers innerhalb der gefalteten Filtrationsmembran befinden.

n)

0,5 ml ± 0,01 ml des Probenverdünnungsmittels werden mit einer Pipette in die 15 ml fassende konische Phiole gegeben und die Filtrationsmembran durch leichtes, wiederholtes Vorwärts- und Rückwärtsbewegen des Pistills ca. 30 Sekunden lang homogenisiert; hierbei sind entsprechend den Anweisungen des Herstellers abrupte Bewegungen zu vermeiden, um das Verspritzen der Flüssigkeit zu begrenzen.

o)

Alle Proben, die negative und die positive Kontrolle werden entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit Pipetten auf verschiedene Felder der Agglutinationskarte verteilt.

p)

Die Latexperlen werden entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit einer Pipette in jedes Feld der Agglutinationskarte zugegeben, wobei sie nicht mit den Proben und Kontrollen in Kontakt kommen dürfen. Dann werden die Latexperlen in jedem Feld vorsichtig mithilfe eines Wegwerfstäbchens vermischt, bis die homogene Flüssigkeit das ganze Feld bedeckt.

q)

Die Agglutinationskarte wird auf dem 3D-Schüttler positioniert und entsprechend den Anweisungen des Herstellers 10 ± 1 min geschüttelt.

r)

Nach dem in den Anweisungen angegebenen Zeitraum wird der Schüttelvorgang beendet, die Agglutinationskarte wird auf eine ebene Oberfläche gelegt und die Reaktionsergebnisse werden sofort entsprechend den Anweisungen des Herstellers abgelesen. Im Fall einer positiven Probe müssen sich Perlenaggregate zeigen. Im Fall einer negativen Probe bleibt die Suspension homogen ohne Perlenaggregate.

II.

Ansätze mit einem Gesamtgewicht von weniger als 100 g gemäß Nummer 8 der Norm ISO 18743:2015

Falls erforderlich, können bis zu 15 g einem vollständigen Ansatz von 100 g hinzugefügt und mit diesem zusammen gemäß Ziffer I untersucht werden. Mehr als 15 g sind als vollständiger Ansatz zu untersuchen. Bei Ansätzen bis zu 50 g können Verdauungsflüssigkeit und Bestandteile reduziert werden: 1 Liter Wasser, 8 ml Salzsäure und 5 g Pepsin.

III.

Positive oder nicht eindeutige Ergebnisse

Ergibt die Untersuchung einer Sammelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis des Latexagglutinationstests, so wird jedem Schwein eine weitere Probe von 20 g gemäß Nummer 4.2 der Norm ISO 18743:2015 entnommen (vgl. auch deren Anhänge A und B für nähere Einzelheiten). Die jeweils 20 g schweren Proben von fünf Schweinen werden zusammengefasst und nach dem Verfahren gemäß Ziffer I untersucht. Auf diese Weise werden Proben von 20 Gruppen zu je fünf Schweinen untersucht. Im Fall eines positiven Latexagglutinationstests bei einer Gruppenprobe von fünf Schweinen wird von jedem Schwein dieser Gruppe eine weitere Probe von 20 g entnommen und nach einem der unter Ziffer I beschriebenen Verfahren einzeln untersucht. Im Fall eines positiven oder nicht eindeutigen Latexagglutinationstests werden mindestens 20 g Schweinemuskeln zur Bestätigung anhand der Norm ISO 18743:2015 oder einer der oben beschriebenen gleichwertigen Methoden an das nationale Referenzlabor gesendet. Parasitenproben werden zur Konservierung und zur Identifizierung der Erregerart im EU-Referenzlabor oder im nationalen Referenzlabor in 70-90 %igem Ethylalkohol (Endkonzentration) aufbewahrt. Nach Entnahme der Parasiten müssen Flüssigkeiten mit positivem Befund durch Erhitzen auf mindestens 60 °C dekontaminiert werden.

IV.

Reinigung und Dekontamination nach positivem oder nicht eindeutigem Befund

Ergibt die Untersuchung einer Sammelprobe oder einer Einzelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis des Latexagglutinationstests, so wird alles Material, das mit Fleisch in Berührung kommt (Mixerschüssel und Messer, Pistill, Behälter, Rührstab, Temperatursensor, konischer Filtrationstrichter, Sieb und Pinzette) sorgfältig dekontaminiert, indem es einige Sekunden lang in heißes Wasser (65-90 °C) getaucht wird. Fleischreste oder inaktivierte Larven, die sich noch auf den Oberflächen befinden könnten, können mit einem sauberen Schwamm und Leitungswasser entfernt werden. Erforderlichenfalls können einige Tropfen eines Reinigungsmittels zugefügt werden, um die Geräte und Ausrüstungsteile zu entfetten. Es wird empfohlen, danach alle Gegenstände gründlich zu spülen, damit alle Reste des Reinigungsmittels entfernt werden.

E.

Prüfung durch künstliche Digestion für den In-vitro-Nachweis von Larven der Trichinella spp. in Fleischproben, PrioCHECK^® Trichinella AAD Kit

Dieses Verfahren wird nur für die Untersuchung des Fleisches von Hausschweinen als gleichwertig erachtet. Das PrioCHECK^® Trichinella AAD Kit ist entsprechend dem Anleitungshandbuch des Kits unter Verwendung von Scheidetrichtern (Lenz NS 29/32) und eines 80-ml-Reagenzglases anzuwenden.