Anlage VO (EU) 2018/150

METHODE ZUM NACHWEIS VON KUHMILCH UND -KASEIN IN KÄSE AUS SCHAF-, ZIEGEN- ODER BÜFFELMILCH ODER AUS GEMISCHEN VON SCHAF-, ZIEGEN- ODER BÜFFELMILCH

1.
ANWENDUNGSBEREICH

Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Kuhmilch und -kasein in Käse aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch mithilfe der isoelektrischen Fokussierung der γ-Kaseine nach Plasminolyse.

2.
ANWENDBARKEIT

Dieses Verfahren dient dem empfindlichen und spezifischen Nachweis von Kuhmilch und -kasein (jeweils mit und ohne Wärmebehandlung) in frischem und gereiftem Käse aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch oder aus Gemischen von Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch. Es ist ungeeignet für den Nachweis von Milch- und Käsefälschung durch hitzebehandeltes Rindermolkekonzentrat.

3.
KURZBESCHREIBUNG

3.1. Das Kasein wird aus Käse und Referenzproben isoliert.

3.2. Das isolierte Kasein wird gelöst; anschließend wird eine Plasminspaltung vorgenommen (EC.3.4.21.7).

3.3. Die plasminbehandelten Kaseine werden in Anwesenheit von Harnstoff und unter Anfärben der Proteine isoelektrisch fokussiert.

3.4. Die Auswertung erfolgt durch Vergleich der gefärbten γ3- und γ2-Kaseinbanden (Kuhmilchnachweis) zwischen der zu bestimmenden Probe und der im selben Gel laufenden, 0 % und 1 % Kuhmilch enthaltenden Referenzproben.

4.
REAGENZIEN

Soweit nicht anders angegeben, sind analysenreine Reagenzien zu verwenden. Das Wasser muss zweimal destilliert oder von entsprechender Reinheit sein.

Anmerkung: Die folgenden Angaben gelten für im Labor hergestellte harnstoffhaltige Polyacrylamidgele im Format 265 × 125 × 0,25 mm. Bei Verwendung anderer Gelrezepturen und -formate müssen die Elektrophoresebedingungen gegebenenfalls angepasst werden.

Isoelektrische Fokussierung

4.1.
Reagenzien zur Herstellung der harnstoffhaltigen Polyacrylamidgele

4.1.1.
Gelstammlösung

    4,85 g Acrylamid,

    0,15 g N, N′-Methylen-bis-acrylamid (BIS),

    48,05 g Harnstoff und

    15,00 g Glycerin (87 % w/w)

werden in Wasser gelöst; anschließend wird die Lösung auf 100 ml aufgefüllt, in Braunglasflaschen gegeben und im Kühlschrank aufbewahrt.

Anmerkung: Statt der angegebenen Festeinwaagen der neurotoxischen Acrylamide kann vorzugsweise eine der handelsüblichen Acrylamid-Fertiglösungen verwendet werden. Bei einer solchen Lösung mit 30 % (m/v) Acrylamid und 0,8 % (m/v) BIS müssen anstelle der Festeinwaagen 16,2 ml für die genannte Rezeptur eingesetzt werden. Die Haltbarkeit der Gelstammlösung beträgt maximal 10 Tage. Beträgt die Leitfähigkeit mehr als 5 μS, wird die Lösung mit 2 g Amberlite MB-3 versetzt, unter Rühren 30 Minuten lang entionisiert und dann membranfiltriert (0,45 μm).

4.1.2.
Gellösung
Aus der Gelstammlösung (siehe 4.1.1) wird durch Versetzen mit verschiedenen Additiven und Ampholyten (*) eine Gellösung hergestellt:

    9,0 ml Gelstammlösung,

    24 mg β-Alanin,

    500 μl Ampholyt pH 3,5-9,5,

    250 μl Ampholyt pH 5-7,

    250 μl Ampholyt pH 6-8.

Die Gellösung wird durchmischt und 2 bis 3 Minuten im Ultraschallbad oder im Vakuum entgast.

Anmerkung: Die Gellösung darf erst unmittelbar vor dem Gießen (siehe 6.2) zubereitet werden.

4.1.3.
Katalysatorlösungen

4.2.
Kontaktflüssigkeit

Kerosin oder n-Decan.

4.3.
Anodenlösung

5,77 g Phosphorsäure (85 % m/m) werden in Wasser gelöst und auf 100 ml aufgefüllt.

4.4.
Kathodenlösung

2,00 g Natriumhydroxid werden in Wasser gelöst und auf 100 ml aufgefüllt.

Probenvorbereitung

4.5.
Reagenzien zur Proteinisolierung

4.5.1. Verdünnte Essigsäure (25,0 ml Eisessigsäure werden mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt)
4.5.2. Dichlormethan
4.5.3. Aceton

4.6.
Protein-Lösungspuffer

    5,75 g Glycerin (87 % m/m),

    24,03 g Harnstoff und

    250 mg Dithiothreitol

werden in Wasser gelöst und auf 50 ml aufgefüllt.

Anmerkung: Die Lösung ist im Kühlschrank aufzubewahren und höchstens 1 Woche haltbar.

4.7.
Reagenzien für die Plasminspaltung des Kaseins

4.7.1.
Ammoniumcarbonat-Pufferlösung
0,2 mol/l NH4HCO3-Lösung (1,58 g/100 ml Wasser), die mit 0,05 mol/l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA 1,46 g/100 ml) versetzt wurde, wird mit 0,2 mol/l (NH4)2CO3-Lösung (1,92 g/100 ml Wasser), die mit 0,05 mol/l EDTA versetzt wurde, auf pH 8 titriert.
4.7.2. Bovines Plasmin (EC. 3.4.21.7), Aktivität mindestens 5 U/ml
4.7.3.
ε-Aminocapronsäure zur Enzyminaktivierung
2,624 g ε-Aminocapronsäure (6-Amino-n-Hexansäure) werden in 100 ml 40 %igem Ethanol (v/v) gelöst.

4.8.
Standardproben

4.8.1. Zertifizierte Standardproben eines Gemisches von mit Lab versetztem Schaf- und Ziegen-Magermilchpulver, das jeweils 0 % und 1 % Kuhmilch enthält, sind erhältlich beim Kommissionsinstitut für Referenzmaterialien und Messwesen, B-2440 Geel, Belgien.
4.8.2.
Herstellung der Interim-Standardproben von labversetzter Büffelmilch mit 0 % bzw. 1 % Kuhmilch
Zur Gewinnung von Magermilch wird eine rohe Büffel- bzw. Kuhsammelmilch bei einer Temperatur von 37 °C mit 2500 g 20 Minuten lang zentrifugiert. Nach raschem Abkühlen des Zentrifugenbechers nebst Inhalt auf 6 bis 8 °C wird die Fettschwimmschicht restlos entfernt. Zur Herstellung der 1 %igen Standardprobe werden 495 ml Büffelmagermilch in einem 1-l-Becherglas mit 5,00 ml Kuhmagermilch versetzt und durch Zusetzen verdünnter Milchsäure (10 % m/v) auf einen pH-Wert von 6,4 eingestellt. Die Temperatur wird auf 35 °C eingestellt; anschließend werden 100 μl Kälberlab (Labstärke 1: 10000, ca. 3000 U/ml) hinzugegeben. 1 Minute lang wird gerührt; danach wird das Becherglas mit einer Aluminiumfolie abgedeckt 1 Stunde bei einer Temperatur von 35 °C stehen gelassen, damit sich der Quark/Topfen bilden kann. Anschließend wird die gesamte dickgelegte Milchprobe ohne vorheriges Homogenisieren oder Abscheiden der Molke gefriergetrocknet. Nach dem Gefriertrocknen wird das Produkt gleichmäßig und homogen vermahlen. Zur Herstellung der 0 %igen Standardprobe wird das gleiche Verfahren mit reiner Büffelmagermilch durchgeführt. Die Standardproben sind bei – 20 °C aufzubewahren.

Anmerkung: Es empfiehlt sich, die Reinheit der Büffelmilch durch isoelektrische Fokussierung der plasminbehandelten Kaseine vor der Herstellung der Standardproben zu prüfen.

Reagenzien zur Proteinfärbung

4.9.
Fixierlösung

150 g Trichloressigsäure werden in Wasser gelöst und auf 1000 ml aufgefüllt.

4.10.
Entfärbelösung

500 ml Methanol und 200 ml Eisessigsäure werden mit destilliertem Wasser auf 2000 ml aufgefüllt.

Anmerkung: Die Entfärbelösung ist jeden Tag frisch zuzubereiten; sie kann zweckmäßigerweise aus Vorratslösungen (50 %iges Methanol (v/v) und 20 %ige Eisessigsäure (v/v)) durch Mischen gleicher Volumina zubereitet werden.

4.11.
Färbelösungen

4.11.1.
Färbelösungen (Vorratslösung 1)
3,0 g Coomassie Brilliant Blau G-250 (C.I. 42655) werden in 1000 ml 90 %igem Methanol (v/v) mit einem Magnetrührer (etwa 45 Minuten lang) verrührt und anschließend durch zwei mittelschnelle Faltenfilter gefiltert.
4.11.2.
Färbelösung (Vorratslösung 2)
5,0 g Kupfersulfatpentahydrat werden in 1000 ml 20 %iger Essigsäure (v/v) gelöst.
4.11.3.
Färbelösung (gebrauchsfertig)
Unmittelbar vor dem Färben werden jeweils 125 ml der Vorratslösungen (4.11.1 und 4.11.2) miteinander vermischt.

Anmerkung: Die Färbelösung ist am Tag des Gebrauchs zuzubereiten.

5.
AUSRÜSTUNG

5.1. Glasplatten (265 × 125 × 4 mm); Gummiroller (Walzenbreite 15 cm); Nivelliertisch

5.2. Gelträgerfolie (265 × 125 mm)

5.3. Gegenfolie (280 × 125 mm); beide Längsseiten werden mit je einem Klebestreifen (280 × 6 × 0,25 mm) abgeklebt (Abbildung 1)

5.4. Elektrofokussierkammer mit Kühlplatte (z. B. 265 × 125 mm) mit geeignetem Spannungsgeber (≥ 2,5 kV) oder Elektrophoreseautomat

5.5. Umlaufkryostat, thermostatregelbar auf 12 °C (± 0,5 °C)

5.6. Zentrifuge, einstellbar auf 3000 g

5.7. Elektrodenstreifen (≥ 265 mm lang)

5.8. Tropfflaschen aus Kunststoff, für Anoden- und Kathodenlösung

5.9. Probenapplikatoren 10 × 5 mm (Viskose oder Filterpapier mit geringer Proteinadsorption)

5.10. Färbe- und Entfärbeschalen aus Edelstahl oder Glas (z. B. Instrumentenschalen 280 × 150 mm)

5.12. Regelbarer Homogenisierstab (Schaftdurchmesser 10 mm), Drehzahlbereich 8000-20000 min– 1

5.13. Magnetrührer

5.14. Ultraschallbad

5.15. Folienschweißgerät

5.16. 25-μl-Mikropipetten

5.17. Vakuumzentrifuge oder Gefriertrockner

5.18. Thermostatregelbares Wasserbad, einstellbar auf 35 °C und 40 °C (± 1 °C), mit Schüttelvorrichtung

5.19. Densitometerausrüstung, Registrierung bei λ = 634 nm

6.
VERFAHREN

6.1.
Probenvorbereitung

6.1.1.
Kaseinisolierung

Eine 5 g Trockenmasse entsprechende Menge Käse oder die Referenzstandardproben werden in ein 100-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben; 60 ml destilliertes Wasser werden hinzugegeben; anschließend wird die Probe mit einem Homogenisierstab (8000 bis 10000 min– 1) homogenisiert. Mit verdünnter Essigsäure (4.5.1) wird der pH-Wert 4,6 eingestellt; dann wird die Probe zentrifugiert (5 Minuten lang, 3000 g). Fette und Molke werden dekantiert und der Rückstand in 40 ml destilliertem Wasser, das mit verdünnter Essigsäure (4.5.1) auf einen pH-Wert von 4-5 eingestellt wurde, homogenisiert (20000 min– 1), mit 20 ml Dichlormethan (4.5.2) versetzt, nochmals homogenisiert und dann zentrifugiert (5 Minuten lang, 3000 g). Die zwischen wässriger und organischer Phase schwimmende Kaseinschicht (siehe Abbildung 2) wird mit einem Spatel angehoben, damit beide Phasen dekantiert werden können. Das Kasein wird nochmals in 40 ml destilliertem Wasser (siehe oben) und 20 ml Dichlormethan (4.5.2) homogenisiert und zentrifugiert. Dieser Vorgang ist zu wiederholen, bis beide Extraktionsphasen farblos sind (zwei- bis dreimal). Der Proteinrückstand wird mit 50 ml Aceton (4.5.3) homogenisiert und über ein mittelschnelles Faltenpapierfilter abfiltriert. Das Filterretentat wird zweimal mit je 25 ml Aceton gewaschen, an der Luft oder im Stickstoffstrom getrocknet und in einer Reibschale fein zerrieben.

Anmerkung: Trockene Kaseinisolate sind bei – 20 °C aufzubewahren.

6.1.2.
Plasminspaltung der β-Kaseine zur Anreicherung der γ-Kasein-Konzentration

25 mg Kaseinisolat (6.1.1) werden in 0,5 ml Ammoniumcarbonatpufferlösung (4.7.1) suspendiert und 20 Minuten lang z. B. im Ultraschallbad homogenisiert. Das Homogenisat wird auf 40 °C erwärmt, mit 10 μl Plasmin (4.7.2) versetzt, durchmischt und 1 Stunde lang bei 40 °C unter ständigem Schütteln bebrütet. Zur Enzyminhibierung werden 20 μl ε-Aminocapronsäurelösung (4.7.3), danach 200 mg fester Harnstoff und schließlich 2 mg Dithiothreitol zugesetzt.

Anmerkung: Zur Verbesserung der Symmetrie der fokussierten Kaseinbanden empfiehlt es sich, die Lösung nach Zusatz von ε-Aminocapronsäure gefrierzutrocknen und den Probenrückstand in 0,5 ml Harnstoffpufferlösung (4.6) zu lösen.

6.2.
Herstellen der harnstoffhaltigen Polyacrylamidgele

Auf eine Glasplatte (5.1) wird die Gelträgerfolie (5.2) mithilfe einiger Tropfen Wasser aufgewalzt; ausgetretenes Wasser ist mit einem Papiertuch aufzunehmen. In gleicher Weise wird die mit Abstandshaltern (0,25 mm) versehene Gegenfolie (5.3) auf eine weitere Glasplatte aufgewalzt. Diese wird dann horizontal auf einem Nivelliertisch ausgerichtet. Die frisch zubereitete, entgaste Gellösung (4.1.2) wird mit je 10 μl der Katalysatorlösungen Temed und PER (4.1.3.1) versetzt, kurz durchmischt und gleichmäßig auf die Mitte der Gegenfolie ausgegossen. Die Gelträgerplatte wird (mit der Folie nach unten) mit einer Kante auf die nivellierte Gegenfolienplatte aufgesetzt und so langsam abgesenkt, dass sich zwischen den Folien ein Gelfilm bilden und sich gleichmäßig und blasenfrei ausbreiten kann (Abbildung 3). Die Gelträgerfolienplatte wird mithilfe eines dünnen Spatels vollständig aufgesetzt; drei weitere Glasplatten werden als Andruckgewichte aufgelegt. Nach vollständiger Polymerisierung (ca. 60 Minuten) wird das auf der Gelträgerfolie anpolymerisierte Gel mitsamt Gegenfolie durch Verkanten der Glasplatten herausgelöst. Die Rückseite der Trägerfolie wird sorgfältig von Gelresten und Harnstoff gesäubert. Das „Gel-Sandwich” wird nun in einen Folienschlauch eingeschweißt und im Kühlschrank (maximal 6 Wochen) aufbewahrt.

Anmerkung: Die Gegenfolie mit den Abstandshaltern kann wiederverwendet werden. Das Polyacrylamidgel kann auf kleinere Formate zugeschnitten werden; dies ist bei kleinem Probenumfang oder bei Verwendung eines Elektrophoreseautomaten zu empfehlen (2 Gele im Format 4,5 × 5 cm).

6.3.
Isoelektrische Fokussierung

Der Kühlthermostat wird auf 12°C eingestellt. Nach Abwischen der Gelträgerfolienrückseite mit Kerosin (4.2) werden einige Tropfen Kerosin auf die Mitte des Kühlblocks aufgebracht. Das „Gel-Sandwich” wird mit der Trägerseite nach unten blasenfrei aufgewalzt. Ausgetretenes Kerosin wird abgewischt und die Gegenfolie abgezogen. Die Elektrodenstreifen werden mit den entsprechenden Elektrodenlösungen (4.3, 4.4) getränkt, auf die Gellänge zugeschnitten und auf die dafür vorgesehenen Stellen gelegt (Elektrodenabstand 9,5 cm).

Die Fokussierung ist unter folgenden Bedingungen durchzuführen:

6.3.1.
Gelformat 265 × 125 × 0,25 mm
Schritt

Zeit

(min)

Spannung

(V)

Stromstärke

(mA)

Leistung

(W)

Voltstunden

(Vh)

1.
Vorfokussierung
30

max.

2500

max.

15

konstant 4ca. 300
2.
Probenfokussierung(1)
60

max.

2500

max.

15

konstant 4ca. 1000
3.
Endfokussierung
60

max.

2500

max.

5

max.

20

ca. 3000
40

max.

2500

max.

6

max.

20

ca. 3000
30

max.

2500

max.

7

max.

25

ca. 3000

Anmerkung: Bei Änderung der Stärke oder Breite der Gele sind Strom und Leistung entsprechend anzupassen (z. B. Verdopplung von Stromstärke und Leistung bei Verwendung eines 0,5 mm starken Gels im Format 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2.
Beispiel eines Spannungsprogramms für einen Elektrophoreseautomaten (2 Gele je 5,0 × 4,5 cm); direkte Aufbringung der Elektroden auf das Gel (ohne Elektrodenstreifen)
SchrittSpannungStromstärkeLeistungTemp.Voltstunden
1.
Vorfokussierung
1000 V10,0 mA3,5 W8 °C85 Vh
2.
Probenfokussierung
250 V5,0 mA2,5 W8 °C30 Vh
3.
Fokussierung
1200 V10,0 mA3,5 W8 °C80 Vh
4.
Fokussierung
1500 V5,0 mA7,0 W8 °C570 Vh
In Schritt 2 wird der Probenapplikator bei 0 Vh aufgesetzt. In Schritt 2 wird der Probenapplikator bei 30 Vh abgenommen.

6.4.
Proteinanfärbung

6.4.1.
Fixieren der Proteine

Unmittelbar nach Abschalten des Stroms werden die Elektrodenstreifen entfernt. Das Gel wird sofort in eine mit 200 ml Fixierlösung (4.9) gefüllte Färbe- und Entfärbeschale gegeben und 15 Minuten lang geschüttelt.

6.4.2.
Waschen und Färben der Gelplatte

Die Fixierlösung wird restlos abgegossen und die Gelplatte zweimal je 30 Sekunden mit 100 ml Entfärbelösung (4.10) gespült. Die Entfärbelösung wird abgegossen und die Schale mit 250 ml Färbelösung (4.11.3) gefüllt; die Färbelösung wird 45 Minuten leicht geschwenkt, um die Lösung einwirken zu lassen.

6.4.3.
Entfärben der Gelplatte

Die Färbelösung wird abgegossen, die Gelplatte zweimal mit je 100 ml Entfärbelösung (4.10) gespült und anschließend 15 Minuten lang in 200 ml Entfärbelösung geschwenkt; der Entfärbeschritt ist mindestens zwei- oder dreimal zu wiederholen, bis der Hintergrund klar und farblos ist. Die Gelplatte wird dann mit destilliertem Wasser (zweimal 2 Minuten) gespült und an der Luft (2 bis 3 Stunden) oder mit dem Fön (ca. 10 bis 15 Minuten) getrocknet.

Anmerkung 1: Fixierung, Färben und Entfärben erfolgen bei einer Temperatur von 20 °C. Bei höheren Temperaturen dürfen diese Schritte nicht ausgeführt werden.

Anmerkung 2: Wird einer empfindlicheren Silberfärbelösung (z. B. Silberfärbelösungs-Kit, Protein Pharmacia Biotech, Code Nr. 17-1150-01) der Vorzug gegeben, sind die plasminbehandelten Kaseinproben auf 5 mg/ml zu verdünnen.

7.
BEWERTUNG

Die Bewertung erfolgt durch Vergleich der Proteinbandenmuster der unbekannten Probe mit den Referenzstandardproben auf demselben Gel. Der Nachweis von Kuhmilch in Käsen aus Schaf, Ziegen- oder Büffelmilch und in Gemischen aus Schaf-, Ziegen- oder Büffelmilch erfolgt aufgrund der γ3- und der γ2-Kaseine, bei denen die isoelektischen Punkte im pH-Wert-Bereich 6,5 bis 7,5 liegen (Abbildungen 4a, 4b und 5). Die Nachweisgrenze des Verfahrens liegt unter 0,5 %.

7.1.
Visuelle Bestimmung

Zur visuellen Bestimmung des Kuhmilchanteils empfiehlt es sich, die Konzentration der Proben und der Standardproben auf die Stärke der Schaf-, Ziegen- und/oder Büffel-γ2- und -γ3-Kaseine einzustellen (siehe γ2 E,G,B und γ3 E,G,B in den Abbildungen 4a, 4b und 5). Nur dann kann der Kuhmilchgehalt (kleiner, gleich oder größer als 1 %) in der zu beurteilenden Probe durch direkten Vergleich der Stärken der Rinder-γ2- und -γ3-Kaseinzonen (siehe γ3 C und γ2 C in den Abbildungen 4a, 4b und 5) mit denen der 0 %igen und 1 %igen Standardproben (Schaf, Ziege) oder laboreigenen Interims-Standardproben (Büffelmilch) bestimmt werden.

7.2.
Densitometrische Bestimmung

Nach Möglichkeit ist mit Hilfe eines Densitometers (5.19) das Peak-Flächen-Verhältnis der γ2- und γ3-Kaseine (siehe Abbildung 5) zwischen Rind und Schaf, Ziege und/oder Büffel zu ermitteln. Dieser Wert ist mit dem γ2- und γ3-Kasein-Peak-Flächen-Verhältnis der 1 %igen Standardprobe (Schaf, Ziege) oder der im selben Gel laufenden laboreigenen Interims-Standardprobe (Büffel) zu vergleichen.

Anmerkung: Reagiert die 1 %ige Standardprobe eindeutig positiv auf Rinder-γ2- und -γ3-Kaseine, die 0 %ige Standardprobe dagegen nicht, liefert die Methode zuverlässige Ergebnisse. Ansonsten ist das Verfahren unter genauer Beachtung der Verfahrensvorschrift zu optimieren.

Eine Stichprobe gilt als positiv, wenn die Rinder-γ2- und-γ3-Kaseine oder die entsprechenden Peak-Flächen-Verhältnisse zumindest den Zahlen für die 1 %ige Standardprobe entsprechen.

8.
LITERATUR

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. In: Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990). Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. In: Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995). Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. In: Electrophoresis-Forum 89 (Radola B.J., Hrsg.), 389-393, Bode-Verlag, München (1989). Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. In: Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982). Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. In: Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Abbildung 1

Abbildung 2

Abbildung 3

a = Abstandshalter (0,25 mm); b = Gegenplatte (5.3); c, e = Glasplatten (5.1); d = Gellösung (4.1.2); Gelträgerfolie (5,2)

Abbildung 4a

% CM = Kuhmilchgehalt; C = Kuh; E = Schaf; G = Ziege Abgebildet ist die obere Hälfte des IEF-Gels.

Abbildung 4b

% CM = Kuhmilchgehalt; 1+ = Probe mit 1 % Kuhmilch, versetzt mit reinem Kuhmilchkasein in der Mitte des Durchlaufs; C = Kuh; E = Schaf; G = Ziege; B = Büffel Abgebildet ist der gesamte Trennungsabstand des IEF-Gels.

Abbildung 5

a, b = Standardproben mit 0 und 1 % Kuhmilch; c-g = Käseproben mit 0, 1, 2, 3 und 7 % Kuhmilch; C = Kuh; E = Schaf; G = Ziege Die obere Hälfte des IEF-Gels wurde bei λ = 634 nm analysiert.

Fußnote(n):

(1)

Probenauftrag: Nach der Vorfokussierung (Schritt 1) werden 18 μl der Probe und der Standardlösungen auf die Probenapplikatoren (10 × 5 mm) pipettiert und in Abständen von 1 mm voneinander sowie von 5 mm in Längsrichtung von der Anode auf das Gel gebracht und leicht angedrückt. Die Fokussierung erfolgt unter den beschriebenen Bedingungen; nach der 60-minütigen Probenfokussierung sind die Probenapplikatoren vorsichtig abzunehmen.

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