Anlage 5 VO (EU) 2019/1390
SCHLÜSSELPARAMETER UND AKZEPTANZKRITERIEN FÜR DIE QUALIFIZIERUNG EINES HPLC/UPLC-SPEKTROPHOTOMETRIESYSTEMS ZUR MESSUNG VON AUS RhCE-GEWEBEMODELLEN EXTRAHIERTEM MTT-FORMAZAN
| Parameter | Protokoll abgeleitet aus FDA-Leitlinie (36) (38) | Akzeptanzkriterien |
|---|---|---|
| Selektivität | Analyse von Isopropanol, Blindkontrolle lebend (Isopropanol-Extrakt aus lebenden RhCE-Gewebemodellen ohne Behandlung), Blindkontrolle abgetötet (Isopropanol-Extrakt aus abgetöteten RhCE-Gewebemodellen ohne Behandlung) und einem Farbstoff (z. B. Methylenblau) | FlächeInterferenz ≤ 20 % FlächeLLOQ(1) |
| Präzision | Qualitätskontrollen (d. h. MTT-Formazan bei 1,6 μg/ml, 16 μg/ml und 160 μg/ml) in Isopropanol (n=5) | VK ≤ 15 % bzw. ≤ 20 % für LLOQ |
| Genauigkeit | Qualitätskontrollen mit Isopropanol (n=5) | % Abw. ≤ 15 % bzw. ≤ 20 % für LLOQ |
| Matrixeffekt | Qualitätskontrollen mit Blindkontrolle lebend (n=5) | 85 % ≤ Matrixeffekt % ≤ 115 % |
| Übertragung | Analyse Isopropanol nach einem ULOQ(2) -Standard | FlächeInterferenz ≤ 20 % FlächeLLOQ |
| Reproduzierbarkeit (innerhalb eines Tages) |
3 unabhängige Eichkurven (aufgrund von 6 aufeinander folgenden Verdünnungen von MTT-Formazan in Isopropanol im Verhältnis 1:3 beginnend mit der ULOQ, d. h. 200 μg/ml); Qualitätskontrollen mit Isopropanol (n=5) |
Eichkurven: % Abw. ≤ 15 % bzw. ≤ 20 % für LLOQ Qualitätskontrollen: % Abw. ≤ 15 % und VK ≤ 15 % |
| Reproduzierbarkeit (innerhalb eines Tages) |
Tag 1: 1 Eichkurve und Qualitätskontrollen in Isopropanol (n=3) Tag 2: 1 Eichkurve und Qualitätskontrollen in Isopropanol (n=3) Tag 3: 1 Eichkurve und Qualitätskontrollen in Isopropanol (n=3) |
|
| Kurzzeitstabilität von MTT-Formazan in RhCE-Gewebeextrakt | Qualitätskontrollen in Blindkontrollen lebend (n=3), die am Tag der Vorbereitung sowie nach 24-stündiger Lagerung bei Raumtemperatur analysiert wurden. | % Abw. ≤ 15 % |
| Langzeitstabilität von MTT-Formazan in RhCE-Gewebeextrakt (erforderlichenfalls) | Qualitätskontrollen in Blindkontrollen lebend (n=3), die am Tag der Vorbereitung sowie nach mehrtägiger Lagerung bei -20 °C analysiert wurden. | % Abw. ≤ 15 % |
Fußnote(n):
- (1)
- LLOQ:
- Untere Quantifizierungsgrenze, definiert als Gewebeviabilität von 1-2 %, d. h. 0,8 μg/ml.
- (2)
- ULOQ:
- Obere Quantifizierungsgrenze, definiert als mindestens zweimal so hoch wie die erwartete MTT-Formazan-Konzentration in Isopropanol-Extrakten aus Negativkontrollen (~70 μg/ml bei der VRM), d. h. 200 μg/ml.
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