BESTIMMUNG DES GENETISCHEN GESCHLECHTS (GENETISCHE GESCHLECHTSBESTIMMUNG)

Die Methode zur Bestimmung des genetischen Geschlechts für Xenopus laevis basiert auf Yoshimoto et al., 2008. Detaillierte Verfahren zur Genotypisierung können bei Bedarf aus dieser Veröffentlichung erhalten werden. Alternative Methoden (z. B. qPCR mit hohem Durchsatz) können angewandt werden, wenn sie als geeignet angesehen werden.

Primer für X. laevis

DM-W-Marker

Vorwärts:

5’-CCACACCCAGCTCATGTAAAG-3’

Rückwärts:

5’-GGGCAGAGTCACATATACTG-3’

Positivkontrolle

Vorwärts:

5’-AACAGGAGCCCAATTCTGAG-3’

Rückwärts:

5’-AACTGCTTGACCTCTAATGC-3’

DNA-Aufreinigung

DNA aus Muskel- oder Hautgewebe mithilfe von beispielsweise Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit (Kat. Nr. 69506) oder einem ähnlichen Produkt gemäß den Anweisungen des Kits reinigen. Die DNA kann mit weniger Puffer aus den Spinsäulen herausgelöst werden, um konzentriertere Proben zu erhalten, wenn dies für PCR als erforderlich erachtet wird. Bitte beachten, dass die DNA nicht ganz stabil ist, also muss eine Kreuzkontaminierung sorgfältig vermieden wird, da sie zu einer falschen Charakterisierung von Männchen als Weibchen oder umgekehrt führen kann.

PCR

Ein mithilfe von JumpStart^TMTaq von Sigma erstelltes Probenprotokoll findet sich in Tabelle 1.

Tabelle 1

Hinweis: Wenn Master-Mixes vorbereitet werden, muss eine zusätzliche Menge erzeugt werden, um Verluste beim Pipettieren auszugleichen (Beispiel: 25x sollte für nur 24 Reaktionen verwendet werden).

Master-Mix	1x (μl)	[Abschluss]
NFW(1)	11	—
10X Puffer	2,0	—
MgCl2 (25 mM)	2,0	2,5 mM
dNTPs (jeweils 10 mM)	0,4	200 μM
Marker für Primer (8 μM)	0,8	0,3 μM
Marker rev. Primer (8 μM)	0,8	0,3 μM
Kontrolle für Primer (8 μM)	0,8	0,3 μM
Kontrolle rev. Primer (8 μM)	0,8	0,3 μM
JumpStartTM Taq	0,4	0,05 Einheiten/μl
DNA-Vorlage	1,0	~200 pg/μl

Reaktion:

Master-Mix	19,0 μl
Vorlage	1,0 μl
Gesamt	20,0 μl

Thermocycler-Profil:

Stufe 1.	94 oC	1 Min.
Stufe 2.	94 oC	30 Sek.
Stufe 3.	60 oC	30 Sek.
Stufe 4.	72 oC	1 Min.
Stufe 5.	Zu Stufe 2 gehen.	35 Zyklen
Stufe 6.	72 oC	1 Min.
Stufe 7.	4 oC	halten

PCR-Produkte können umgehend in einem Gel durchlaufen oder bei 4 ^oC gelagert werden.

Agarosegel-Elektrophorese (3 %)(Probenprotokoll)

50X TAE

Tris	24,2 g
Eisessig	5,71 ml
Na2 (EDTA)·2H2O	3,72 g

Wasser zu 100 ml hinzufügen

1X TAE

H2O	392 ml
50X TAE	8 ml

3:1 Agarose

3 Teile NuSieve™ GTG^™ Agarose

1 Teil Fisher Agarose niedrige Elektrophorese (EEO)

Methode

1.

Ein 3 %-Gel herstellen, indem 1,2 g Agarosemischung zu 43 ml 1X TAE hinzugefügt werden. Verwirbeln, um große Klumpen aufzulösen.

2.

Die Agarosemischung in der Mikrowelle erhitzen, bis sie sich komplett aufgelöst hat (Überkochen vermeiden). Leicht abkühlen lassen.

3.

1,0 μL Ethidiumbromid hinzufügen (10 mg/ml). Kolben verwirbeln. Bitte beachten, dass Ethidiumbromid mutagen ist, also sollten so weit wie technisch möglich alternative Chemikalien für diesen Schritt verwendet werden, um die Gesundheitsrisiken für die Arbeiter zu minimieren⁽²⁾.

4.

Mit Kamm Gel in die Form gießen. Vollständig abkühlen lassen.

5.

Gel zu Apparatur hinzufügen. Gel mit 1X TAE bedecken.

6.

1 μl 6x Ladepuffer zu jeweils 10 μl PCR-Produkt hinzufügen.

7.

Mit einer Pipette die Proben in Mulden tropfen.

8.

Bei 160 konstanten Volt ~20 Minuten laufen lassen.

Ein Bild des Agarosegels, das die Bandmuster zeigt, die auf männliche und weibliche Tiere hindeuten lassen, ist in Abbildung 1 dargestellt.

Literaturhinweise

Yoshimoto S, Okada E, Umemoto H, Tamura K, Uno Y, Nishida-Umehara C, Matsuda Y, Takamatsu N, Shiba T, Ito M. 2008. A W-linked DM-domain gene, DM-W, participates in primary ovary development in Xenopus laevis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 2469-2474.