1.

ERREGERIDENTIFIZIERUNG

Die Präsenz von Mycobacterium bovis (M. bovis), Erreger der Rindertuberkulose, in klinischen oder postmortal entnommenen Proben ist nachweisbar durch Untersuchung angefärbter Tupferproben oder Immunperoxidase-Methoden und kann durch Anzüchtung des Erregers auf einem primären Isolationsmedium bestätigt werden. Pathologisches Material zur Bestätigung des M.-bovis-Erregers sollte von anomalen Lymphknoten und parenchymatösen Organen wie Lunge, Leber, Milz, usw. entnommen werden. Zeigt das Tier keine pathologischen Veränderungen, so sind zur Untersuchung und Anzüchtung Proben von Lympfknoten (Lnn. retropharyngeales, bronchales, mediastinales, supramammalis, mandibulares und bestimmte Lnn. mesenterici) und Leber geeignet. In der Regel lassen sich Isolate anhand ihrer kulturellen und biochemischen Merkmale identifizieren. Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction — PCR) eignet sich ebenfalls zum Nachweis des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes. M. bovis lässt sich mit DNA-Analysemethoden möglicherweise schneller und zuverlässiger von anderen Mitgliedern des Komplexes abgrenzen als mit biochemischen Methoden. „Genetic Fingerprinting” ermöglicht die Unterscheidung zwischen verschiedenen M.-bovis-Stämmen sowie die Beschreibung von Herkunfts-, Übertragungs- und Ausbreitungsmustern. Die angewandten Verfahren und Medien, ihre Standardisierung und die Ergebnisauswertung müssen den Vorgaben von Kapitel 2.3.3 (Rindertuberkulose) des OIE-Handbuchs mit Normenempfehlungen zu Untersuchungsmethoden und Vakzinen, vierte Ausgabe 2000, entsprechen.

2.

INTRAKUTANE TUBERKULINPROBE

Für amtliche Intrakutanproben nach den Verfahrensvorschriften gemäß Nummer 2.2 darf nur (gereinigtes) PPD (Purified Protein Derivative) verwendet werden, das den Standards gemäß Nummer 2.1 entspricht.

2.1.

Standards für (Rinder- und Geflügel-)Tuberkulin

2.1.1.

Definition

Bovines oder aviäres PPD-Tuberkulin ist ein aus Stoffwechselprodukten und Lysaten von Mycobacterium bovis bzw. Mycobacterium avium gewonnenes Präparat, mit dem sich bei einem gegen Mikroorganismen derselben Art sensibilisierten Tier eine verzögerte Überempfindlichkeit ( „delayed hypersensitivity” ) feststellen lässt.

2.1.2.

Herstellung

Tuberkulin wird hergestellt aus den wasserlöslichen Fraktionen von M.-bovis- bzw. M.-avium-Kulturen, die in synthetischen Flüssigmedien gewachsen sind und nach einer Bebrütungszeit in strömendem Dampf abgetötet, filtriert und anschließend im Wasserbad eingeengt wurden. Die hauptsächlich aus Protein bestehende aktive Fraktion des Filtrats wird durch Präzipitation isoliert, gewaschen und erneut aufgelöst. Ein antimikrobielles Konservierungsmittel wie Phenol, das keine falsch-positiven Ergebnisse hervorruft, kann zugegeben werden. Das sterile mycobakterienfreie Endpräparat wird unter aseptischen Bedingungen in sterile, fälschungssichere Glasbehältnisse abgefüllt, die so verschlossen sind, dass jede Kontamination ausgeschlossen ist. Das Präparat kann gefriergetrocknet werden.

2.1.3.

Identifikation des Erzeugnisses

Eine Reihe graduierter Tuberkulindosen wird angemessen sensibilisierten Albino-Meerschweinchen, jeweils mit einem Gewicht von mindestens 250 g, an verschiedenen Injektionsstellen intrakutan eingespritzt. Nach 24 bis 28 Stunden sind Reaktionen in Form ödematöser Schwellungen mit Erythem mit oder ohne Nekrose an den Injektionsstellen sichtbar. Umfang und Schwere der Reaktionen können je nach Dosis unterschiedlich sein. Nicht sensibilisierte Meerschweinchen reagieren auf derartige Injektionen nicht.

2.1.4.

Testungen

2.1.4.1.

pH: Der pH-Wert liegt zwischen 6,5 und 7,5.

2.1.4.2.

Phenol: Enthält das Prüfpräparat Phenol, so darf seine Konzentration 5 g/l nicht überschreiten.

2.1.4.3.

Sensibilisierende Wirkung: Eine Gruppe von drei Meerschweinchen verwenden, denen keine Substanzen verabreicht wurden, die das Testergebnis beeinträchtigen könnten. Jedem Tier dreimal im Abstand von jeweils fünf Tagen eine Dosis Prüfpräparat in Höhe von jeweils 500 IE/0,1 ml intrakutan injizieren. 15 bis 21 Tage nach der dritten Injektion diesen Tieren sowie einer Kontrollgruppe, bestehend aus drei Meerschweinchen desselben Gewichts, denen zuvor kein Tuberkulin eingespritzt wurde, intrakutan dieselbe Dosis (500 IE) injizieren. 24 bis 28 Stunden nach der letzten Injektion sind die Reaktionen beider Gruppen kaum unterschiedlich.

2.1.4.4.

Toxizität: Zwei Meerschweinchen, jeweils mit einem Gewicht von mindestens 250 g, denen zuvor keine Substanzen verabreicht wurden, die das Testergebnis beeinträchtigen könnten, jeweils 0,5 ml Prüfpräparat einspritzen. Die Tiere sieben Tage lang beobachten. Während dieser Zeit wird keine anomale Wirkung verzeichnet.

2.1.4.5.

Sterilität: Den Sterilitätstest gemäß der Monografie für Tiervakzine (monograph on Vaccines for veterinary use) des Europäischen Arzneibuchs, vierte Ausgabe, durchführen.

2.1.5.

Wirksamkeit

Die Wirksamkeit von bovinem und aviärem PPD-Tuberkulin wird getestet, indem die Reaktionen sensibilisierter Meerschweinchen auf die intrakutane Injektion einer Verdünnungsreihe des Prüfpräparats mit den Reaktionen auf bekannte Konzentrationen eines in internationalen Einheiten (IE) kalibrierten Referenzpräparats aus bovinem bzw. aviärem PPD-Tuberkulin verglichen werden. Für den Wirksamkeitstest mindestens 9 Albino-Meerschweinchen, jeweils mit einem Gewicht von 400 bis 600 g, durch tiefe intramuskuläre Injektion von 0,0001 mg Feuchtmasse lebender M.-bovis-Bakterien des Stammes AN5 (für Rindertuberkulin in 0,5 ml einer 9 g/l-Natriumchlorid-R-Lösung, für Geflügeltuberkulin in einer angemessenen Dosis inaktivierter oder lebender M.-avium-Bakterien suspendiert) sensibilisieren. Frühestens vier Wochen nach der Sensibilisierung die Flanken der Tiere beidseitig für maximal vier Injektionen scheren. Mittels isotonischer phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 6,5-7,5) mit einem Gehalt an 0,005 g/l Polysorbat 80 R Verdünnungsreihen des Prüfpräparats und des Referenzpräparats anlegen. Dabei mindestens drei Dosen Prüfpräparat und mindestens drei Dosen Referenzpräparat verwenden. Die Dosen so auswählen, dass die entstehenden Läsionen mindestens 8 mm und höchsten 25 mm Durchmesser haben. Die Verdünnungen nach dem Zufallsprinzip und unter Verwendung eines lateinischen Quadrats den Injektionsstellen zuteilen. Die einzelnen Dosen mit einem konstantem Volumen von 0,1 ml oder 0,2 ml intrakutan injizieren. Nach 24 bis 28 Stunden die Durchmesser der Läsionen messen, und das Testergebnis nach gängigen statistischen Methoden berechnen, davon ausgehend, dass die Durchmesser der Läsionen zum Logarithmus der Tuberkulinkonzentration direkt proportional sind. Der Test ist nur gültig, wenn die Fehlergrenzen (P = 0,95) nicht unter 50 % und nicht über 200 % der geschätzten Wirksamkeit liegen. Die geschätzte Wirksamkeit beträgt mindestens 66 % und höchstens 150 % der für Rindertuberkulin angegebenen Wirksamkeit. Sie beträgt mindestens 75 % und höchstens 133 % der für Geflügeltuberkulin angegebenen Wirksamkeit. Die angegebene Wirksamkeit beträgt mindestens 20000 IE/ml für beide Tuberkuline.

2.1.6.

Lagerung

Vor Licht geschützt bei einer Temperatur von 5 ± 3 ^oC lagern.

2.1.7.

Etikettierung

Auf dem Etikett sind anzugeben:

—

die Wirksamkeit, ausgedrückt in internationalen Einheiten je Milliliter,

—

Bezeichnung und Menge etwa zugegebener Substanzen,

—

bei gefriergetrockneten Präparaten:

—

Bezeichnung und Menge der zuzugebenden rekonstituierenden Flüssigkeit,

—

dass das Produkt nach der Rekonstitution umgehend zu verwenden ist.

2.2.

Testmethoden

2.2.1.

Die folgenden Methoden werden offiziell als Intrakutanprobe anerkannt:

—

der Intrakutan-Monotest (einmalige Applikation von Rindertuberkulin);

—

der Simultantest (gleichzeitige Applikation von Rinder- und Geflügeltuberkulin).

2.2.2.

Injektionsdosis:

—

mindestens 2000 IE Rindertuberkulin;

—

mindestens 2000 IE Geflügeltuberkulin.

2.2.3.

Eine Injektionsdosis umfasst maximal 0,2 ml.

2.2.4.

Tuberkulinproben werden durchgeführt durch Einspritzen von Tuberkulin(en) in die Nackenhaut. Die Injektionsstellen liegen im Übergangsbereich zwischen dem ersten und mittleren Nackendrittel. Wird gleichzeitig Geflügel- und Rindertuberkulin injiziert, so liegt die Injektionsstelle für Geflügeltuberkulin ungefähr 10 cm vor oder hinter der Schulterblattgräte und für Rindertuberkulin ungefähr 12,5 cm tiefer auf einer mehr oder weniger parallel zur Schulterlinie verlaufenden Linie oder auf verschiedenen Nackenseiten. Bei Jungtieren, bei denen eine Nackenseite nicht genügend Platz zur Abgrenzung der Injektionsstellen bietet, wird das Tuberkulin beidseitig an identischen Stellen im Zentrum des mittleren Nackendrittels eingespritzt.

2.2.5.

Für die Tuberkulinproben und Reaktionsauswertung gelten folgende Verfahrensvorschriften:

2.2.5.1.

Vorgehensweise:

Die Infektionsstellen scheren und säubern. Innerhalb des geschorenen Bereichs eine Hautfalte zwischen Zeigefinger und Daumen aufziehen und mit einem Greifzirkel abmessen. Die Hautfaltendicke aufzeichnen. Die Tuberkulindosis so einspritzen, dass gewährleistet ist, dass das Tuberkulin intrakutan deponiert wurde. Dazu kann die kurze, sterile Kanüle (abgeschrägte Seite nach außen) einer graduierten, mit Tuberkulin aufgezogenen Spritze schräg in die tieferen Hautschichten eingeführt werden. Danach muss an der Injektionsstelle eine kleine, linsenförmige Quaddel palpierbar sein. Die Hautfaltendicke an jeder Injektionsstelle 72 (+/- 4 Std.) Stunden nach der Injektion messen und aufzeichnen.

2.2.5.2.

Auswertung der Reaktionen

Die Auswertung der Reaktionen erfolgt auf der Grundlage beobachteter klinischer Veränderungen und der aufgezeichneten Zunahme(n) der Hautfaltendicke an den Injektionsstellen 72 Stunden nach der Tuberkulin-Applikation.

a)

Eine negative Reaktion liegt vor, wenn nur ein begrenztes Anschwellen der Hautfaltendicke um nicht mehr als 2 mm und keine klinischen Veränderungen wie verbreitete oder ausgedehnte Ödeme, seröse Ausschwitzungen, Schorf, Schmerzempfindlichkeit oder Entzündungen der Lympfgefäße in der Umgebung der Infektionsstelle oder der Lympfknoten festzustellen sind.

b)

Eine zweifelhafte Reaktion liegt vor, wenn ein Anschwellen der Hautfaltendicke um 2 bis 4 mm und keine klinischen Veränderungen festzustellen sind.

c)

Eine positive Reaktion liegt vor, wenn klinische Veränderungen im Sinne von Buchstabe a) oder ein Anschwellen der Hautfaltendicke an der Injektionsstelle um mehr als 4 mm festzustellen sind

2.2.5.3.

Auswertung der amtlichen Intrakutanproben:

2.2.5.3.1.

Intrakutan-Monotest:

a)

positive Reaktion: eine positive Reaktion des Rindes im Sinne von Nummer 2.2.5.2 Buchstabe c);

b)

zweifelhafte Reaktion: eine zweifelhafte Reaktion im Sinne von Nummer 2.2.5.2 Buchstabe b);

c)

negative Reaktion: eine negative Reaktion des Rindes im Sinne von Nummer 2.2.5.2 Buchstabe a).

Tiere mit zweifelhafter Reaktion im Monotest werden nach frühestens 42 Tagen einem Wiederholungstest unterzogen.

Tiere, die auch im Wiederholungstest nicht negativ reagieren, gelten als positiv.

Tiere mit positiver Reaktion im Monotest können einem Simultantest unterzogen werden, wenn Verdacht auf eine falsch-positive Reaktion oder eine Störreaktion besteht.

2.2.5.3.2.

Simultantest zur Feststellung und Erhaltung des Status der amtlich anerkannten Tuberkulosefreiheit eines Bestands:

a)

positive Reaktion: eine positive Reaktion liegt vor, wenn klinische Veränderungen festzustellen sind oder das Rindertuberkulin eine Reaktion hervorruft, bei der die Hautfaltendicke um mehr als 4 mm dicker ist als bei der Reaktion des Geflügeltuberkulins;

b)

zweifelhafte Reaktion: eine zweifelhafte Reaktion liegt vor, wenn keine klinischen Veränderungen festzustellen sind und das Rindertuberkulin eine zweifelhafte oder positive Reaktion hervorruft, bei der die Hautfaltendicke um 1 bis 4 mm dicker ist als bei der Reaktion des Geflügeltuberkulins;

c)

negative Reaktion: eine negative Reaktion liegt vor, wenn keine klinischen Veränderungen festzustellen sind und das Rindertuberkulin eine negative Reaktion zur Folge hat oder eine zweifelhafte oder positive Reaktion mit einer Zunahme der Hautfaltendicke hervorruft, die gleich oder kleiner ist als eine zweifelhafte oder positive Reaktion des Geflügeltuberkulins.

Tiere mit zweifelhafter Reaktion im Simultantest werden nach frühestens 42 Tagen einem Wiederholungstest unterzogen. Tiere, die auch im Wiederholungstest nicht negativ reagieren, gelten als positiv.

2.2.5.3.3.

Der Status der amtlich anerkannten Tuberkulosefreiheit eines Bestands kann ausgesetzt und Tiere aus diesem Bestand können für den innergemeinschaftlichen Handel gesperrt werden, bis der Gesundheitsstatus folgender Tiere geklärt ist:

a)

Tiere mit zweifelhafter Reaktion im Monotest;

b)

Tiere mit positiver Reaktion im Monotest, bei denen die Tuberkulinprobe jedoch in Form eines Simultantests zu wiederholen ist;

c)

Tiere mit zweifelhafter Reaktion im Simultantest.

2.2.5.3.4.

Soweit Tiere nach geltendem Gemeinschaftsrecht vor der Umsetzung einem Intrakutantest unterzogen werden müssen, ist das Testergebnis so auszuwerten, dass Tiere mit einer Zunahme der Hautfaltendicken von mehr als 2 mm oder klinischen Veränderungen nicht in den innergemeinschaftlichen Handel gelangen.

2.2.5.3.5.

Um in einem Bestand oder einer Region möglichst viele infizierte und kranke Tiere zu ermitteln, können die Mitgliedstaaten die Kriterien für die Testauswertung ändern und die Testempfindlichkeit dahin gehend erhöhen, dass alle zweifelhaften Reaktionen im Sinne von Nummer 2.2.5.3.1 Buchstabe b) und Nummer 2.2.5.3.2 Buchstabe b) als positive Reaktionen gelten.

3.

ZUSÄTZLICHE TESTUNGEN

Um in einem Bestand oder einer Region möglichst viele infizierte und kranke Tiere zu ermitteln, können die Mitgliedstaaten zusätzlich zur Tuberkulinprobe den in Kapitel 2.3.3 (Rindertuberkulose) des OIE-Handbuchs mit Normenempfehlungen zu Untersuchungsmethoden und Vakzinen, vierte Ausgabe, 2000, vorgesehenen Gamma-Interferon-Assay genehmigen.

4.

STAATLICHE INSTITUTE UND NATIONALE REFERENZLABORATORIEN

4.1.

Aufgaben und Zuständigkeiten

Die gemäß Artikel 6a benannten staatlichen Institute, nationalen Referenzlaboratorien oder amtlichen Institute sind für die amtliche Untersuchung der in den Absätzen 2 und 3 genannten Tuberkuline oder Reagenzien in ihren jeweiligen Mitgliedstaaten zuständig und gewährleisten, dass die einzelnen Tuberkuline oder Reagenzien im Hinblick auf die in Nummer 2.1 und Absatz 3 genannten Standards jeweils angemessen sind.

4.2.

Staatliche Institute und nationale Referenzlaboratorien

AT	AGES: Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH — Institut für veterinärmedizinische Untersuchungen Mödling (Austrian Agency for Health and Consumer Protection-Institute for veterinary investigations Mödling) Robert Koch-Gasse 17 A-2340 Mödling Tel.: +43 (0) 505 55-38112 Fax: +43 (0) 505 55-38108 E-mail: vetmed.moedling@ages.at
BE	CODA — CERVA — VAR Veterinary and Agrochemical Research Centre Groeselenberg 99 B-1180 Brussels
BG	Институт за контрол на ветеринарномедицински продукти, ул. Шосе Банкя № 7, София 1331 (Institute for Control of Veterinary Medicinal Products, 7, Shousse Bankia Str., 1331 Sofia)
CY	State Veterinary Laboratory Veterinary Services 1417 Athalassa Nicosia
CZ	Státní veterinární ústav Praha – Lysolaje Sídlištní 136/24 165 03 Praha 6 – Lysolaje
DE	Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Standort Jena Naumburger Str. 96a 07743 Jena Tel. (49-3641) 804-0 Fax (49-3641) 804-228 E-Mail: poststelle@fli.bund.de
DK	National Veterinary Institute, Technical University of Denmark Bülowsvej 27 DK-1790 Copenhagen V
EE	Eesti Maaülikool Mükobakteriooside laboratoorium F.H. Kreutzwaldi 62 51014 Tartu Tel.: +372 731 3250
ES	Laboratorio Central de Sanidad Animal de Santa Fe Camino del Jau s/n Santa Fe 18320 (Granada) Tel.: +34 958 440 375/440 400 Fax: +34 958 441 200 Fulgencio Garrido Abellán E-mail: clvgr@mapya.es
FI	Finnish Food Safety Authority Animal Diseases and Food Safety Research Mustialankatu 3 FI-00790 Helsinki, Finland E-mail: info@evira.fi Tel.: +358 20 772 003 (exchange) Fax: +358 20 772 4350
FR	Laboratoire d’études et de recherches en pathologie animale et zoonoses AFSSA-LERPAZ 23, avenue du Général-de-Gaulle F-94703 Maisons-Alfort Cedex
GB	Veterinary Laboratories Agency New Haw, Addlestone, Weybridge Surrey KT15 3NB, UK Tel. (44-1932) 341111 Fax (44-1932) 347046
GR	Hellenic Ministry of Rural Development and Food Centre of Athens Veterinary Institutions Institute of infectious and parasitic diseases Department of Microbiology 25 Neapoleos Street 15 310 Ag. Paraskevi Tel.: +30 210 6010903-6399521 Fax: +30 210 6399477
HU	Mezőgazdasági Szakigazgatási Hivatal Központ, Állat-egészségügyi Diagnosztikai Igazgatóság Central Agricultural Office, Veterinary Diagnostic Directorate Address: 1149 Budapest, Tábornok u. 2. Mailing Address: 1581 Budapest, 146. Pf. 2. Tel.: +36 1 460-6300 Fax: +36 1 252-5177 E-mail: titkarsag@oai.hu
IE	Bacteriology Division Central Veterinary Research Laboratory Department of Agriculture and Food Laboratories Backweston Campus Stacumny Lane Celbridge Co. Kildare
IT	Istituto Superiore di Sanità 299 Viale Regina Elena 00161 - Roma (I) Tel. +39 06 49 90 1 Fax +39 06 49 38 71 18
LT	Nacionalinė veterinarijos laboratorija, J. Kairiūkščio g. 10, LT-2021 Vilnius
LU	CODA — CERVA — VAR Veterinary and Agrochemical Research Centre Groeselenberg 99 B-1180 Brussels
LV	Nacionālais diagnostikas centrs (National Diagnostic Centre) Lejupes iela 3, Rīga, LV-1076 Tel.: +371 7620526 Fax: +371 7620434 E-mail: ndc@ndc.gov.lv
MT	—
NL	Centraal Instituut voor DierziekteControle CIDC-Lelystad Hoofdvestiging: Houtribweg 39 Nevenvestiging: Edelhertweg 15 Postbus 2004 8203 AA Lelystad
PL	Laboratory Departament of Microbiology Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy, Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy Tel.: +48.81.886 30 51 Fax: +48.81.886 25 95 E-mail: sekretariat@piwet.pulawy.pl
PT	Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV) Estrada de Benfica, 701 P-1549-011 Lisboa
RO	Institutul pentru Controlul Produselor Biologice și Medicamentelor de Uz Veterinar Strada Dudului nr. 37, sector 6 codul 060603, București
SE	Statens Veterinärmedicinska Anstalt SE-751 89 Uppsala
SI	Univerza v Ljubljani Veterinarska fakulteta Nacionalni veterinarski inštitut Gerbičeva 60, SI-1000 Ljubljana
SK	Štátny veterinárny a potravinový ústav Akademická 3 SK-949 01 Nitra