BESTIMMUNG DES SITOSTERIN- ODER DES STIGMASTERIN-GEHALTS IN BUTTER ODER BUTTERFETT DURCH KAPILLARSÄULEN-GASCHROMATOGRAFIE

1.

GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH

Die Methode beschreibt ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Sitosterin bzw. Stigmasterin in Butterfett und Butter. Sitosterin ist dabei die Summe von β-Sitosterin und 22-Dihydro-β-Sitosterin; die anderen Sitosterine werden als unbedeutend betrachtet.

2.

KURZBESCHREIBUNG

Das Butterfett bzw. die Butter wird mit ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift. Die unverseifbaren Bestandteile werden mit Ether extrahiert. Die Sterine werden zu Trimethylsilylethern derivatisiert und durch Kapillarsäulen-Gaschromatografie mit Betulin als interner Standardprobe analysiert.

3.

APPARATUR

3.1. 150-ml-Verseifungskolben mit Rückflusskühler und Schliffverbindungen

3.2. 500-ml- Scheidetrichter

3.3. 250-ml-Kolben

3.4. Druckausgleichtrichter (etwa 250 ml) zum Auffangen von überschüssigem Ether

3.5. Glassäule, 350 mm × 20 mm, mit Sinterglasfritte

3.6. Wasserbad oder Heizhaube

3.7. Reaktionsglas, 2 ml

3.8. Zur Verwendung mit einer Kapillarsäule geeigneter Gaschromatograf, ausgerüstet mit einem „Split-System” und folgenden Bestandteilen:

3.8.1. Säulenofen, der die gewünschte Temperatur mit einer Genauigkeit von ±1 °C halten kann;

3.8.2. Verdampfer mit einstellbarer Temperatur;

3.8.3. Flammenionisationsdetektor und einem Signal-Verstärker;

3.8.4. Aufzeichnungsgerät mit Integrator für den Signal-Verstärker (3.8.3).

3.9. Quarzglas-Kapillarsäule, vollständig mit BP1 oder einem gleichwertigen Material beschichtet (oder eine sonstige Säule mit mindestens gleicher Auflösung) mit einheitlicher Stärke von 0,25 μm; die Säule muss die Trimethylsilylderivate von Lanosterin und Sitosterin trennen können. Geeignet ist eine mit BP 1 beschichtete Säule von 12 m Länge und 0,2 mm Innendurchmesser.

3.10. 1-μl-Gaschromatografie-Mikrospritze mit gehärteter Nadel.

4.

REAGENZIEN

Alle Reagenzien müssen analysenrein sein. Das verwendete Wasser muss destilliert sein oder einen mindestens gleichwertigen Reinheitsgrad aufweisen.

4.1. Ethanol, Reinheitsgrad mindestens 95 %

4.2. 60 %ige Kaliumhydroxid-Lösung (600 g Kaliumhydroxid (mindestens 85 %) werden in Wasser gelöst; die Lösung wird anschließend mit Wasser bis auf einen Liter aufgefüllt

4.3. Betulin, Reinheitsgrad mindestens 99 %

4.3.1. Betulinlösungen in Diethylether (4.4)

4.3.1.1. Die zur Bestimmung von Sitosterin verwendete Betulinlösung muss eine Konzentration von 1,0 mg/ml aufweisen.

4.3.1.2. Die zur Bestimmung von Stigmasterin verwendete Betulinlösung muss eine Konzentration von 0,4 mg/ml aufweisen.

4.4. Diethylether, analysenrein (frei von Peroxiden oder Rückständen)

4.5. Natriumsulfat, wasserfrei, granular, zuvor 2 Stunden bei 102 °C getrocknet

4.6. Silylierungsreagens, z. B. TRI-SIL (erhältlich von Pierce Chemical Co., Kat.-Nr. 49001) oder vergleichbares Reagenz. (Achtung: TRI-SIL ist entflammbar, giftig, ätzend und potenziell kanzerogen. Das Laborpersonal muss mit den Sicherheitsdaten zu TRI-SIL vertraut sein und die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen treffen.)

4.7. Lanosterol

4.8. Sitosterin, bekannter Reinheitsgrad mindestens 90 % (P)

Anmerkung 1: Die Reinheit der Standardstoffe für die Kalibrierung ist durch Normalisierung zu bestimmen. Dazu wird angenommen, dass das Chromatogramm alle in der Probe vorhandenen Sterine wiedergibt, dass die Gesamtfläche der Peaks 100 % der Sterinbestandteile darstellt und dass alle Sterine ein gleich starkes Detektorsignal hervorrufen. Es ist sicherzustellen, dass das System in den maßgeblichen Konzentrationsbereichen linear verläuft.

4.8.1. Sitosterin-Standardlösung: Sitosterin (4.8) wird in Diethylether (4.4) mit einer Konzentration von etwa 0,5 mg/ml (Genauigkeit 0,001 mg/ml) gelöst;

4.9. Stigmasterin, bekannter Reinheitsgrad mindestens 90 % (P);

4.9.1. Stigmasterin-Standardlösung: Stigmasterin (4.9) wird in Diethylether (4.4) mit einer Konzentration von etwa 0,2 mg/ml (Genauigkeit 0,001 mg/ml) gelöst;

4.10. Testlösung für die Prüfung der Auflösung: Lanosterin (4.7) (0,05 mg/ml) und Sitosterin (4.8) (0,5 mg/ml) werden in Diethylether (4.4) gelöst.

5.

METHODE

5.1.

Herstellung der Standardlösungen für die Chromatografie:

Die interne Standardlösung (4.3.1) muss der entsprechenden Sterin-Standardlösung und der verseiften Probe gleichzeitig zugesetzt werden (siehe 5.2.2).

5.1.1. Sitosterin-Standardlösung für die Chromatografie: je 1 ml der Sitosterin-Standardlösung (4.8.1) werden in 2 Reaktionsgläser (3.7) gegeben; der Ether ist durch einen Stickstoffstrom zu entfernen. 1 ml der internen Standardlösung (4.3.1.1) werden hinzugegeben und der Ether durch einen Stickstoffstrom entfernt.

5.1.2. Stigmasterin-Standardlösung für die Chromatografie: je 1 ml der Stigmasterin-Standardlösung (4.9.1) wird in 2 Reaktionsgläser (3.7) gegeben und der Ether durch einen Stickstoffstrom entfernt. 1 ml der internen Standardlösung (4.3.1.2) wird hinzugegeben und der Ether durch einen Stickstoffstrom entfernt.

5.2.

Vorbereitung der unverseifbaren Bestandteile

5.2.1. Die Butterprobe wird bei höchstens 35 °C geschmolzen und unter Rühren gründlich durchgemischt. Ungefähr 1 g Butter (W₂) oder Butterfett (W₂) werden auf 1 mg genau in einen 150-ml-Kolben (3.1) eingewogen. 50 ml Ethanol (4.1) und 10 ml Kaliumhydroxid-Lösung (4.2) werden hinzugegeben. Der Rückflusskühler wird angebracht und 30 Minuten auf etwa 75 °C erhitzt. Der Kühler wird abgenommen; danach wird gewartet, bis sich der Kolben auf Raumtemperatur abgekühlt hat.

5.2.2. 1,0 ml der internen Standardlösung (4.3.1.1 bei der Bestimmung von Sitosterin bzw. 4.3.1.2 bei der Bestimmung von Stigmasterin) werden in den Kolben gegeben. Die Lösung wird gründlich gemischt. Der Inhalt des Kolbens wird quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter (3.2) gegeben, in dem der Kolben nacheinander mit 50 ml Wasser und 250 ml Diethylether (4.4) ausgespült wird. Der Scheidetrichter wird zwei Minuten kräftig geschüttelt; anschließend wird die Phasentrennung abgewartet. Die untere Wasserschicht wird abgelassen und die Etherschicht viermal mit je 100 ml Wasser ausgeschüttelt.

Anmerkung 2: Damit keine Emulsion entsteht, ist es wichtig, die ersten beiden Waschvorgänge mit Wasser vorsichtig auszuführen (10 Drehungen). Beim dritten Waschvorgang kann 30 Sekunden lang kräftig geschüttelt werden. Sollte sich eine Emulsion bilden, kann diese durch Zugabe von 5-10 ml Ethanol aufgelöst werden. Bei Zugabe von Ethanol muss unbedingt noch zweimal kräftig mit Wasser ausgeschüttelt werden.

5.2.3. Die klare seifenfreie Etherschicht wird durch eine Glassäule (3.5) mit 30 g wasserfreiem Natriumsulfat (4.5) eluiert. Der Ether wird in einem 250-ml-Kolben (3.3) aufgefangen. Ein Siedesteinchen wird hinzugegeben; anschließend wird die Flüssigkeit auf einem Wasserbad oder einer Heizhaube fast bis zur völligen Trockenheit eingedampft; dabei wird das überschüssige Lösungsmittel aufgefangen.

Anmerkung 3: Werden die Probenextrakte bei zu hoher Temperatur vollständig getrocknet, können Sterinverluste auftreten.

5.3.

Vorbereitung der Trimethylsilylether

5.3.1. Die im Kolben verbliebene Etherlösung mit 2 ml Ether wird in ein 2-ml-Reaktionsglas (3.7) gegeben und der Ether durch einen Stickstoffstrom entfernt. Der Kolben wird mit 2 weiteren 2-ml-Aliquoten Ether ausgespült; dabei wird jeweils der Inhalt in das Reaktionsglas umgefüllt und der Ether durch einen Stickstoffstrom entfernt.

5.3.2. Die Probe wird durch Zugabe von 1 ml TRI-SIL (4.6) silyliert. Das Glas wird verschlossen und kräftig geschüttelt, damit sich die Probe auflöst. Wenn sich die Probe nicht vollständig auflöst, wird die Probe auf 65-70 °C erwärmt. Danach wird die Probe mindestens fünf Minuten stehen gelassen, bevor sie in den Gaschromatografen injiziert wird. Die Standardlösungen werden in gleicher Weise wie die Proben silyliert. Die Mischung zur Prüfung der Auflösung (4.10) wird ebenfalls in gleicher Weise wie die Proben silyliert.

Anmerkung 4: Die Silylierung ist in wasserfreier Umgebung vorzunehmen. Die unvollständige Silylierung von Betulin wird durch einen zweiten Peak dicht neben dem von Betulin angezeigt.

Ethanol-Rückstände in der Silylierungsphase können die Silylierung beeinträchtigen. Möglicherweise wurde in der Extraktionsphase nicht hinreichend gespült. In diesem Fall muss bei der Extraktion ein fünftes Mal gespült werden (30 Sekunden kräftiges Schütteln).

5.4.

Analyse durch Gaschromatografie

5.4.1.

Herstellung der Arbeitsbedingungen

Der Gaschromatograf wird gemäß der Herstelleranweisung vorbereitet. Als Leitlinie gelten die folgenden Arbeitsbedingungen:

—

Säulentemperatur: 265 °C

—

Injektortemperatur: 265 °C

—

Detektortemperatur: 300 °C

—

Durchflussgeschwindigkeit des Trägergases: 0,6 ml/min

—

Wasserstoffdruck: 84 kPa

—

Luftdruck: 155 kPa

—

Splitverhältnis: 10:1 bis 50:1; das Splitverhältnis ist nach den Herstelleranweisungen zu optimieren; anschließend wird die Linearität des Detektorsignals im interessierenden Konzentrationsbereich überprüft.

Anmerkung 5: Es ist unbedingt darauf zu achten, dass die Injektionsröhre regelmäßig gereinigt wird.

—

Menge der eingespritzten Substanz: 1 μl TMSE-Lösung.

Vor Beginn jeglicher Analysen muss gewartet werden, bis das System äquilibriert ist und ein hinreichend stabiles Response-Signal liefert. Diese Bedingungen können je nach Beschaffenheit der Säule und des Gaschromatografen abgewandelt werden, damit Chromatogramme entstehen, die den folgenden Anforderungen genügen:

—

Der Sitosterin-Peak muss vom Lanosterin-Peak genügend abgesetzt sein. Abbildung 1 zeigt ein typisches Chromatogramm, das sich aus der silylierten Testlösung zur Prüfung der Auflösung ergeben sollte (4.10).

—

Die relativen Retentionszeiten der folgenden Sterine sollten ungefähr betragen:

Cholesterin: 1,0

Stigmasterin: 1,3

Sitosterin: 1,5

Betulin: 2,5

—

Die Retentionszeit für Betulin sollte etwa 24 Minuten betragen.

5.4.2.

Analyseverfahren

1 μl der silylierten Standardlösung (Stigmasterin bzw. Sitosterin) wird eingespritzt; danach sind die Parameter für die Kalibrierung des Integrators einzustellen. Darauf wird nochmals 1 μl der silylierten Standardlösung eingespritzt, um die Response-Faktoren in Bezug auf Betulin zu bestimmen. 1 μl der silylierten Probelösung wird eingespritzt; danach werden die Peak-Flächen gemessen. Am Anfang und am Ende einer jeden gaschromatografischen Analysenfolge muss die Standardlösung eingespritzt werden. Als Leitlinie sollte nach je sechs Probelösungen die Standardlösung eingespritzt werden.

Anmerkung 6: Bei der Integration des Stigmasterin-Peaks ist auch das durch die Punkte 1, 2 und 3 in Abbildung 2b markierte Tailing mit zu erfassen.

Bei der Integration des Sitosterin-Peaks ist die Fläche des Peaks von 22-Dihydro-β-Sitosterin (Stigmastanin), das unmittelbar nach Sitosterin eluiert wird, mit zu erfassen, wenn das gesamte Sitosterin berechnet werden soll.

6.

BERECHNUNG DER ERGEBNISSE

6.1. Die Fläche der Sterin-Peaks und der Betulin-Peaks für die zu Beginn und am Ende eines Durchlaufs eingespritzten Standardlösungen bestimmen und R₁ berechnen: R₁ = (durchschnittliche Fläche des Sterin-Peaks der Standardlösung)/(durchschnittliche Fläche des Betulin-Peaks der Standardlösung) Die Fläche des Sterin-Peaks (Stigmasterin und Sitosterin) und des Betulin-Peaks der Probe werden bestimmt, und R₂ wird berechnet: R₂ = (Fläche des Sterin-Peaks der Probe)/(Fläche des Betulin-Peaks der Probe)

W₁=

Steringehalt der Standardprobe (mg) in 1 ml Standardlösung (4.8.1 oder 4.9.1)

W₂=

Gewicht der Probe (g) (5.2.1)

P=

Reinheitsgrad des Standardsterins (4.8 oder 4.9)

Steringehalt der Probe (mg/kg) = ((R₂) / (R₁)) × ((W₁) / (W₂)) × P × 10

7.

GENAUIGKEIT DER METHODE

7.1.

Butter

7.1.1.

Wiederholbarkeit

7.1.1.1.

Stigmasterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 19,3 mg/kg voneinander abweichen.

7.1.1.2.

Sitosterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 23,0 mg/kg voneinander abweichen.

7.1.2.

Vergleichbarkeit

7.1.2.1.

Stigmasterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 31,9 mg/kg voneinander abweichen.

7.1.2.2.

Sitosterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 8,7 % des Durchschnitts der Bestimmungen voneinander abweichen.

7.1.3.

Herkunft der Präzisionsdaten

Die Präzisionsdaten stammen aus einem 1992 durchgeführten Versuch, an dem 8 Laboratorien beteiligt waren und bei dem 6 Proben (3 Blindproben) auf Stigmasterin und 6 Proben (3 Blindproben) auf Sitosterin untersucht wurden.

7.2.

Butterfett

7.2.1.

Wiederholbarkeit

7.2.1.1.

Stigmasterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 10,2 mg/kg voneinander abweichen.

7.2.1.2.

Sitosterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 3,6 % des Durchschnitts der Bestimmungen voneinander abweichen.

7.2.2.

Vergleichbarkeit

7.2.2.1.

Stigmasterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 25,3 mg/kg voneinander abweichen.

7.2.2.2.

Sitosterin

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 8,9 % des Durchschnitts der Bestimmungen voneinander abweichen.

7.2.3.

Herkunft der Präzisionsdaten

Die Präzisionsdaten stammen aus einem 1991 durchgeführten Versuch, an dem neun Laboratorien beteiligt waren und bei dem 6 Proben (3 Blindproben) auf Stigmasterin und 6 Proben (3 Blindproben) auf Sitosterin untersucht wurden.

8.

TOLERANZBEREICH

8.1. Zur Prüfung der richtigen Kennzeichnung des Erzeugnisses sind dem gekennzeichneten Erzeugnis drei Proben zu entnehmen.

8.2.

Butter

8.2.1.

Stigmasterin

8.2.1.1. Der Beimischungsanteil für Stigmasterin beträgt 150 g bei mindestens 95 % reinem Stigmasterin je Tonne Butter, d. h. 142,5 mg/kg, bzw. 170 g bei mindestens 85 % reinem Stigmasterin je Tonne Butter, d. h. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2. Die in der Produktanalyse für die drei Proben ermittelten Ergebnisse werden verwendet, um die Quote und die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels zu prüfen; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—

115,8 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 95 % reinem Sitosterin),

—

117,7 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 85 % reinem Stigmasterin).

—

80,1 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 95 % reinem Stigmasterin),

—

81,5 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 85 % reinem Stigmasterin).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das durch Interpolierung zwischen 115,8 mg/kg und 80,1 mg/kg bzw. 117,7 mg/kg und 81,5 mg/kg ermittelt wurde.

8.2.2.

Sitosterin

8.2.2.1. Der Beimischungsanteil für Sitosterin beträgt 600 g bei mindestens 90 % reinem Sitosterin je Tonne Butter, d. h. 540 mg/kg.

8.2.2.2. Die in der Produktanalyse für die drei Proben ermittelten Ergebnisse werden verwendet, um die Quote und die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels zu prüfen; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—

482,6 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 90 % reinem Sitosterin),

—

347,6 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 90 % reinem Sitosterin).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 482,6 mg/kg und 347,6 mg/kg erhält.

8.3.

Butterfett

8.3.1.

Stigmasterin

8.3.1.1. Der Beimischungsanteil für Sitosterin beträgt 150 g bei mindestens 95 % reinem Sitosterin je Tonne Butterfett, d. h. 142,5 mg/kg oder 170 g bei mindestens 85 % reinem Stigmasterin je Tonne Butterfett, d. h. 144,5 mg/kg

8.3.1.2. Aufgrund der Ergebnisse der drei in der Produktanalyse untersuchten Proben wird die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels geprüft; das niedrigste Ergebnis wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—

118,5 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 95 % reinem Sitosterin),

—

120,4 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 85 % reinem Stigmasterin),

—

82,9 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 95 % reinem Stigmasterin),

—

84,3 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 85 % reinem Stigmasterin).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 118,5 mg/kg und 82,9 mg/kg bzw. 120,4 mg/kg und 84,3 mg/kg erhält.

8.3.2.

Sitosterin

8.3.2.1. Der Beimischungsanteil für Sitosterin beträgt 600 g bei mindestens 90 % reinem Sitosterin je Tonne Butterfett, d. h. 540 mg/kg.

8.3.2.2. Aufgrund der Ergebnisse der drei in der Produktanalyse untersuchten Proben wird die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels geprüft; das niedrigste Ergebnis wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—

480,9 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 90 % reinem Sitosterin),

—

345,9 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 90 % reinem Sitosterin).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 480,9 mg/kg und 345,9 mg/kg erhält.

Abbildung 1

Wünschenswert ist eine vollständige Auflösung, d. h. der Peak-Verlauf muss zur Basislinie zurückführen, bevor der nächste Sitosterin-Peak beginnt; allerdings ist auch eine unvollständige Auflösung annehmbar.

Hinweis: Die Integration des Stigmasterin-Peaks muss etwaige Tailings gemäß den Ziffern 1, 2 und 3 beinhalten.

Abbildung 2a	Abbildung 2b
Stigmasterol standard	Butter sample denatured with stigmasterol

Hinweis: β-Sitosterin enthält häufig eine Verunreinigung (als Stigmastanol), die unmittelbar nach dem β-Sitosterin eluiert. Die Flächen dieser beiden Peaks sind bei der Bewertung des Gesamtgehalts an β-Sitosterin zusammenzufassen.

Abbildung 3a	Abbildung 3b
Sistosterol standard	Butter sample denatured with β-Sitosterol