ANHANG III VO (EG) 2009/152

ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER ZUSAMMENSETZUNG VON FUTTERMITTEL-AUSGANGSERZEUGNISSEN UND MISCHFUTTERMITTELN

A.

BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS

1.

Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Feuchtigkeitsgehalt von Futtermitteln bestimmen. Bei Futtermitteln, die flüchtige Stoffe wie z. B. organische Säuren enthalten, ist zu beachten, dass zusammen mit dem Feuchtigkeitsgehalt auch eine bedeutende Anzahl an flüchtigen Stoffen bestimmt wird. Sie betrifft nicht die Untersuchung von Milcherzeugnissen als Futtermittel-Ausgangserzeugnisse und von Mischfuttermitteln, die überwiegend aus Milcherzeugnissen bestehen, die Untersuchung von tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen oder die Untersuchung von Ölsaaten und Ölfrüchten. Die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts bei Ölsaaten muss nach dem Verfahren gemäß EN ISO 665 — Bestimmung des Feuchtegehaltes und des Gehaltes an flüchtigen Bestandteilen — erfolgen, wobei Sojabohnen vor der Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts zu zermahlen sind.

2.
Prinzip

Die Probe wird unter definierten Bedingungen getrocknet, die von der Art des Futtermittels abhängen. Der Gewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt. Bei festen Futtermitteln mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt ist eine zusätzliche Vortrocknung erforderlich.

3.
Geräte

3.1.: Zerkleinerungsgerät aus einem Material, das keine Feuchtigkeit absorbiert, leicht zu reinigen ist, eine schnelle und gleichmäßige Zerkleinerung ermöglicht, ohne eine merkliche Erwärmung hervorzurufen, das so weit wie möglich den Kontakt mit der Außenluft verhindert und den unter Nummer 4.1.1 und 4.1.2 gestellten Anforderungen entspricht (z. B. Mikroschlagkreuzmühlen, Mikrozerkleinerer mit Wasserkühlung, zerlegbare Kegelmühlen, langsam laufende Kegelmühlen oder Zahnscheibenmühlen).

3.2.: Analysenwaage, Genauigkeit 1 mg.

3.3.: Trockene Gefäße aus korrosionsbeständigem Metall oder Glas, mit luftdicht schließenden Deckeln; die Nutzfläche muss eine Verteilung der Analysenprobe von ca. 0,3 g/cm² ermöglichen.

3.4.: Elektrisch beheizter, temperaturgeregelter Trockenschrank (± 2 °C), der eine schnelle Regelung der Temperatur gewährleistet und eine gute Lüftung besitzt⁽¹⁾.

3.5.: Elektrisch beheizter regulierbarer Vakuumtrockenschrank mit einer Ölpumpe, der entweder mit einer Vorrichtung für die Zufuhr warmer und getrockneter Luft oder mit einem Trocknungsmittel (z. B. Calciumoxid) ausgestattet ist.

3.6.: Exsikkator mit dicker, perforierter Platte aus Metall oder Porzellan, der ein wirksames Trocknungsmittel enthält.

4.
Verfahren

Anmerkung:: Die Verfahren, die in diesem Abschnitt beschrieben werden, müssen unverzüglich nach dem Öffnen der Packungen, die die Proben enthalten, durchgeführt werden. Die Analysen sind mindestens doppelt auszuführen.

4.1.
Vorbereitung

4.1.1.
Futtermittel, außer den unter Nummer 4.1.2 und 4.1.3 genannten

Mindestens 50 g der Probe werden entnommen und erforderlichenfalls unter Vermeidung von Feuchtigkeitsänderungen entsprechend zerkleinert oder geteilt (siehe Nummer 6).

4.1.2.
Getreide und Grütze

Mindestens 50 g der Probe werden entnommen Diese Menge wird so zermahlen, dass zumindest 50 % der Teilchen durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 mm passiert werden können und dass beim Passieren durch ein Rundlochsieb mit einem Lochdurchmesser von 1 mm ein Rückstand von höchstens 10 % verbleibt.

4.1.3.
Flüssige oder breiige Futtermittel; Futtermittel, die überwiegend aus Ölen und Fetten bestehen

Etwa 25 g der Probe, auf 10 mg genau gewogen, werden entnommen, mit einer entsprechenden, auf 10 mg genau gewogenen Menge wasserfreiem Sand vermischt, bis ein homogenes Produkt entsteht.

4.2.
Trocknung

Ein Gefäß (Nummer 3.3) wird mit seinem Deckel im auf 103 °C eingestellten Trockenschrank 30 min ± 1 min lang getrocknet. Es wird aus dem Trockenschrank genommen und im Exsikkator (Nummer 3.6) auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen.

4.2.1.
Futtermittel, außer den unter Nummer 4.2.2 und 4.2.3 genannten

Das Gefäß wird mit seinem Deckel auf 1 mg genau gewogen. Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 103 °C vorgeheizten Trockenschrank gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Es wird 4 h lang getrocknet, wobei die Trocknungszeit von dem Zeitpunkt an gerechnet wird, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 103 °C erreicht hat. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort wieder mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, zum Abkühlen 30 bis 45 min lang in den Exsikkator (Nummer 3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen. Bei Futtermitteln, die überwiegend (> 50 %) aus Ölen und Fetten tierischen und pflanzlichen Ursprungs bestehen, wird eine zusätzliche Trocknung von 30 min im Trockenschrank bei 103 °C vorgenommen. Der Unterschied zwischen den beiden Wägeergebnissen darf höchstens 0,1 % Feuchtigkeit betragen.

4.2.2.
Getreide, Mehl, Grütze und Grieß

Das Gefäß wird mit seinem Deckel auf 0,5 mg genau gewogen. Etwa 5 g der zerkleinerten Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 130 °C vorgeheizten Trockenschrank gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Es wird 2 h lang getrocknet, wobei die Trocknungszeit von dem Zeitpunkt an gerechnet wird, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 130 °C erreicht hat. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort wieder mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, zum Abkühlen 30 bis 45 min lang in den Exsikkator (Nummer 3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen.

4.2.3.
Mischfuttermittel mit einem Saccharose- oder Lactosegehalt von mehr als 4 %: Futtermittel-Ausgangserzeugnisse wie z. B. Johannisbrotschrot, hydrolysierte Getreideerzeugnisse, Malzkeime, Zuckerrübenschnitzel, Fisch- und Zuckerpresssäfte

Das Gefäß wird mit seinem Deckel auf 0,5 mg genau gewogen. Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 80 bis 85 °C vorgeheizten Vakuumtrockenschrank (Nummer 3.5) gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Der Druck wird auf 100 Torr eingestellt. Die Probe wird 4 h lang bei diesem Druck entweder unter Zufuhr von heißer trockener Luft oder mittels eines Trocknungsmittels (etwa 300 g für 20 Proben) getrocknet. Im letzteren Fall wird beim Erreichen des vorgeschriebenen Drucks die Verbindung zur Vakuumpumpe unterbrochen. Die Trocknungszeit wird von dem Zeitpunkt an gerechnet, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 80 bis 85 °C erreicht hat. Nach Ablauf der Trocknungszeit wird der Trockenschrank vorsichtig wieder auf atmosphärischen Druck gebracht. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort wieder mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, zum Abkühlen 30 bis 45 min lang in den Exsikkator (Nummer 3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen. Es wird im Vakuumtrockenschrank weitere 30 min bei 80 bis 85 °C getrocknet und erneut gewogen. Der Unterschied zwischen den beiden Wägeergebnissen darf höchstens 0,1 % Feuchtigkeit betragen.

4.3.
Vortrocknung (Teiltrocknung)

„Nasse” Futtermittel mit einem Massenanteil von weniger als 85 % Trockenmasse (z. B. Grünfutter, Gesamtmischrationen, (nicht)flüssige Futtermittel) müssen vor dem Feinzermahlen teilgetrocknet werden, um ihre stabilen Stoffe untersuchen zu können; bei instabilen Stoffen ist keine Teiltrocknung möglich. Die Teiltrocknung kann entweder mithilfe eines Trockenschranks mit Luftumwälzung oder eines Mikrowellengeräts oder durch Gefriertrocknen erfolgen. Außer beim Teiltrocknen durch Gefriertrocknen geht es darum, das Futtermittel zu trocknen und gleichzeitig die Probentemperatur unter 60 °C zu halten, damit die chemische Zusammensetzung nur minimal beeinträchtigt wird. Eine Trocknung bei Temperaturen über 60 °C führt zu chemischen Veränderungen im Futter (z. B. Proteinabbau). Das getrocknete Futtermittel wird bei Raumtemperatur 15 min lang äquilibriert, anschließend wird die teilgetrocknete Masse gemessen, um eine potenzielle Veränderung des Feuchtigkeitsgehalts, die während des Zermahlens und der Lagerung auftreten kann, so gering wie möglich zu halten. Beim Trocknen bei Temperaturen unter 60 °C wird dem Futtermittel nicht das gesamte Wasser entzogen; daher lässt sich mithilfe der (ersten) Teiltrocknung nicht die Gesamttrockenmasse des Futtermittels bestimmen. Nach dem Trocknen wird die Teilprobe zermahlen und im Rahmen der Bestimmung der anderen chemischen Bestandteile auf die (endgültige) Trockenmasse der teilgetrockneten Probe untersucht (3-15 % Restfeuchte). Daher wird zur Bestimmung der Trockenmasse ein zweistufiges Verfahren empfohlen. Zunächst wird der Gehalt der teilgetrockneten Masse bestimmt (bei weniger als 85 % Trockenmasse), dann wird der verbleibende Trockenmassegehalt anhand einer zermahlenen Analysenprobe bestimmt und die teilgetrocknete Masse wird mit der verbleibenden Trockenmasse multipliziert, um den Gesamttrockenmassegehalt zu bestimmen.

5.
Berechnung der Ergebnisse

Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgenden Formeln berechnet:

5.1.
Trocknung ohne Vortrocknung

Xm – m0m × 100 wobei:

m=: Anfangsgewicht der Analysenprobe in g,
m₀=: Gewicht der trockenen Analysenprobe in g.

5.2.
Trocknung mit Vortrocknung⁽²⁾

Xpm2 – m0 × m1m2m – m1 ×100m100 × 1 –m1 × m0m × m2 wobei:

m=: Anfangsgewicht der Analysenprobe in g,
m₁=: Gewicht der Analysenprobe nach der Vortrocknung in g,
m₂=: Gewicht der Analysenprobe nach der Zerkleinerung oder dem Zermahlen in g,
m₀=: Gewicht der trockenen Analysenprobe in g.

5.3.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,2 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten, außer bei Nassfutter für Heimtiere und Kauspielzeug für Hunde, wo die Differenz 0,5 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten darf.

6.
Bemerkung

Wenn eine Zerkleinerung sich als notwendig erweist und dabei mit einer Änderung des Feuchtigkeitsgehalts des Materials gerechnet werden muss, so sind die Analyseergebnisse, die die Bestandteile des Futtermittels betreffen, auf den Feuchtigkeitsgehalt der Originalprobe umzurechnen.

B.
BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS IN TIERISCHEN UND PFLANZLICHEN FETTEN UND ÖLEN

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt an Wasser und flüchtigen Stoffen in tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen bestimmen.

2.
Prinzip

Die Probe wird bei 103 °C getrocknet, bis kein Gewichtsverlust mehr eintritt (der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 1 mg nicht überschreiten). Der Gewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt.

3.
Geräte

3.1.: Schale mit flachem Boden, aus korrosionsbeständigem Material, Durchmesser: 8 bis 9 cm, Höhe ca. 3 cm.

3.2.: Thermometer mit verstärkter Kugel und Ausdehnungsraum am oberen Ende, von ca. 80 bis mindestens 110 °C graduiert, Länge ca. 10 cm.

3.3.: Sandbad oder elektrische Heizplatte.

3.4.: Exsikkator, der ein wirksames Trocknungsmittel enthält.

3.5.: Analysenwaage.

4.
Verfahren

Etwa 20 g der homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau in die trockene, gewogene Schale (Nummer 3.1.) eingewogen, die das Thermometer (Nummer 3.2) enthält, und auf dem Sandbad oder der elektrischen Heizplatte (Nummer 3.3) unter ständigem Rühren mit dem Thermometer so erhitzt, dass in ca. 7 min eine Temperatur von 90 °C erreicht wird Entsprechend der Häufigkeit, mit der Gasblasen vom Boden der Schale aufsteigen, wird die Heizintensität verringert. Die Temperatur darf 105 °C nicht überschreiten. Unter ständigem Abkratzen des Bodens der Schale wird weiter umgerührt, bis sich keine Blasen mehr bilden. Um sicherzustellen, dass keine Feuchtigkeit mehr vorhanden ist, wird mehrmals auf 103 °C ± 2 °C erhitzt und zwischen aufeinanderfolgenden Erhitzungen jeweils auf 93 °C gekühlt. Anschließend wird bis zur Raumtemperatur im Exsikkator (Nummer 3.4) abkühlen gelassen und gewogen. Dieses Verfahren ist so oft zu wiederholen, bis der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen 2 mg nicht mehr überschreitet.

Anmerkung:: Eine Gewichtserhöhung der Probe nach wiederholter Erwärmung zeigt eine Oxidation des Fettes an. In diesem Fall wird der Berechnung das Ergebnis der Wägung zugrunde gelegt, die unmittelbar vor dem Auftreten der Gewichtszunahme ausgeführt wurde.

5.
Berechnung der Ergebnisse

Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgender Formel berechnet: Xm1 – m2 ×100m wobei:

m=: Probeneinwaage in g,
m₁=: Gewicht der Schale mit Inhalt in g vor dem Erhitzen,
m₂=: Gewicht der Schale mit Inhalt in g nach dem Erhitzen.

Ergebnisse unter 0,05 % sollten mit der Bezeichnung „weniger als 0,05 %” angegeben werden.

Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,1 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten.

C.
BESTIMMUNG DES STICKSTOFFGEHALTS UND BERECHNUNG DES ROHPROTEINGEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Rohproteingehalt von Futtermitteln anhand des nach Kjeldahl bestimmten Stickstoffgehalts⁽³⁾ bestimmen.

2.
Prinzip

Die Probe wird durch Schwefelsäure in Anwesenheit eines Katalysators aufgeschlossen. Der saure Aufschluss wird durch eine Natriumhydroxidlösung alkalisiert. Das Ammoniak wird durch Destillation abgetrennt und in einer definierten Menge Schwefelsäure aufgefangen, deren Überschuss durch eine Standard-Natriumhydroxidlösung titriert wird. Alternativ wird das freigesetzte Ammoniak in überschüssiger Borsäurelösung destilliert, gefolgt von einer Titration mit Salz- oder Schwefelsäurelösung.

3.
Reagenzien

3.1.: Kaliumsulfat.

3.2.: Katalysator: Kupfer(II)-oxid, CuO, oder Kupfer(II)-sulfatpentahydrat, CuSO4 5H2O.

3.3.: Zinkgranulat.

3.4.: Schwefelsäure, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.: Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H₂SO₄) = 0,25 mol/l.

3.6.: Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H₂SO₄) = 0,10 mol/l.

3.7.: Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H₂SO₄) = 0,05 mol/l.

3.8.: Methylrot-Indikator: 300 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol (σ = 95 bis 96 %) gelöst.

3.9.: Natriumhydroxidlösung (Verwendung technischer Qualität möglich), β = 40 g/100 ml (40 %).

3.10.: Natriumhydroxid, volumetrische Standardlösung, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.: Natriumhydroxid, volumetrische Standardlösung, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.: Bimssteinkörner, mit Salzsäure gewaschen und geglüht.

3.13.: Acetanilid (Schmelzpunkt = 114 °C, N-Gehalt = 10,36 %).

3.14.: Saccharose (stickstofffrei).

3.15.: Borsäure (H₃BO₃).

3.16.: Methylrot-Indikatorlösung: 100 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol oder Methanol gelöst.

3.17.: Bromkresolgrünlösung: 100 mg Bromkresolgrün werden in 100 ml Ethanol oder Methanol gelöst.

3.18.

Borsäurelösung (10 bis 40 g/l in Abhängigkeit vom eingesetzten Gerät)

Bei einer kolorimetrischen Endpunktbestimmung sind der Borsäurelösung Methylrot- und Bromkresolindikatoren zuzufügen. Wird 1 l Borsäurelösung zubereitet, sind vor dem Auffüllen zur Marke 7 ml Methylrot-Indikatorlösung (Nummer 3.16) und 10 ml Bromkresolgrünlösung (Nummer 3.17) zuzufügen.

In Abhängigkeit von dem verwendeten Wasser kann sich der pH-Wert von einer Borsäurelösung zur anderen unterscheiden. Der pH-Wert der Borsäurelösung muss zwischen 4,3 und 4,7 liegen. Häufig ist eine Einstellung des pH-Werts mithilfe einer geringen Menge Alkali erforderlich, um eine positive Blindprobe zu erhalten.

Anmerkung:: Eine Zugabe von rund 3 ml bis 4 ml NaOH (Nummer 3.11) zu 1 l Borsäure von 10 g/l führt in der Regel zu guten Einstellungen. Die Lösung ist bei Raumtemperatur aufzubewahren und während der Aufbewahrung vor Lichteinfall und Ammoniakdämpfen zu schützen.

3.19.

Salzsäure, volumetrische Standardlösung, c(HCl) = 0,10 mol/l.

Anmerkung:: Andere Konzentrationen volumetrischer Lösungen (Nummer 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 und 3.19) können verwendet werden, sofern die Berechnungen entsprechend berichtigt werden. Die Konzentrationen sind stets auf 4 Dezimalstellen genau anzugeben.

4.
Geräte

Für Aufschluss, Destillation und Titration nach dem Kjeldahl-Verfahren geeignete Geräte.

5.
Verfahren

5.1.
Aufschluss

Von der Probe wird 1 g auf 0,001 g genau gewogen und in den Kolben des Aufschlussgeräts gegeben. Anschließend werden 15 g Kaliumsulfat (Nummer 3.1), eine geeignete Katalysatormenge (Nummer 3.2) (0,3 bis 0,4 g Kupfer(II)-oxid oder 0,9 bis 1,2 g Kupfer(II)-sulfatpentahydrat), 25 ml Schwefelsäure (Nummer 3.4) und ggf. einige Bimssteinkörnchen (Nummer 3.12) zugesetzt und vermischt. Der Kolben wird, wenn notwendig, unter regelmäßigem Schwenken zunächst mäßig erhitzt, bis die Substanz verkohlt ist und das Schäumen aufgehört hat. Dann wird die Flüssigkeit stärker erhitzt und gleichmäßig am Sieden gehalten. Bei korrekter Erhitzung kondensiert die siedende Säure auf der Kolbenwand. Ein Überhitzen der Kolbenwände und Ansetzen organischer Partikel ist zu vermeiden. Sobald die Lösung klar ist und sich hellgrün färbt, wird sie noch weitere 2 h am Sieden gehalten und danach abkühlen gelassen.

5.2.
Destillation

Es wird vorsichtig so viel Wasser zugegeben, dass die Sulfate vollständig gelöst werden. Nach dem Abkühlen werden ggf. einige Körner Zinkgranulat (Nummer 3.3) zugesetzt. Es wird entweder gemäß Nummer 5.2.1 oder 5.2.2 weiterverfahren.

5.2.1.
Destillation von Schwefelsäure

In den Auffangkolben des Destillationsapparats werden je nach dem zu erwartenden Stickstoffgehalt genau 25 ml Schwefelsäure (Nummer 3.5 oder 3.7) gebracht und einige Tropfen Methylrot-Indikator (Nummer 3.8) hinzugefügt. Der Aufschlusskolben wird mit dem Kühler des Destillationsapparats verbunden und das Ende des Kühlers mindestens 1 cm tief in die Flüssigkeit des Auffangkolbens gesenkt (siehe Bemerkung 8.3). Dann werden 100 ml Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.9) langsam in den Aufschlusskolben eingefüllt, wobei kein Ammoniak entweichen darf (siehe Bemerkung 8.1). Der Kolben wird so lange erhitzt, bis alles Ammoniak überdestilliert ist.

5.2.2.
Destillation von Borsäure

Wird der Ammoniakgehalt des Destillats von Hand titriert, findet das im Folgenden beschriebene Verfahren Anwendung. Bei einem voll automatisierten Destilliergerät, das auch die Titration des Ammoniakgehalts des Destillats vornimmt, ist die Betriebsanleitung des Herstellers zu befolgen. Ein Auffangkolben mit 25 bis 30 ml Borsäurelösung (Nummer 3.18) wird so unter den Ablauf des Kühlers gestellt, dass sich das Ablaufrohr unter der Oberfläche der überschüssigen Borsäurelösung befindet. Das Destilliergerät wird so eingestellt, dass es 50 ml Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.9) abgibt. Die Bedienung des Destilliergeräts erfolgt entsprechend den Anleitungen des Herstellers. Anschließend wird das durch die Zugabe der Natriumhydroxidlösung freigesetzte Ammoniak abdestilliert. Das Destillat wird in der Borsäure (Auffangsäure) aufgefangen. Die Destillatmenge (Dauer der Dampfdestillation) hängt von der in der Probe enthaltenen Menge Stickstoff ab. Hierbei sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen.

Anmerkung:: In einem halbautomatischen Destilliergerät erfolgen die Zugabe von überschüssigem Natriumhydroxid und die Dampfdestillation automatisch.

5.3.
Titration

Es wird entweder gemäß Nummer 5.3.1 oder 5.3.2 weiterverfahren.

5.3.1.
Schwefelsäure

Die überschüssige Schwefelsäure im Auffangkolben wird mit Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.10 oder 3.11) in Abhängigkeit von der Konzentration der verwendeten Schwefelsäure titriert, bis der Endpunkt erreicht ist.

5.3.2.
Borsäure

Der Inhalt des Auffangkolbens wird mit der volumetrischen Standardlösung der Salzsäure (Nummer 3.19) oder mit der volumetrischen Standardlösung der Schwefelsäure (Nummer 3.6) unter Verwendung einer Bürette titriert und es wird die Menge des eingesetzten Titrationsmittels abgelesen. Bei der kolorimetrischen Endpunktbestimmung ist der Endpunkt erreicht, wenn sich der Inhalt erstmals pink verfärbt. Die Bürette ist auf 0,05 ml genau abzulesen. Eine beleuchtete Magnetrührplatte oder ein fotometrischer Detektor können bei der Visualisierung des Endpunkts hilfreich sein. Dies kann automatisch erfolgen bei Verwendung eines Wasserdampfdestillators mit automatischer Titration. Hinsichtlich des Betriebs des jeweiligen Destillators bzw. des Destillier-/Titriergeräts sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen.

Anmerkung:: Bei Verwendung eines automatischen Titrationssystems beginnt die Titration unmittelbar mit dem Start der Destillation, und es wird die 1%ige Borsäurelösung (Nummer 3.18) eingesetzt.

Wird ein vollautomatisches Destilliergerät eingesetzt, kann die automatische Titration des Ammoniaks auch mittels Endpunktbestimmung unter Verwendung eines potenziometrischen pH-Systems durchgeführt werden. In diesem Fall wird eine automatische Titriervorrichtung mit einem pH-Meter verwendet. Das pH-Meter ist nach dem üblichen Labor-pH-Kalibrierverfahren ordnungsgemäß im Bereich pH 4 bis pH 7 zu kalibrieren. Der pH-Endpunkt der Titration ist bei einem pH-Wert von 4,6 erreicht, dem steilsten Punkt der Titrationskurve (Wendepunkt).

5.4.
Blindversuch

Zur Bestätigung, dass die Reagenzien stickstofffrei sind, wird ein Blindversuch (Aufschluss, Destillation und Titration) mit 1 g Saccharose (Nummer 3.14) anstelle der Probe durchgeführt.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Die Berechnungen werden gemäß Nummer 6.1 oder 6.2 durchgeführt.

6.1.
Berechnung für die Titration nach Nummer 5.3.1

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet: V0 – V1 × c ×0,014× 100 ×6,25m wobei:

V₀=: Volumen NaOH (Nummer 3.10 oder 3.11), das im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml,
V₁=: Volumen NaOH (Nummer 3.10 oder 3.11), das in der Titration der Probe eingesetzt wurde, in ml,
c=: Konzentration des Natriumhydroxids (Nummer 3.10 oder 3.11), in mol/l,
m=: Probeneinwaage in g.

6.2.
Berechnung für die Titration nach Nummer 5.3.2

6.2.1.
Titration mit Salzsäure

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet: V1 – V0 × c ×1,4×6,25m wobei:

m=: Probeneinwaage in g,
c=: Konzentration der volumetrischen Standardlösung von Salzsäure (Nummer 3.19), in mol/l,
V₀=: Volumen der Salzsäure, die im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml,
V₁=: Volumen der Salzsäure, die für die Probenmenge eingesetzt wurde, in ml.

6.2.2.
Titration mit Schwefelsäure

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet: V1 – V0 × c ×2,8×6,25m wobei:

m=: Probeneinwaage in g,
c=: Konzentration der volumetrischen Standardlösung von Schwefelsäure (Nummer 3.6), in mol/l,
V₀=: Volumen der Schwefelsäure (Nummer 3.6), die im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml,
V₁=: Volumen der Schwefelsäure (Nummer 3.6), die für die Probenmenge eingesetzt wurde, in ml.

7.
Beurteilung des Verfahrens

7.1.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—: 0,4 % absolut bei Gehalten von weniger als 20 % Rohprotein,
—: 2,0 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 20 bis 40 % Rohprotein,
—: 0,8 % absolut bei Gehalten von mehr als 40 % Rohprotein.

7.2.
Vergleichbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe in unterschiedlichen Laboratorien darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—: 1,8 % absolut bei Gehalten von weniger als 20 % Rohprotein,
—: 9,0 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 20 bis 40 % Rohprotein,
—: 3,6 % absolut bei Gehalten von mehr als 40 % Rohprotein.

7.3.
Genauigkeit

Die Analyse (Aufschluss, Destillation und Titration) wird mit einer geeigneten Menge Acetanilid (Nummer 3.13) (z. B. 0,2 bis 0,3 g) in Gegenwart von 1 g Saccharose (Nummer 3.14) durchgeführt; 1 g Acetanilid verbraucht 14,80 ml Schwefelsäure (Nummer 3.5). Die Wiederfindung muss mindestens 99 % betragen.

8.
Bemerkungen

8.1.: Es können manuelle, halbautomatische oder automatische Geräte verwendet werden. Bei Geräten, die ein Umfüllen zwischen Aufschluss und Destillation erfordern, ist darauf zu achten, dass dies verlustlos geschieht. Verfügt der Destillationsapparat nicht über einen Tropftrichter, so erfolgt die Zugabe der Natriumhydroxidlösung unmittelbar vor dem Anschließen des Kolbens an den Kühler; die Flüssigkeit ist in diesem Fall langsam an den Kolbenwänden entlang laufen zu lassen.

8.2.: Kommt es während des Aufschlusses zur Verfestigung der Mischung, ist mit der Bestimmung von vorn zu beginnen und eine größere als die unter Nummer 5.1 genannte Menge an Schwefelsäure (Nummer 3.4) zu verwenden.

8.3.: Bei stickstoffarmen Proben kann die in den Auffangkolben einzufüllende Menge Schwefelsäure (Nummer 3.7) gegebenenfalls auf 10 oder 15 ml verringert und mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt werden.

8.4.: Für Routineanalysen können auch andere Methoden zur Bestimmung des Rohproteins herangezogen werden; die in diesem Teil C beschriebene Kjeldahl-Methode ist jedoch die Referenzmethode. Die Gleichwertigkeit der Ergebnisse der alternativen Methode (z. B. DUMAS) im Vergleich zur Referenzmethode muss für jede Matrix einzeln nachgewiesen werden. Da die mit einer alternativen Methode erzielten Ergebnisse auch nach Feststellung ihrer Gleichwertigkeit leicht von den mit der Referenzmethode erzielten Ergebnissen abweichen können, muss im Analysebericht angegeben werden, welche Analysemethode zur Bestimmung des Rohproteins angewendet wurde.

D.
BESTIMMUNG DES HARNSTOFFGEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt des als Futtermittelzusatzstoff in Futtermitteln für Wiederkäuer verwendeten Harnstoffs bestimmen.

2.
Prinzip

Die Probe wird unter Zusatz eines Klärungsmittels in Wasser suspendiert. Die Suspension wird filtriert. Nach Zugabe von 4-Dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB) wird der Gehalt an Harnstoff im Filtrat durch Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 420 nm bestimmt.

3.
Reagenzien

3.1.: 4-Dimethylaminobenzaldehydlösung: 1,6 g 4-DMAB werden in 100 ml 96%igen Ethanols gelöst und 10 ml Salzsäure (ρ₂₀ = 1,19 g/ml) werden hinzugefügt. Das Reagenz ist höchstens 2 Wochen haltbar.

3.2.: Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkacetat, Zn (CH₃COO)₂·2H₂O, und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.3.: Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat(II), K₄Fe(CN)₆·3H₂O, werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.4.: Aktivkohle, keinen Harnstoff adsorbierend (zu prüfen).

3.5.: Harnstofflösung (Massenkonzentration = 0,1 %).

4.
Geräte

4.1.: Mechanisches Schüttelgerät: ca. 35 bis 40 min^-1.

4.2.: Reagenzgläser: 160 × 16 mm, mit Schliffstopfen.

4.3.: Spektralfotometer.

5.
Verfahren

5.1.
Analysengang der Probe

Von der Probe werden 2 g auf 1 mg genau eingewogen und mit 1 g Aktivkohle (Nummer 3.4) in einen 500-ml-Messkolben gebracht. Hierzu werden 400 ml Wasser und 5 ml Carrez-Lösung I (Nummer 3.2) gegeben, ca. 30 s gemischt und dann 5 ml Carrez-Lösung II (Nummer 3.3) zugesetzt. Das Ganze wird 30 min lang im Schüttelgerät rotiert. Dann wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und filtriert. Von den klaren und farblosen Filtraten werden je 5 ml in je ein Reagenzglas mit Schliffstopfen pipettiert, 5 ml 4-DMAB-Lösung (Nummer 3.1) zugesetzt und gemischt. Die Gläser werden in einem Wasserbad bei 20 °C (+/– 4 °C) temperiert. Nach 15 min wird die Extinktion der Probenlösung im Vergleich mit der Blindprobenlösung der Reagenzien im Spektralfotometer bei 420 nm gemessen.

5.2.
Kalibrationskurve

Volumen von 1, 2, 4, 5 bzw. 10 ml Harnstofflösung (Nummer 3.5) werden entnommen, in je 100-ml-Messkolben gebracht und mit Wasser zur Marke aufgefüllt. Von jeder Lösung werden 5 ml mit je 5 ml 4-DMAB-Lösung (Nummer 3.1) gemischt. Die Extinktion wird, wie oben angegeben, im Vergleich mit einer Lösung, die 5 ml 4-DMAB und 5 ml harnstofffreies Wasser enthält, gemessen. Es wird eine Kalibrationskurve aufgestellt.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Mithilfe der Kalibrationskurve ist die Menge an Harnstoff in der Probe zu bestimmen. Das Ergebnis ist in mg Harnstoff pro kg Probe auszudrücken.

7.
Beurteilung des Verfahrens

7.1.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe in ein und demselben Labor und durch denselben Bearbeiter darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—

Bei 420 nm

—: 50 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 3000 mg/kg bis unter 5000 mg/kg Harnstoff,
—: 25 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 5000 mg/kg bis unter 7000 mg/kg Harnstoff,
—: 20 % des höheren Werts bei Gehalten von 7000 mg/kg Harnstoff oder mehr.

—

Bei 435 nm

—: 40 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 3000 mg/kg bis unter 5000 mg/kg Harnstoff,
—: 25 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 5000 mg/kg bis unter 9000 mg/kg Harnstoff,
—: 5 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 9000 mg/kg Harnstoff oder mehr.

7.2.
Vergleichbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe in unterschiedlichen Laboratorien und/oder durch unterschiedliche Bearbeiter darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—

Bei 420 nm

—: 3000 mg/kg absolut bei Gehalten von 3000 mg/kg bis unter 12000 mg/kg,
—: 4500 mg/kg absolut bei Gehalten von 12000 mg/kg oder mehr.

—

Bei 435 nm

—: 50 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 3000 mg/kg bis unter 8000 mg/kg Harnstoff,
—: 25 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 8000 mg/kg Harnstoff oder mehr.

8.
Ergebnisse eines Ringversuchs

Es wurde ein EU-Laborvergleichstest durchgeführt, an dem 18 Laboratorien teilnahmen. Es wurden 5 positive Proben eines Mischfuttermittels für Wiederkäuer (in den Tabellen 1 und 2 als „MAT” bezeichnet) als Doppelblindproben untersucht (1 Untersuchung) und eine Leerprobe eines Mischfuttermittels für Wiederkäuer wurde einmalig untersucht. Die Wiederholgrenze (r) und die Vergleichsgrenze (R) wurden gemäß den internationalen Leitlinien berechnet, nachdem mithilfe einer Varianzanalyse der gültigen Werte Ausreißer eliminiert wurden. Die für die Methode berechneten Leistungszahlen (Wiederholbarkeit, Vergleichbarkeit) sind in den nachstehenden Tabellen dargestellt. Bei der Untersuchung der Gesamtheit der Proben einschließlich des Blindmaterials wurden keine falsch positiven und keine falsch negativen Proben festgestellt.

Tabelle 1

Leistungseigenschaften der Methoden für Harnstoff bei λ = 420 nm in Bezug auf alle Materialien

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Schafe	Rinder	Schafe	Schafe	Rinder
Zielmassenanteil (mg kg^-1)	3000	5000	7001	9036	11000
durchschnittlicher Massenanteil (mg kg^-1)	4241	6993	7830	9962	12071
Standardabweichung der Vergleichbarkeit s_R (mg kg^-1)	1141	1303	985	994	1711
Standardabweichung der Wiederholbarkeit s_r (mg kg^-1)	723	601	549	712	737
relative Standardabweichung der Vergleichbarkeit RSD_R (%)	27	19	13	10	14
relative Standardabweichung der Wiederholbarkeit RSD_r (%)	17	9	7	7	6
Vergleichsgrenze, R [R = 2,8 × s_R]	3195	3649	2759	2784	4790
Wiederholgrenze, r [r = 2.8 × s_r]	2024	1684	1536	1994	2064

Tabelle 2

Leistungseigenschaften der Methoden für Harnstoff bei λ = 435 nm in Bezug auf alle Materialien

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Schafe	Rinder	Schafe	Schafe	Rinder
Zielmassenanteil (mg kg^-1)	3000	5000	7001	9036	11000
durchschnittlicher Massenanteil (mg kg^-1)	4101	6467	7890	10062	11642
Standardabweichung der Vergleichbarkeit s_R (mg kg^-1)	706	1194	675	745	1378
Standardabweichung der Wiederholbarkeit s_r (mg kg^-1)	570	628	613	196	167
relative Standardabweichung der Vergleichbarkeit RSD_R (%)	17	18	9	7	12
relative Standardabweichung der Wiederholbarkeit RSD_r (%)	14	10	8	2	1
Vergleichsgrenze, R [R = 2,8 × s_R]	1977	3344	1889	2087	3859
Wiederholgrenze, r [r = 2,8 × s_r]	1596	1759	1715	549	467

9.
Bemerkungen

9.1.: Bei einem Harnstoffgehalt von mehr als 3 % ist die Einwaage auf 1 g zu reduzieren bzw. die Anfangslösung so weit zu verdünnen, dass in 500 ml höchstens 50 mg Harnstoff enthalten sind.

9.2.: Bei niedrigen Harnstoffgehalten wird die Einwaage erhöht, soweit das Filtrat klar und farblos bleibt.

9.3.: Aus den vorstehend aufgeführten Ergebnissen der Ringversuche ergibt sich kein nennenswerter Unterschied bei der Präzision der Messung von Harnstoff bei 420 nm im Vergleich zu 435 nm.

E.
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN AMINOSÄUREN (AUẞER TRYPTOPHAN)

Die zur Bestimmung des Gehalts an Aminosäuren (außer Tryptophan) anzuwendenden Analysemethoden sind die folgenden:

—: EN ISO 13903: Futtermittel — Bestimmung des Aminosäuregehalts,
—: EN ISO 17180: Futtermittel — Bestimmung von Lysin, Methionin und Threonin in handelsüblichen aminosäurehaltigen Produkten und Vormischungen⁽⁴⁾,
—: die unter den folgenden Nummern 1 bis 10 beschriebene Analysemethode.

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt der freien (synthetischen und natürlichen) sowie der gesamten (peptidgebundenen und freien) Aminosäuren in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen, Mischfuttermitteln und Vormischungen, die weniger als 10 %⁽⁵⁾ der einzelnen Aminosäuren enthalten, unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bestimmen. Die Methode ist für folgende Aminosäuren anwendbar: Cyst(e)in, Methionin, Lysin, Threonin, Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Tyrosin und Valin. Die Methode unterscheidet nicht zwischen den verschiedenen Aminosäuresalzen und kann nicht zwischen D- und L-Formen von Aminosäuren differenzieren. Sie ist nicht zur Bestimmung des Gehalts an Tryptophan oder Hydroxyanaloga der Aminosäuren anwendbar.

2.
Prinzip

2.1.
Freie Aminosäuren

Die freien Aminosäuren werden mit verdünnter Salzsäure extrahiert. Mitextrahierte stickstoffhaltige Makromoleküle werden mit Sulfosalicylsäure ausgefällt und durch Filtrieren entfernt. Die filtrierte Lösung wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin durch fotometrischen Nachweis bei 570 nm bestimmt.

2.2.
Gesamtaminosäuren

Die gewählte Methode hängt von den zu untersuchenden Aminosäuren ab. Cyst(e)in und Methionin müssen vor der Hydrolyse zu Cysteinsäure bzw. Methioninsulfon oxidiert werden. Tyrosin muss im Hydrolysat der nicht oxidierten Probe bestimmt werden. Alle übrigen unter Nummer 1 (Zweck und Anwendungsbereich) genannten Aminosäuren können aus dem Hydrolysat der oxidierten oder der nicht oxidierten Probe bestimmt werden. Die Oxidation wird bei 0 °C mit einer Perameisensäure-Phenol-Mischung durchgeführt. Überschüssiges Oxidationsreagenz wird mit Natriumdisulfit zerstört. Die oxidierte bzw. die nicht oxidierte Probe wird mit Salzsäure (Nummer 3.20) 23 h lang hydrolysiert. Das Hydrolysat wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin durch fotometrischen Nachweis bei 570 nm (bei Prolin 440 nm) bestimmt.

3.
Reagenzien

Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualität zu verwenden (Leitfähigkeit < 10 μS/cm).

3.1.: Wasserstoffperoxid, w (Massenanteil) = 30 %.

3.2.: Ameisensäure, w (Massenanteil) = 98 bis 100 %.

3.3.: Phenol.

3.4.: Natriumdisulfit.

3.5.: Natriumhydroxid.

3.6.: 5-Sulfosalicylsäure-Dihydrat.

3.7.: Salzsäure, Dichte ca. 1,18 g/ml.

3.8.: Tri-Natriumcitrat-Dihydrat.

3.9.: 2,2′-Thiodiethanol (Thiodiglycol).

3.10.: Natriumchlorid.

3.11.: Ninhydrin.

3.12.: Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 °C.

3.13.: Norleucin oder sonstige für die Verwendung als interner Standard geeignete Verbindung.

3.14.: Stickstoffgas (< 10 ppm Sauerstoff).

3.15.: 1-Octanol.

3.16.: Aminosäuren.

3.16.1.: Standardstoffe der unter Nummer 1 (Zweck und Anwendungsbereich) aufgeführten Aminosäuren. Es dürfen nur reine Verbindungen ohne Kristallwasser verwendet werden. Sie sind vor der Verwendung 1 Woche lang im Vakuum über P₂O₅ oder H₂SO₄ zu trocknen.

3.16.2.: Cysteinsäure.

3.16.3.: Methioninsulfon.

3.17.: Natriumhydroxidlösung, c = 7,5 mol/l:
300 g NaOH (Nummer 3.5) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen.

3.18.: Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l:
40 g NaOH (Nummer 3.5) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen.

3.19.: Phenolhaltige Ameisensäurelösung:
889 g Ameisensäure (Nummer 3.2) werden mit 111 g Wasser gemischt; anschließend werden 4,73 g Phenol (Nummer 3.3) hinzugefügt.

3.20.: Hydrolysemischung, c = 6 mol HCl/l unter Zusatz von 1 g Phenol/l:
Zu 492 ml HCl (Nummer 3.7) wird 1 g Phenol (Nummer 3.3) hinzugefügt und mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.21.: Extraktionslösung, c = 0,1 mol HCl/l, 2 % Thiodiglycol enthaltend: 8,2 ml HCl (Nummer 3.7) werden in ca. 900 ml Wasser gegeben, 20 ml Thiodiglycol (Nummer 3.9) werden hinzugefügt, und es wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt (Nummer 3.7 und 3.9 dürfen nicht unmittelbar gemischt werden).

3.22.: 5-Sulfosalicylsäurelösung, β = 6 %:
60 g 5-Sulfosalicylsäure (Nummer 3.6) in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.23.

Oxidationsmischung (Perameisensäure-Phenol):

0,5 ml Wasserstoffperoxid (Nummer 3.1) werden mit 4,5 ml phenolhaltiger Ameisensäurelösung (Nummer 3.19) in einem kleinen Becherglas gemischt. Es wird bei 20 bis 30 °C 1 h lang stehen gelassen, um die Bildung von Perameisensäure zu bewirken. Anschließend wird die Lösung 15 min lang in ein Eisbad gestellt, bevor sie der Probe zugegeben wird.

Vorsicht: Hautkontakt vermeiden und Schutzkleidung tragen.

3.24.: Citratpufferlösung, c = 0,2 mol Na⁺/l, pH 2,20:
19,61 g Natriumcitrat (Nummer 3.8), 5 ml Thiodiglycol (Nummer 3.9), 1 g Phenol (Nummer 3.3) und 16,50 ml HCl (Nummer 3.7) werden in ca. 800 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird auf 2,20 eingestellt. Mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.25.: Elutionspuffer entsprechend den Anforderungen des verwendeten Analysators (Nummer 4.9).

3.26.: Ninhydrinreagenz entsprechend den Bedingungen des verwendeten Analysators (Nummer 4.9).

3.27.: Aminosäuren-Standardlösungen: Diese Lösungen sind bei < 5 °C aufzubewahren.

3.27.1.

Aminosäuren-Standard-Stammlösung (Nummer 3.16.1):

c = 2,5 μmol/ml je Aminosäure in Salzsäure.

Diese Lösung ist im Handel erhältlich.

3.27.2.: Standard-Stammlösung von Cysteinsäure und Methioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml:
0,2115 g Cysteinsäure (Nummer 3.16.2) und 0,2265 g Methioninsulfon (Nummer 3.16.3) werden in Citratpufferlösung (Nummer 3.24) in einem 1000-ml-Messkolben gelöst, und es wird mit Citratpufferlösung zur Marke aufgefüllt. Die Lösung ist bei < 5 °C höchstens 12 Monate haltbar. Sie wird nicht benötigt, falls die Standard-Stammlösung (Nummer 3.27.1) bereits Cysteinsäure und Methioninsulfon enthält.

3.27.3.: Stammlösung des internen Standards, z. B. Norleucin, c = 20 μmol/ml:
0,6560 g Norleucin (Nummer 3.13) werden in Citratpufferlösung (Nummer 3.24) in einem Messkolben gelöst, und es wird mit Citratpufferlösung auf 250 ml aufgefüllt. Die Lösung ist bei < 5 °C höchstens 6 Monate haltbar.

3.27.4.

Aminosäurenkalibrierlösung zur Verwendung bei Hydrolysaten, c = 5 nmol/50 μl Cysteinsäure und Methioninsulfon und c = 10 nmol/50 μl der übrigen Aminosäuren: 2,2 g Natriumchlorid (Nummer 3.10) werden in einem 100-ml-Becherglas in 30 ml Citratpufferlösung (Nummer 3.24) gelöst. Es werden 4,00 ml Standard-Stammlösung der Aminosäuren (Nummer 3.27.1), 4,00 ml Standard-Stammlösung von Cysteinsäure und Methioninsulfon (Nummer 3.27.2), und, falls verwendet, 0,50 ml Stammlösung des internen Standards (Nummer 3.27.3) hinzugefügt. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid (Nummer 3.18) auf 2,20 eingestellt.

Die Lösung wird quantitativ in einen 50-ml-Messkolben überführt, und es wird mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) zur Marke aufgefüllt und gemischt.

Die Lösung ist bei < 5 °C höchstens 3 Monate haltbar.

Siehe auch die Bemerkungen unter 9.1.

3.27.5.: Aminosäurenkalibrierlösung zur Verwendung bei Hydrolysaten gemäß Nummer 5.3.3.1 und bei Extrakten gemäß Nummer 5.2. Die Kalibrierlösung wird gemäß Nummer 3.27.4 hergestellt, jedoch ohne Zugabe von Natriumchlorid.
Die Lösung ist bei < 5 °C höchstens 3 Monate haltbar.

4.
Geräte

4.1.: 100- oder 250-ml-Rundkolben mit Rückflusskühler.

4.2.: Ofenfeste 100-ml-Borosilikat-Glasflaschen mit Schraubverschluss mit Gummidichtung/teflonbeschichteter Dichtung (z. B. Duran, Schott).

4.3.: Trockenschrank mit forcierter Umluft, auf ± 2 °C regelbar.

4.4.: pH-Meter (auf drei Dezimalstellen genau).

4.5.: Membranfilter, 0,22 μm Porengröße.

4.6.: Zentrifuge.

4.7.: Vakuum-Rotationsverdampfer.

4.8.: Mechanischer Schüttler oder Magnetrührer.

4.9.

Aminosäureanalysator oder HPLC-Einrichtung mit Ionenaustauschersäule, Einrichtung für Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung und Fotometer.

Die Säule wird mit sulfoniertem Polystyrolharz gefüllt, das die Trennung der einzelnen Aminosäuren und deren Abtrennung von sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen ermöglicht. Die Pumpen für die Ninhydrin- und für die Pufferlösungen müssen über den Zeitraum des Kalibrationslaufes und des Probenlaufes eine Flussstabilität von ± 0,5 % gewährleisten.

Bei einigen Aminosäureanalysatoren können auch Hydrolyseverfahren angewandt werden, wenn die Hydrolysate Natriumionenkonzentrationen von c = 0,8 mol/l aufweisen und die restliche Ameisensäure des Oxidationsschrittes enthalten. Andere Analysatoren bieten keine befriedigende Abtrennung bestimmter Aminosäuren, falls das Hydrolysat überschüssige Ameisensäure und/oder hohe Natriumionenkonzentrationen aufweist. In diesem Fall wird das Säurevolumen nach der Hydrolyse und vor der pH-Wert-Einstellung durch Einengen auf ca. 5 ml reduziert. Das Einengen ist unter Vakuum bei höchstens 40 °C vorzunehmen.

5.
Verfahren

5.1.
Vorbereitung der Probe

Die Probe wird so fein zermahlen, dass sie ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite passieren kann. Proben mit hohem Feuchtigkeitsgehalt müssen vor dem Zermahlen entweder bei einer Temperatur von höchstens 50 °C luftgetrocknet oder aber gefriergetrocknet werden. Proben mit hohem Fettgehalt sind vor dem Zermahlen mit Petrolether (Nummer 3.12) zu extrahieren.

5.2.
Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren

Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (Nummer 5.1) auf 0,2 mg genau in einen Erlenmeyerkolben einwiegen und 100,0 ml Extraktionslösung (Nummer 3.21) hinzufügen. Mit einem mechanischen Schüttler 60 min lang schütteln bzw. mit einem Magnetrührer (Nummer 4.8) rühren. Absetzen lassen und 10,0 ml der überstehenden Lösung in ein 100-ml-Becherglas pipettieren. Es werden 5,0 ml Sulfosalicylsäurelösung (Nummer 3.22) unter Rühren hinzugefügt, und mithilfe des Magnetrührers wird 5 min lang weitergerührt. Die überstehende Lösung wird filtriert oder zentrifugiert, um alle Ausfällungen zu entfernen. Von der so erhaltenen Lösung werden 10,0 ml in ein 100-ml-Becherglas gegeben, und unter Verwendung von Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.18) wird der pH-Wert auf 2,20 eingestellt. Die Lösung wird mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) in einen Messkolben geeigneter Größe überführt und mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) zur Marke aufgefüllt. Bei Verwendung eines internen Standards werden vor dem Auffüllen 1,00 ml der Stammlösung des internen Standards (Nummer 3.27.3) für jeweils 100 ml Endlösung hinzugefügt und mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) zur Marke aufgefüllt. Anschließend wird die Chromatografie gemäß Nummer 5.4 durchgeführt. Werden die Extrakte nicht am selben Tag chromatografiert, sind sie bei < 5 °C aufzubewahren.

5.3.
Bestimmung des Gehalts an Gesamtaminosäuren

5.3.1.
Oxidation

0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (Nummer 5.1) werden auf 0,2 mg genau eingewogen

—: in einen 100-ml-Rundkolben (Nummer 4.1) für die offene Hydrolyse (Nummer 5.3.2.3) oder
—: in einen 250-ml-Rundkolben (Nummer 4.1), falls eine niedrige Natriumionenkonzentration (Nummer 5.3.3.1) erforderlich ist, oder
—: in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (Nummer 4.2) für die geschlossene Hydrolyse (Nummer 5.3.2.4).

Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von etwa 10 mg und einen Feuchtigkeitsgehalt von höchstens 100 mg haben. Der Kolben/die Flasche wird in ein Eisbad gestellt und auf 0 °C abgekühlt. Dann werden 5 ml der Oxidationsmischung (Nummer 3.23) hinzugefügt, und es wird mithilfe eines Glasspatels mit gebogener Spitze gemischt. Der Behälter, der den Spatel enthält, wird mit einer luftdichten Folie verschlossen, das Eiswasserbad wird mit dem verschlossenen Behälter in einen Kühlschrank mit einer Temperatur von 0 °C gestellt und 16 h lang stehen gelassen. Nach 16 h wird der Behälter aus dem Kühlschrank genommen und das überschüssige Oxidationsreagenz wird durch Zusatz von 0,84 g Natriumdisulfit (Nummer 3.4) zersetzt. Es wird gemäß Nummer 5.3.2.1 weiterverfahren.

5.3.2.
Hydrolyse

5.3.2.1.

Hydrolyse der oxidierten Proben

Zu der oxidierten Probe (die gemäß Nummer 5.3.1 vorbereitet wurde) werden 25 ml Hydrolysemischung (Nummer 3.20) gegeben. Dabei ist darauf zu achten, dass alle Probenrückstände, die an den Seitenwänden des Gefäßes sowie am Spatel haften, abgewaschen werden.

Je nach dem angewendeten Hydrolyseverfahren wird gemäß Nummer 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 weiterverfahren.

5.3.2.2.: Hydrolyse der nicht oxidierten Proben
In einen 100-ml- oder 250-ml-Rundkolben (Nummer 4.1) bzw. in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (Nummer 4.2) werden 0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (Nummer 5.1) auf 0,2 mg genau eingewogen. Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von ca. 10 mg aufweisen. Vorsichtig 25 ml Hydrolysemischung (Nummer 3.20) hinzufügen und mit der Probe vermischen. Es wird entweder gemäß Nummer 5.3.2.3 oder gemäß Nummer 5.3.2.4 weiterverfahren.

5.3.2.3.

Offene Hydrolyse (Rückflusshydrolyse)

Zu der nach Nummer 5.3.2.1 oder 5.3.2.2 hergestellten Mischung werden 3 Glasperlen hinzugegeben. Sie wird zum Sieden erhitzt und unter Rückfluss 23 h lang am Sieden gehalten. Nach Beendigung der Hydrolyse wird der Rückflusskühler mit 5 ml Citratpufferlösung (Nummer 3.24) gespült und der abgehängte Kolben im Eisbad gekühlt.

Es wird gemäß Nummer 5.3.3 weiterverfahren.

5.3.2.4.

Geschlossene Hydrolyse

Die Flasche mit der nach Nummer 5.3.2.1 oder 5.3.2.2 vorbereiteten Mischung wird bei 110 °C in den Trockenschrank (Nummer 4.3) gestellt. Um einen durch Gasentwicklung hervorgerufenen Druckaufbau zu vermeiden und eine Explosion zu verhindern, wird der Schraubverschluss während der ersten Stunde nur lose auf die Flasche gelegt. Die Flasche darf nicht verschlossen werden. Nach 1 h wird die Flasche mit dem Deckel fest verschlossen und 23 h lang im Trockenschrank (Nummer 4.3) belassen. Nach Beendigung der Hydrolyse wird die Flasche aus dem Trockenschrank genommen, der Verschluss vorsichtig geöffnet, die Flasche in ein Eisbad gestellt und abkühlen gelassen.

Je nach dem Verfahren für die pH-Wert-Einstellung (Nummer 5.3.3) wird der Inhalt der Flasche quantitativ mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) in ein 250-ml-Becherglas oder in einen 250-ml-Rundkolben überführt.

Es wird gemäß Nummer 5.3.3 weiterverfahren.

5.3.3.
pH-Wert-Einstellung

Je nach der Natriumionentoleranz des Aminosäureanalysators (Nummer 4.9) wird die pH-Wert-Einstellung gemäß Nummer 5.3.3.1 oder 5.3.3.2 vorgenommen.

5.3.3.1.

Für chromatografische Systeme (Nummer 4.9), die eine niedrige Natriumionenkonzentration erfordern

Werden Aminosäureanalysatoren verwendet, bei denen eine geringe Natriumionenkonzentration erforderlich ist (wenn also das Säurevolumen reduziert werden muss), wird die Verwendung einer Stammlösung eines internen Standards (Nummer 3.27.3) empfohlen.

In diesem Fall sind dem Hydrolysat vor dem Verdampfen 2,00 ml der internen Standardlösung (Nummer 3.27.3) hinzuzufügen.

Zu dem nach Nummer 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 erhaltenen Hydrolysat werden 2 Tropfen 1-Octanol (Nummer 3.15) gegeben.

Das Volumen wird mithilfe eines Rotationsverdampfers (Nummer 4.7) unter Vakuum bei 40 °C auf 5 bis 10 ml reduziert. Wurde das Volumen beim Einengen versehentlich auf weniger als 5 ml reduziert, wird das Hydrolysat verworfen und die Analyse wiederholt.

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.18) auf 2,20 eingestellt, und es wird gemäß Nummer 5.3.4 weiterverfahren.

5.3.3.2.

Für alle sonstigen Aminosäureanalysatoren (Nummer 4.9)

Die nach Nummer 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 erhaltenen Hydrolysate werden durch vorsichtige Zugabe unter Rühren von 17 ml Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.17) teilweise neutralisiert, wobei eine Temperatur von unter 40 °C eingehalten werden muss.

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.17 und anschließend 3.18) bei Raumtemperatur auf 2,20 eingestellt, und es wird gemäß Nummer 5.3.4 weiterverfahren.

5.3.4.
Probenlösung für die Chromatografie

Das auf pH 2,20 eingestellte Hydrolysat (Nummer 5.3.3.1 oder 5.3.3.2) wird mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) quantitativ in einen 200-ml-Messkolben überführt und mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) zur Marke aufgefüllt. Falls bisher noch kein interner Standard hinzugefügt worden ist, werden vor dem Auffüllen 2,00 ml des internen Standards (Nummer 3.27.3) hinzugegeben und dann mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) zur Marke aufgefüllt. Es wird sorgfältig gemischt. Anschließend wird die Chromatografie gemäß Nummer 5.4 durchgeführt. Falls die Probenlösungen nicht am selben Tag chromatografiert werden, sind sie bei < 5 °C aufzubewahren.

5.4.
Chromatografie

Falls erforderlich, wird der Extrakt (Nummer 5.2) oder das Hydrolysat (Nummer 5.3.4) vor der Chromatografie auf Raumtemperatur gebracht. Die Mischung wird geschüttelt und es wird eine geeignete Menge durch einen 0,22-μm-Membranfilter (Nummer 4.5) filtriert. Die so erhaltene klare Lösung wird der Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bzw. einer HPLC-Einrichtung (Nummer 4.9) unterzogen. Die Einspritzung kann von Hand oder automatisch erfolgen. Wesentlich ist, dass jeweils die gleiche Menge ± 0,5 % der Standardlösung und der Probenlösung eingespritzt wird, es sei denn, es wird ein interner Standard verwendet. Das Verhältnis der Konzentrationen von Natriumionen und Aminosäuren sollte in der Standard- und der Probenlösung so ähnlich wie möglich sein. Die Häufigkeit von Kalibrationsläufen hängt von der Stabilität des Ninhydrinreagenzes und des Analysatorsystems ab. Die Standardlösung oder die Probenlösung wird mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) so verdünnt, dass die Peakfläche des Standards etwa 30 bis 200 % der Peakfläche der einzelnen Aminosäuren in der Probenlösung ausmacht. Die Chromatografie der Aminosäuren unterscheidet sich leicht je nach Art des verwendeten Analysators und des eingesetzten Harzes. Das System muss in der Lage sein, die Aminosäuren vollständig voneinander und von den sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen zu trennen. Im Betriebsbereich muss das chromatografische System bei Änderungen der Aminosäuremengen, die der Säule hinzugefügt werden, eine lineare Reaktion aufweisen. Wird eine equimolare Lösung der zu bestimmenden Aminosäuren analysiert, sollten bei der Chromatografie die unten angegebenen Verhältnisse von Tal zu Peakhöhe zwischen den überlappenden Peaks erreicht werden. Diese equimolare Lösung muss mindestens 30 % der maximalen Menge jeder Aminosäure enthalten, die mit dem jeweiligen Aminosäureanalysator (Nummer 4.9) noch präzise bestimmt werden kann. Für die Trennung von Threonin-Serin darf das Verhältnis von Tal zur Peakhöhe des niedrigeren der 2 sich überlappenden Peaks auf dem Chromatogramm nicht mehr als 2:10 betragen (wenn nur Cyst(e)in, Methionin, Threonin und Lysin bestimmt werden, beeinträchtigt eine unzureichende Trennung von angrenzenden Peaks die Bestimmung). Für alle übrigen Aminosäuren sollte die Trennung besser als 1:10 sein. Das System muss gewährleisten, dass Lysin von „Lysinartefakten” und Omithin abgetrennt wird.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Die Flächen der Proben- und der Kalibrationsstandardpeaks werden für jede einzelne Aminosäure bestimmt und der Gehalt (X) in g Aminosäure je kg Probe berechnet: XA × c × M × VB × m × 1 000 Bei Verwendung eines internen Standards ist zu multiplizieren mit DC

A=: Peakfläche, Hydrolysat oder Extrakt
B=: Peakfläche, Kalibrierstandardlösung
C=: Peakfläche, interner Standard im Hydrolysat oder Extrakt
D=: Peakfläche, interner Standard, Kalibrierstandardlösung
M=: Molmasse der zu bestimmenden Aminosäure
c=: Konzentration des Standards in μmol/ml
m=: Probeneinwaage (auf Originalgewicht berichtigt, falls getrocknet oder entfettet), in g
V=: Gesamtvolumen des Hydrolysats (Nummer 5.3.4) in ml oder errechnetes Gesamtverdünnungsvolumen des Extrakts (Nummer 6.1) in ml

Sowohl Cystin als auch Cystein werden im Hydrolysat der oxidierten Probe als Cysteinsäure bestimmt, jedoch als Cystin (C₆H₁₂N₂O₄S₂, M = 240,30 g/mol) unter Verwendung der Molmasse von 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 g/mol) berechnet. Methionin wird als Methioninsulfon in Hydrolysaten der oxidierten Probe bestimmt, aber unter Verwendung des M von Methionin (149,21 g/mol) als Methionin berechnet. Zugesetztes freies Methionin wird nach Extraktion als Methionin bestimmt, wobei für die Berechnung das gleiche M verwendet wird.

6.1.

Das Gesamtverdünnungsvolumen der Extrakte (F) für die Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren (Nummer 5.2) wird wie folgt berechnet:

F100 ml × 10 ml5 ml10 ml×V10

V=: Volumen des Endextrakts.

7.
Beurteilung des Verfahrens

Das Verfahren wurde in einem auf internationaler Ebene im Jahr 1990 durchgeführten Vergleichstest an 4 verschiedenen Futtermitteln (Mischfuttermittel für Schweine, Mischfuttermittel für Masthähnchen, Eiweißkonzentrat und einer Vormischung) erprobt.

Anmerkung:: Das Verfahren wurde 2003 in einem zweiten internationalen Vergleichstest anhand von Paaren von Doppelblindproben von Finisherfutter für Masthähnchen, Starterfutter für Mastküken, Mais, Fischmehl und Geflügelfutter erprobt. Zu den Einzelheiten siehe EN ISO 13903.

Die nach der Eliminierung von Ausreißern erhaltenen Ergebnisse des Vergleichstests aus dem Jahr 1990 (Mittelwerte und Standardabweichungen) sind in den Tabellen unter diesem Punkt dargestellt.

Mittelwerte in g/kg

n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

Referenzmaterial	Aminosäure
Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Schweinemischfutter	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Masthähnchenmischfutter	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Eiweißkonzentrat	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Vormischung	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16

Referenzmaterial

Aminosäure

Threonin

Cyst(e)in

Methionin

Lysin

Schweinemischfutter

6,94

n = 15

3,01

n = 17

3,27

n = 17

9,55

n = 13

Masthähnchenmischfutter

9,31

n = 16

3,92

n = 18

5,08

n = 18

13,93

n = 16

Eiweißkonzentrat

22,32

n = 16

5,06

n = 17

12,01

n = 17

47,74

n = 15

Vormischung

58,42

n = 16

—

90,21

n = 16

98,03

n = 16

7.1.
Wiederholbarkeit

Die Wiederholbarkeit wird als Standardabweichung der Wiederholbarkeit beim in der vorstehenden Tabelle dargestellten Vergleichstest ausgedrückt und ist in der folgenden Tabelle dargestellt:

Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit (%) (VK_r)

n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

Referenzmaterial	Aminosäure
Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Schweinemischfutter	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Masthähnchenmischfutter	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Eiweißkonzentrat	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Vormischung	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16

Referenzmaterial

Aminosäure

Threonin

Cyst(e)in

Methionin

Lysin

Schweinemischfutter

1,9

n = 15

3,3

n = 17

3,4

n = 17

2,8

n = 13

Masthähnchenmischfutter

2,1

n = 16

2,8

n = 18

3,1

n = 18

2,1

n = 16

Eiweißkonzentrat

2,7

n = 16

2,6

n = 17

2,2

n = 17

2,4

n = 15

Vormischung

2,2

n = 16

—

2,4

n = 16

2,1

n = 16

7.2.
Vergleichbarkeit

Die Ergebnisse hinsichtlich der Standardabweichung der Vergleichbarkeit, die sich aus dem oben genannten Vergleichstest ergeben, sind in der folgenden Tabelle dargestellt.

Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit (%) (VK_R)

n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

Referenzmaterial	Aminosäure
Threonin	Cyst(e)in	Methionin	Lysin
Schweinemischfutter	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Masthähnchenmischfutter	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Eiweißkonzentrat	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Vormischung	4,3 n = 16	—-	6,9 n = 16	6,7 n = 16

Referenzmaterial

Aminosäure

Threonin

Cyst(e)in

Methionin

Lysin

Schweinemischfutter

4,1

n = 15

9,9

n = 17

7,0

n = 17

3,2

n = 13

Masthähnchenmischfutter

5,2

n = 16

8,8

n = 18

10,9

n = 18

5,4

n = 16

Eiweißkonzentrat

3,8

n = 16

12,3

n = 17

13,0

n = 17

3,0

n = 15

Vormischung

4,3

n = 16

—-

6,9

n = 16

6,7

n = 16

8.
Verwendung von Referenzmaterialien

Die korrekte Anwendung der Methode ist durch Mehrfachbestimmungen an zertifizierten Referenzmaterialien (soweit verfügbar) zu überprüfen. Für die Kalibration wird die Verwendung einer zertifizierten Aminosäurestandardlösung empfohlen.

9.
Bemerkungen

9.1.

Wegen der Unterschiede zwischen den Aminosäureanalysatoren sind die Endkonzentrationen der Aminosäurenkalibrierlösungen (vgl. Nummer 3.27.4 und 3.27.5) und der Hydrolysate (vgl. Nummer 5.3.4) als Richtwerte anzusehen.

Der lineare Reaktionsbereich des Geräts muss für alle Aminosäuren geprüft werden.

Die Standardlösung wird mit Citratpufferlösung verdünnt, um Peakflächen in der Mitte des Bereichs zu erhalten.

9.2.: Falls Geräte für die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie zur Analyse der Hydrolysate eingesetzt werden, sind die Versuchsbedingungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu optimieren.

9.3.: Wird diese Methode für Mischfuttermittel oder Vormischungen angewandt, die mehr als 1 % Chlorid enthalten (Kraftfuttermittel, Mineralfuttermittel, Ergänzungsfuttermittel), so könnte der Methioningehalt unterschätzt werden, und es ist eine modifizierte Oxidation erforderlich.

10.
Leistungskriterien

Aus der Zusammenstellung der Ergebnisse (außer für Tyrosin) der 2 Ringversuche (aus dem Jahr 1990, wie unter Nummer 7 beschrieben, bzw. aus dem Jahr 2005, wie in EN/ISO 13903 beschrieben) ergeben sich die nachstehenden Kriterien für die Wiederholbarkeit und die Vergleichbarkeit. Die bei diesen 2 Laborvergleichstests erzielten Werte sind möglicherweise nicht auf andere als die genannten Konzentrationsbereiche und Matrizen anwendbar.

10.1.
Wiederholbarkeit

—: 6 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Glycin, Alanin, Lysin, Prolin, Glutaminsäure, Isoleucin und Histidin;
—: 8 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Threonin, Phenylalanin, Methionin, Asparaginsäure und Leucin;
—: 10 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Arginin und Valin;
—: 12 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Serin;
—: 15 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Cyst(e)in.

10.2.
Vergleichbarkeit

—: 15 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Glycin, Alanin und Threonin;
—: 20 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Lysin, Prolin, Phenylalanin, Methionin und Asparaginsäure;
—: 22 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Glutaminsäure und Leucin;
—: 27 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Arginin;
—: 32 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Isoleucin;
—: 35 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Valin und Serin;
—: 40 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Histidin;
—: 50 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Cyst(e)in.

F.
BESTIMMUNG DES TRYPTOPHANGEHALTS

Die zur Bestimmung des Gehalts an Tryptophan anzuwendenden Analysemethoden sind die folgenden:

—: EN ISO 13904: Futtermittel — Bestimmung des Tryptophangehalts,
—: die unter den folgenden Nummern 1 bis 9 beschriebene Analysemethode.

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gesamtgehalt an Tryptophan und der Gehalt an freiem Tryptophan in Futtermitteln bestimmen. Sie differenziert nicht zwischen D- und L-Formen.

2.
Prinzip

Zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Tryptophan wird die Probe unter alkalischen Bedingungen mit gesättigter Bariumhydroxid-Lösung hydrolysiert, auf 110 °C erhitzt und 20 h lang auf dieser Temperatur gehalten. Nach der Hydrolyse wird ein interner Standard zugegeben. Zur Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan wird die Probe unter leicht sauren Bedingungen in Gegenwart eines internen Standards extrahiert. Tryptophan und der interne Standard im Hydrolysat bzw. im Extrakt werden durch HPLC mit Fluoreszenzdetektor bestimmt.

3.
Reagenzien

3.1.: Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualität zu verwenden (Leitfähigkeit < 10 μS/cm).

3.2.: Standardsubstanz: Tryptophan (Reinheit/Gehalt ≥ 99 %), im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

3.3.: Interner Standard: α-Methyl-Tryptophan (Reinheit/Gehalt ≥ 99 %), im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

3.4.: Bariumhydroxid-Octahydrat (das Ba(OH)₂·8H₂O darf nicht übermäßig der Luft ausgesetzt werden, um die Bildung von BaCO₃ zu vermeiden, das die Bestimmung beeinträchtigen könnte) (siehe Bemerkung 9.3).

3.5.: Natriumhydroxid.

3.6.: Orthophosphorsäure, w (Massenanteil) = 85 %.

3.7.: Salzsäure, ρ₂₀ = 1,19 g/ml.

3.8.: Methanol, HPLC-Qualität.

3.9.: Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 °C.

3.10.: Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l:
40,0 g NaOH (Nummer 3.5) in Wasser lösen und mit Wasser (Nummer 3.1) auf 1 l auffüllen.

3.11.: Salzsäure, c = 6 mol/l:
492 ml HCl (Nummer 3.7) werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.12.: Salzsäure, c = 1 mol/l:
82 ml HCl (Nummer 3.7) werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.13.: Salzsäure, c = 0,1 mol/l:
8,2 ml HCl (Nummer 3.7) werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.14.: Orthophosphorsäure, c = 0,5 mol/l:
34 ml Orthophosphorsäure (Nummer 3.6) werden mit Wasser (Nummer 3.1) auf 1 l aufgefüllt.

3.15.: Konzentrierte Tryptophanlösung (Nummer 3.2), c = 2,50 μmol/ml:
0,2553 g Tryptophan (Nummer 3.2) werden in einem 500-ml-Messkolben in Salzsäure (Nummer 3.13) gelöst und mit Salzsäure (Nummer 3.13) zur Marke aufgefüllt. Bei -18 °C höchstens 4 Wochen aufbewahren.

3.16.: Konzentrierte interne Standardlösung, c = 2,50 μmol/ml:
0,2728 g α-Methyl-Tryptophan (Nummer 3.3) werden in einem 500-ml-Messkolben in Salzsäure (Nummer 3.13) gelöst und mit Salzsäure (Nummer 3.13) zur Marke aufgefüllt. Bei -18 °C höchstens 4 Wochen aufbewahren.

3.17.

Kalibrierstandardlösung von Tryptophan und internem Standard:

2,00 ml konzentrierte Tryptophanlösung (Nummer 3.15) und 2,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (α-Methyl-Tryptophan) (Nummer 3.16) werden mit Wasser (Nummer 3.1) und Methanol (Nummer 3.8) auf etwa dasselbe Volumen und etwa dieselbe Methanolkonzentration (10 bis 30 %) wie das fertige Hydrolysat verdünnt.

Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

Während der Zubereitung vor direktem Sonnenlicht schützen.

3.18.: Essigsäure.

3.19.: 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol.

3.20.: Ethanolamin, w (Massenanteil) > 98 %.

3.21.: Lösung von 1 g 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (Nummer 3.19) in 100 ml Methanol (Nummer 3.8).

3.22.: Mobile Phase für die HPLC: 3,00 g Essigsäure (Nummer 3.18) + 900 ml Wasser (Nummer 3.1) + 50,0 ml Lösung (Nummer 3.21) von 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (Nummer 3.19) in Methanol (Nummer 3.8) (1 g/100 ml). Den pH-Wert mit Ethanolamin (Nummer 3.20) auf 5,0 einstellen. Mit Wasser (Nummer 3.1) auf 1 l auffüllen.

4.
Geräte

4.1.: HPLC-Einrichtung mit Fluoreszenzdetektor.

4.2.: HPLC-Trennsäule, 125 × 4 mm, C₁₈, 3 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule.

4.3.: pH-Meter.

4.4.: Polypropylen-Kolben, 125 ml, Weithals mit Schraubverschluss.

4.5.: Membranfilter, 0,45 μm Porengröße.

4.6.: Autoklav, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7.: Mechanisches Schüttelgerät oder Magnetrührer.

4.8.: Vortex-Schüttelgerät.

5.
Verfahren

5.1.
Vorbereitung der Proben

5.2.
Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan (Extrakt)

Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (Nummer 5.1) auf 1 mg genau in einen Erlenmeyerkolben einwiegen. 100,0 ml Salzsäure (Nummer 3.13) und 5,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (Nummer 3.16) zugeben. Mit einem mechanischen Schüttler oder einem Magnetrührer (Nummer 4.7) 60 min lang schütteln bzw. mischen. Absetzen lassen und 10,0 ml der überstehenden Lösung in ein Becherglas pipettieren. 5 ml Orthophosphorsäure (Nummer 3.14) zugeben. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.10) auf 3 eingestellt. Ausreichend Methanol (Nummer 3.8) für eine Methanolkonzentration von 10 bis 30 % im Endvolumen zugeben. In einen Messkolben mit ausreichendem Volumen überführen und mit Wasser auf das für die Chromatografie notwendige Volumen verdünnen (entspricht etwa dem Volumen der Kalibrierstandardlösung (Nummer 3.17)). Einige ml der Lösung werden vor der Einspritzung in die HPLC-Säule durch einen 0,45-μm-Membranfilter (Nummer 4.5) filtriert. Die Chromatografie gemäß Nummer 5.4 durchführen. Standardlösung und Extrakte sind vor direktem Sonnenlicht zu schützen. Falls es nicht möglich ist, die Extrakte am selben Tag zu analysieren, können sie bei 5 °C maximal 3 Tage aufbewahrt werden.

5.3.
Bestimmung des Gehalts an Gesamttryptophan (Hydrolysat)

0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (Nummer 5.1) werden auf 0,2 mg genau in den Polypropylenkolben (Nummer 4.4) eingewogen. Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von ca. 10 mg aufweisen. 8,4 g Bariumhydroxid-Octahydrat (Nummer 3.4) und 10 ml Wasser zugeben. Mithilfe eines Vortex-Schüttelgeräts (Nummer 4.8) oder Magnetrührgeräts (Nummer 4.7) mischen. Den teflonbeschichteten Magneten in der Mischung lassen. Die Gefäßwände mit 4 ml Wasser abspülen. Schraubkappe aufsetzen und Kolben locker verschließen. In einen Autoklaven (Nummer 4.6) mit kochendem Wasser überführen und 30 bis 60 min lang dämpfen lassen. Den Autoklaven schließen und 20 h lang bei 110 (± 2) °C autoklavieren. Vor dem Öffnen des Autoklaven ist die Temperatur auf knapp unter 100 °C zu senken. Um eine Kristallisation des Ba(OH)₂·8H₂O zu vermeiden, sind der warmen Mischung 30 ml Wasser mit Zimmertemperatur zuzugeben. Leicht schütteln oder rühren. 2,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (α-Methyl-Tryptophan) (Nummer 3.16) zugeben. Die Gefäße im Wasser-/Eisbad 15 min lang kühlen. Anschließend 5 ml Orthophosphorsäure (Nummer 3.14) zugeben. Das Gefäß im Kühlbad belassen und unter Rühren mit HCl (Nummer 3.11) neutralisieren; der pH-Wert wird mit HCl (Nummer 3.12) auf 3,0 eingestellt. Ausreichend Methanol für eine Methanolkonzentration von 10 bis 30 % im Endvolumen zugeben. In einen Messkolben mit ausreichendem Volumen überführen und mit Wasser auf das für die Chromatografie notwendige Volumen verdünnen (z. B. 100 ml). Die Zugabe von Methanol darf keine Präzipitation verursachen. Einige ml der Lösung werden vor der Einspritzung in die HPLC-Säule durch einen 0,45-μm-Membranfilter (Nummer 4.5) filtriert. Die Chromatografie gemäß Nummer 5.4 durchführen. Standardlösung und Extrakte sind vor direktem Sonnenlicht zu schützen. Falls es nicht möglich ist, die Hydrolysate am selben Tag zu analysieren, können sie bei 5 °C höchstens 3 Tage aufbewahrt werden.

5.4.
HPLC-Bestimmung

Die folgenden Angaben für eine isokratische Trennung sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen (siehe auch Bemerkungen 9.1 und 9.2):

HPLC-Trennsäule (Nummer 4.2):	125 × 4 mm, C₁₈, 3 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule
Säulentemperatur:	Raumtemperatur
Mobile Phase (Nummer 3.22):	3,00 g Essigsäure (Nummer 3.18) + 900 ml Wasser (Nummer 3.1) + 50,0 ml Lösung (Nummer 3.21) von 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (Nummer 3.19) in Methanol (Nummer 3.8) (1 g/100 ml). Den pH-Wert mit Ethanolamin (Nummer 3.20) auf 5,0 einstellen. Mit Wasser (Nummer 3.1) auf 1 l auffüllen.
Durchflussrate:	1 ml/min
Gesamtlaufzeit:	ca. 34 min
Detektionswellenlänge:	Anregung: 280 nm, Emission: 356 nm
Einspritzvolumen:	20 μl

6.
Berechnung der Ergebnisse

Die Menge von Tryptophan (X) in g je 100 g Probe wird wie folgt berechnet: XA × B × V1 × c × V2 × MC × D × V3 × 10 000 × m

A=: Peakfläche des internen Standards; Kalibrierstandardlösung (Nummer 3.17)
B=: Peakfläche von Tryptophan, Extrakt (Nummer 5.2) oder Hydrolysat (Nummer 5.3)
V₁=: Volumen der konzentrierten Tryptophanlösung (Nummer 3.15), das der Kalibrierlösung (Nummer 3.17) zugegeben wurde, in ml (2 ml)
c=: Konzentration der konzentrierten Tryptophanlösung (Nummer 3.15), die der Kalibrierlösung (Nummer 3.17) zugegeben wurde, in μmol/ml (= 2,50)
V₂=: Volumen der konzentrierten internen Standardlösung (Nummer 3.16), das bei der Extraktion (Nummer 5.2) (= 5,00 ml) oder dem Hydrolysat (Nummer 5.3) (= 2,00 ml) zugegeben wurde, in ml
C=: Peakfläche des internen Standards, Extrakt (Nummer 5.2) oder Hydrolysat (Nummer 5.3)
D=: Peakfläche von Tryptophan, Kalibrierstandardlösung (Nummer 3.17)
V₃=: Volumen der konzentrierten internen Standardlösung (Nummer 3.16), das der Kalibrierstandardlösung (Nummer 3.17) zugegeben wurde, in ml (2,00 ml)
m=: Probeneinwaage (korrigiert auf Originalgewicht, falls getrocknet und/oder entfettet), in g
M=: Molmasse von Tryptophan (= 204,23 g/mol)

7.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 10 % des höheren Werts nicht überschreiten.

8.
Ergebnisse eines Ringversuchs

Es wurde ein EU-Ringversuch (4. Vergleichstest) durchgeführt, bei dem 3 Proben von bis zu 12 Laboratorien analysiert wurden, um die Hydrolysemethode zu zertifizieren. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst.

L =: Zahl der Laboratorien, die Ergebnisse übermittelt haben

n =: Zahl der Einzelergebnisse ohne Ausreißer (Ausreißertest von Cochran, Dixon)

s_r =: Standardabweichung der Wiederholbarkeit

S_R =: Standardabweichung der Vergleichbarkeit

r =: Wiederholbarkeit

R =: Vergleichbarkeit

VK_r =: Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit, %

VK_R =: Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit, %

	Probe 1 Schweinefutter	Probe 2 Schweinefutter mit Zusatz von L-Tryptophan	Probe 3 Kraftfutter für Schweine
L	12	12	12
n Mittelwert [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
s_r [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
VK_r [%]	1,9	1,6	1,9
S_R [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
VK_R [%]	6,3	6,0	2,2

Es wurde ein weiterer EU-Ringversuch (3. Vergleichstest) durchgeführt, bei dem 2 Proben von bis zu 13 Laboratorien analysiert wurden, um die Methode zur Extraktion von freiem Tryptophan zu zertifizieren. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst.

L =: Zahl der Laboratorien, die Ergebnisse übermittelt haben

n =: Zahl der Einzelergebnisse ohne Ausreißer (Ausreißertest von Cochran, Dixon)

s_r =: Standardabweichung der Wiederholbarkeit

S_R =: Standardabweichung der Vergleichbarkeit

r =: Wiederholbarkeit

R =: Vergleichbarkeit

VK_r =: Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit, %

VK_R =: Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit, %

	Probe 4 Mischung aus Weizen und Soja	Probe 5 Mischung aus Weizen und Soja (= Probe 4) mit Tryptophan-Zusatz (0,457 g/kg)
L n	12 55	12 60
Mittelwert [g/kg]	0,391	0,931
s_r [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
VK_r [%]	1,34	1,34
S_R [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
VK_R [%]	4,71	5,11

Es wurde ein weiterer EU-Vergleichstest durchgeführt, bei dem 4 Proben von bis zu 7 Laboratorien analysiert wurden, um die Tryptophan-Hydrolyse zu zertifizieren. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefasst. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert.

L =: Zahl der Laboratorien, die Ergebnisse übermittelt haben

n =: Zahl der Einzelergebnisse ohne Ausreißer (Ausreißertest von Cochran, Dixon)

s_r =: Standardabweichung der Wiederholbarkeit

S_R =: Standardabweichung der Vergleichbarkeit

r =: Wiederholbarkeit

R =: Vergleichbarkeit

VK_r =: Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit, %

VK_R =: Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit, %

	Probe 1 Schweinemischfuttermittel (CRM 117)	Probe 2 Fischmehl mit geringem Fettgehalt (CRM 118)	Probe 3 Sojamehl (CRM 119)	Probe 4 Magermilchpulver (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Mittelwert [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
s_r [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
VK_r [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
S_R [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
VK_R [%]	1,48	4,69	4,11	4,22

9.
Bemerkungen

9.1.

Mit den folgenden besonderen Chromatografiebedingungen kann eine bessere Trennung von Tryptophan und α-Methyl-Tryptophan erreicht werden.

Isokratische Trennung, gefolgt von der Reinigung der Gradientensäule:

HPLC-Trennsäule:	125 × 4 mm, C₁₈, 5 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule
Säulentemperatur:	32 °C
Mobile Phase:	A: 0,01 mol/l KH₂PO₄/Methanol, 95 + 5 (V+V).
	B: Methanol.
Gradientenprogramm:	0 min 100 % A	0 % B
	15 min 100 % A	0 % B
	17 min 60 % A	40 % B
	19 min 60 % A	40 % B
	21 min 100 % A	0 % B
	33 min 100 % A	0 % B
Durchflussrate:	1,2 ml/min
Gesamtlaufzeit:	ca. 33 min

9.2.: Die Durchführung der Chromatografie variiert je nach Art der HPLC und der verwendeten Säulenpackung. Das System muss so gewählt werden, dass eine Grundlinientrennung zwischen Tryptophan und dem internen Standard möglich ist. Die Abbauprodukte müssen deutlich von Tryptophan und dem internen Standard getrennt werden. Zur Untersuchung der Grundlinie unter dem internen Standard auf Verunreinigungen sind Hydrolysate ohne internen Standard zu analysieren. Die Laufzeit muss lang genug sein, dass alle Abbauprodukte eluiert werden, andernfalls können späte Elutionspeaks anschließende Chromatografiedurchgänge beeinträchtigen.
Im Betriebsbereich muss das Chromatografiesystem eine lineare Reaktion ergeben. Die lineare Reaktion ist bei einer konstanten (der normalen) Konzentration des internen Standards und unterschiedlichen Tryptophankonzentrationen zu messen. Die Größe des Tryptophan- und des internen Standardpeaks müssen sich innerhalb des linearen Bereichs des HPLC-/Fluoreszenzsystems befinden. Sollten der Tryptophan- und/oder der interne Standardpeak/die internen Standardpeaks zu klein oder zu hoch sein, ist die Analyse mit einer anderen Probengröße und/oder einem anderen Endvolumen zu wiederholen.

9.3.
Bariumhydroxid

Älteres Bariumhydroxid ist schwerer löslich. Dies kann zur Folge haben, dass die Lösung für die HPLC-Bestimmung nicht klar ist und zu niedrigen Tryptophan-Werten führen kann.

G.
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN ROHÖLEN UND -FETTEN

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Rohöl- und Rohfettgehalt von Futtermitteln bestimmen. Je nach Art und Zusammensetzung des Futtermittels sowie in Abhängigkeit vom Zweck der Untersuchung ist eines der beiden nachstehend beschriebenen Verfahren anzuwenden. Zur Bestimmung des Rohöl- und Rohfettgehalts von Ölsaaten und Ölfrüchten sowie von Futtermitteln, bei denen der Rohöl-/Rohfettgehalt 15 % übersteigt, sollte die Extraktion mithilfe des Verfahrens A und die erneute Extraktion mithilfe des Verfahrens B (Nummer 5.3) durchgeführt werden.

1.1.
Verfahren A — Direkt extrahierbare Rohöle und Rohfette

Das Verfahren ist anzuwenden bei Futtermittel-Ausgangserzeugnissen pflanzlichen Ursprungs mit Ausnahme derjenigen, die in den Anwendungsbereich des Verfahrens B fallen.

1.2.
Verfahren B — Gesamtgehalt an Rohölen und Rohfetten

Das Verfahren ist anzuwenden bei Futtermittel-Ausgangserzeugnissen tierischen Ursprungs und bei allen Mischfuttermitteln. Es ist außerdem bei allen Erzeugnissen anzuwenden, aus denen Öle und Fette ohne vorherige Hydrolyse nicht vollständig extrahiert werden können (z. B. Kleber, Hefen, Kartoffeleiweiß und Erzeugnisse, die Verfahren unterzogen wurden wie Extrudieren, Flockieren und Erhitzen).

1.3.
Auswertung der Ergebnisse

In allen Fällen, in denen mit Verfahren B ein höheres Ergebnis erzielt wird als mit Verfahren A, gilt das mit Verfahren B erhaltene Ergebnis als der richtige Wert.

2.
Prinzip

2.1.
Verfahren A

Die Probe wird mit Petrolether extrahiert. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand getrocknet und gewogen.

2.2.
Verfahren B

Die Probe wird unter Erhitzen mit Salzsäure behandelt. Die Mischung wird abgekühlt und filtriert. Der gewaschene und getrocknete Rückstand wird nach Verfahren A weiterbehandelt.

3.
Reagenzien

3.1.: Petrolether, Siedeintervall: 40 bis 60 °C. Die Bromzahl muss weniger als 1 und der Abdampfrückstand weniger als 2 mg/100 ml betragen.

3.2.: Natriumsulfat, wasserfrei.

3.3.: Salzsäure, c = 3 mol/l.

3.4.: Filterhilfsmittel, z. B. Kieselgur, Hyflo-Supercel.

4.
Geräte

4.1.: Extraktionsapparat: Sofern das Gerät mit einem Siphon (Soxhletapparat) ausgestattet ist, muss die Rückflussmenge so bemessen sein, dass das Lösungsmittel mindestens 10-mal in der Stunde abläuft. Wenn es sich um ein Gerät ohne Siphon handelt, muss die Rückflussmenge etwa 10 ml/min betragen.

4.2.: Extraktionshülsen: Diese müssen frei sein von petroletherlöslichen Stoffen und eine Porosität besitzen, die den Anforderungen nach Nummer 4.1 genügt.

4.3.: Trockenschrank: Vakuumtrockenschrank, eingestellt auf 75 °C (± 3 °C,) oder Lufttrockenschrank, eingestellt auf 100 °C (± 3 °C).

5.
Verfahren

5.1.
Verfahren A (siehe Bemerkung 8.1)

Von der Probe werden 5 g auf 1 mg genau abgewogen, dann in eine Extraktionshülse (Nummer 4.2) überführt und mit einem fettfreien Wattebausch abgedeckt. Die Hülse wird in einen Extraktionsapparat (Nummer 4.1) eingesetzt und 6 h lang mit Petrolether (Nummer 3.1) extrahiert. Der Petroletherextrakt wird in einem trockenen, mit einigen Körnern Bimsstein⁽⁶⁾ versehenen, tarierten Kolben aufgefangen. Nach beendeter Extraktion wird das Lösungsmittel abdestilliert. Anschließend wird der Rückstand mit Kolben 1,5 h im Trockenschrank (Nummer 4.3) getrocknet und nach dem Abkühlen in einem Exsikkator gewogen. Durch eine zweite Trocknung von 30 min Dauer ist zu prüfen, ob das Gewicht der Öle und Fette konstant geblieben ist (der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 1 mg nicht überschreiten).

5.2.
Verfahren B

Von der Probe werden 2,5 g auf 1 mg genau abgewogen (siehe Bemerkung 8.2) und in ein 400-ml-Becherglas oder einen 300-ml-Erlenmeyerkolben gebracht. Anschließend werden 100 ml Salzsäure (Nummer 3.3) und einige Körner Bimsstein hinzugefügt. Das Becherglas wird mit einem Uhrglas abgedeckt, bzw. dem Erlenmeyerkolben wird ein Rückflusskühler aufgesetzt. Das Gemisch wird auf kleiner Flamme oder auf einer Heizplatte bis zum Siedepunkt erhitzt und 1 h lang schwach sieden gelassen. Es ist zu verhindern, dass das Material sich an den Wänden des Gefäßes festsetzt. Dann wird abgekühlt und so viel vom Filterhilfsmittel (Nummer 3.4) zugesetzt, dass beim Filtrieren kein Öl- bzw. Fettverlust eintritt. Filtriert wird unter Verwendung eines feuchten, fettfreien doppelten Filterpapiers. Der Rückstand wird bis zur neutralen Reaktion mit kaltem Wasser gewaschen. Danach ist zu überprüfen, dass das Filtrat keine Öle und Fette mehr enthält. Bei Vorhandensein von Ölen oder Fetten muss vor der Hydrolyse eine Extraktion der Probe mit Petrolether nach Verfahren A vorgenommen werden. Das doppelte Filterpapier mit dem Rückstand ist auf ein Uhrglas zu legen und ca. 1,5 h lang bei 100 °C (± 3 °C) im Lufttrockenschrank (Nummer 4.3) zu trocknen. Das doppelte Filterpapier mit dem trockenen Rückstand wird in eine Extraktionshülse (Nummer 4.2) überführt und mit einem fettfreien Wattebausch abgedeckt. Die Hülse wird in einen Extraktionsapparat (Nummer 4.1) eingesetzt. Dann wird, wie unter Nummer 5.1 Absätze 2 und 3 beschrieben, weiterverfahren.

5.3.
Verfahren A und erneute Extraktion mithilfe des Verfahrens B

Zur Bestimmung des Rohöl- und Rohfettgehalts von Ölsaaten und Ölfrüchten sowie von Futtermitteln, bei denen der Rohöl-/Rohfettgehalt 15 % übersteigt, sollte die Extraktion mithilfe des Verfahrens A und die erneute Extraktion mithilfe des Verfahrens B durchgeführt werden. Dies bedeutet, dass nach der Extraktion mit Petrolether (Verfahren A) der Rückstand oder ein Teil des Rückstands mit Salzsäure erneut extrahiert wird (Verfahren B). Der Rohöl- und Rohfettgehalt ist die Summe der Ergebnisse der Verfahren A und B.

6.
Angabe der Ergebnisse

Das Gewicht des Rückstands wird als Prozentsatz der Probe ausgedrückt.

7.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen eines Analytikers bei ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—: 0,2 % absolut bei Gehalten an Rohölen und -fetten von unter 5 %,
—: 4,0 % relativ zum höchsten Wert bei Gehalten von 5 bis 10 %,
—: 0,4 % absolut bei Gehalten über 10 %.

8.
Bemerkungen

8.1.

Bei Erzeugnissen mit hohem Öl- und Fettgehalt, die schwer zu zerkleinern sind oder sich zur Entnahme einer reduzierten homogenen Analysenprobe nicht eignen, ist folgendermaßen zu verfahren:

Von der Probe werden 20 g auf 1 mg genau abgewogen und mit 10 g oder mehr wasserfreiem Natriumsulfat (Nummer 3.2) gemischt. Dann wird mit Petrolether (Nummer 3.1) extrahiert, wie unter Nummer 5.1 beschrieben. Der dabei aufgefangene Extrakt wird mit Petrolether (Nummer 3.1) auf 500 ml aufgefüllt und gemischt. Von der Lösung werden 50 ml entnommen und in einen kleinen, trockenen, mit Bimssteinkörnchen versehenen und tarierten Kolben gebracht. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und dann wird, wie unter Nummer 5.1 letzter Absatz beschrieben, getrocknet und weiterverfahren.

Der Extraktionsrückstand in der Hülse wird vom Lösungsmittel befreit, auf 1 mm zerkleinert und wieder zurück in die Extraktionshülse gebracht (ohne Zugabe von Natriumsulfat). Dann wird, wie unter Nummer 5.1 Absätze 2 und 3 beschrieben, weiterverfahren.

Der Gehalt an Ölen und Fetten, ausgedrückt als Prozentsatz der Probe, wird nach folgender Formel berechnet:

10 m1m2 × 5

wobei:

m₁=: Gewicht des Rückstands in g nach der ersten Extraktion (aliquoter Teil des Extrakts),
m₂=: Gewicht des Rückstands in g nach der zweiten Extraktion.

8.2.: Bei einigen Erzeugnissen (z. B. öl- und fettarmen Erzeugnissen) kann die Einwaage erhöht werden.

8.3.: Heimtierfutter mit hohem Wassergehalt muss vor der Hydrolyse und Extraktion nach Verfahren B möglicherweise mit wasserfreiem Natriumsulfat gemischt werden.

8.4.: Bei dem Verfahren nach Nummer 5.2 kann die Verwendung von heißem statt kaltem Wasser zum Waschen des Rückstands nach der Filtration möglicherweise wirksamer sein.

8.5.: Die Trocknungszeit von 1,5 h muss bei einigen Futtermitteln möglicherweise verlängert werden. Übermäßiges Trocknen ist zu vermeiden, da dies zu niedrigen Ergebnissen führen kann. Es kann auch ein Mikrowellengerät verwendet werden.

H.
BESTIMMUNG DES ROHFASERGEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt an säure- und alkaliunlöslichen, fettfreien organischen Bestandteilen, herkömmlicherweise als Rohfaser bezeichnet, in Futtermitteln bestimmen. Die Methode ist nicht anwendbar in Bezug auf Lignozellulose und Pflanzenkohle (zu feine Partikel).

2.
Prinzip

Die gegebenenfalls entfettete Probe wird nacheinander mit kochender Schwefelsäurelösung und kochender Kaliumhydroxidlösung definierter Konzentrationen behandelt. Der Rückstand wird durch Filtration auf einem gesinterten Glasfilter getrennt, gewaschen, getrocknet, gewogen und bei 475 bis 500 °C verascht. Der Gewichtsverlust bei dieser Veraschung entspricht der Rohfaser der Einwaage.

3.
Reagenzien

3.1.: Schwefelsäure, c = 0,13 mol/l.

3.2.: Antischaummittel (z. B. n-Oktanol).

3.3.: Filterhilfsmittel (Celite 545 oder gleichwertiges Mittel), 4 h lang auf 500 °C erhitzt (8.6).

3.4.: Aceton.

3.5.: Petrolether, Siedeintervall: 40 bis 60 °C.

3.6.: Salzsäure, c = 0,5 mol/l.

3.7.: Kaliumhydroxidlösung, c = 0,23 mol/l.

4.
Geräte

4.1.: Heizvorrichtung für den Aufschluss mit Schwefelsäure und Kaliumhydroxidlösung, ausgestattet mit einer Halterung für den Glasfiltertiegel (Nummer 4.2) und einem Abflussrohr mit Hahn zum Flüssigkeitsablauf, für den Vakuumanschluss und, sofern möglich, auch mit einem Anschluss für die Zufuhr von Druckluft. Vor der täglichen Inbetriebnahme muss die gesamte Apparatur mit Wasser 5 min erhitzt werden.

4.2.: Glasfiltertiegel mit eingeschmolzenem gesintertem Glasfilter (Porengröße 40 bis 90 μm). Vor dem erstmaligen Gebrauch wird der Tiegel einige Minuten bei 500 °C geglüht und dann abkühlen gelassen (Nummer 8.6).

4.3.: Siedezylinder (mindestens 270 ml) mit einem Rückflusskühler.

4.4.: Trockenschrank mit Thermostat.

4.5.: Muffelofen mit Thermostat.

4.6.: Extraktionsvorrichtung mit einer Halterung für den Glasfiltertiegel (Nummer 4.2) und einem Abflussrohr mit Hahn für den Flüssigkeitsablauf und den Vakuumanschluss.

4.7.: Verbindungsringe zur Verbindung von Heizvorrichtung (Nummer 4.1), Filtertiegel (Nummer 4.2) und Siedezylinder (Nummer 4.3), Verbindungsringe zur Verbindung von Kaltextraktionsvorrichtung (Nummer 4.6) und Filtertiegel.

5.
Verfahren

Von der vorbereiteten Probe werden 1 g auf 1 mg genau in den Glasfiltertiegel (Nummer 4.2) eingewogen (siehe Bemerkungen 9.1, 9.2 und 9.3), und es wird 1 g Filterhilfsmittel (Nummer 3.3) hinzugefügt. Der Glasfiltertiegel (Nummer 4.2) wird in die Heizvorrichtung (Nummer 4.1) eingesetzt und mit dem Siedezylinder (Nummer 4.3) verbunden. 150 ml auf Siedetemperatur erhitzte Schwefelsäure (Nummer 3.1) werden in den mit dem Tiegel verbundenen Siedezylinder überführt, und es werden erforderlichenfalls einige Tropfen Antischaummittel (Nummer 3.2) hinzugefügt. Die Flüssigkeit wird innerhalb von 5 ± 2 min zum Sieden erhitzt und genau 30 min lang im kräftigen Sieden gehalten. Der Hahn im Abflussrohr (Nummer 4.1) wird geöffnet und die Schwefelsäure mithilfe von Vakuum durch den Glasfiltertiegel abgesaugt. Der Filterrückstand wird 3-mal mit je 30 ml kochendem Wasser gewaschen. Nach jedem Waschvorgang ist der Rückstand trocken zu saugen. Der Auslaufhahn wird geschlossen, und es werden 150 ml siedende Kaliumhydroxidlösung (Nummer 3.7) und einige Tropfen Antischaummittel (Nummer 3.2) in den mit dem Siedezylinder verbundenen Glasfiltertiegel gegeben. Die Flüssigkeit wird innerhalb von 5 ± 2 min zum Sieden erhitzt und genau 30 min lang im kräftigen Sieden gehalten. Nach dem Filtern wird das Waschen des Rückstands in der gleichen Weise durchgeführt wie nach der Behandlung mit Schwefelsäure. Nach dem letzten Waschen wird der Rückstand trocken gesaugt und der Tiegel mit Inhalt vom Siedezylinder gelöst und an die Kaltextraktionsvorrichtung (Nummer 4.6) angeschlossen. Unter Anlegen von Vakuum wird der Rückstand im Tiegel 3-mal mit je 25 ml Aceton (Nummer 3.4) gewaschen, wobei der Rückstand nach jedem Waschvorgang trocken zu saugen ist. Der Filtertiegel mit Inhalt wird im Trockenschrank bei 130 °C bis zur Massekonstanz getrocknet, in einem Exsikkator abgekühlt und anschließend rasch gewogen. Danach wird der Filtertiegel mit Inhalt in einen Muffelofen gebracht und mindestens 30 min lang bei einer Temperatur von 475 bis 500 °C bis zur Massekonstanz verascht (der Gewichtsverlust bei 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 2 mg nicht überschreiten). Nach dem Erhitzen wird der Tiegel zunächst im Muffelofen und dann im Exsikkator abgekühlt und anschließend gewogen. Es wird ein Blindversuch ohne Probe durchgeführt. Der beim Veraschen auftretende Gewichtsverlust darf 4 mg nicht überschreiten.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Rohfaser als Prozentsatz der Probe wird nach folgender Formel berechnet: Xm0 – m1 × 100m wobei:

m=: Einwaage in g,
m₀=: Gewichtsverlust nach dem Veraschen während der Bestimmung, in g,
m₁=: Gewichtsverlust nach dem Veraschen während des Blindversuchs, in g.

7.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—: 0,6 % absolut bei einem Rohfasergehalt von weniger als 10 %,
—: 6 % relativ zum höheren Wert bei einem Rohfasergehalt von 10 % oder mehr.

8.
Vergleichbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe in unterschiedlichen Laboratorien darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—: 1,0 % absolut bei einem Rohfasergehalt von weniger als 10 %,
—: 10 % relativ zum höheren Wert bei einem Rohfasergehalt von 10 % oder mehr.

9.
Bemerkungen

9.1.: Futtermittel, die mehr als 10 % Rohfett enthalten, müssen vor der Analyse mit Petrolether (Nummer 3.5) entfettet werden. Dazu wird der Glasfiltertiegel (Nummer 4.2) mit Inhalt an die Kaltextraktionsvorrichtung (Nummer 4.6) angeschlossen und unter Anlegen von Vakuum 3-mal mit je 30 ml Petrolether gewaschen, wobei sichergestellt wird, dass der Rückstand trocken ist. Der Tiegel mit Inhalt wird an die Heizvorrichtung (Nummer 4.1) angeschlossen. Danach ist gemäß Nummer 5 weiterzuverfahren.

9.2.: Futtermittel, die Fette enthalten, welche nicht direkt mit Petrolether (Nummer 3.5) extrahiert werden können, müssen, wie unter Nummer 8.1 angegeben, entfettet werden und nach dem Sieden mit Säure ein weiteres Mal entfettet werden. Nach dem Sieden mit Säure und dem anschließenden Waschvorgang wird der Tiegel mit Inhalt an die Kaltextraktionsvorrichtung (Nummer 4.6) angeschlossen und 3-mal mit je 30 ml Aceton und danach weitere 3-mal mit je 30 ml Petrolether entfettet. Der Filtertiegel wird mithilfe von Vakuum trocken gesaugt und die Analyse wird, wie unter Nummer 5 beschrieben, fortgesetzt, beginnend mit der Behandlung mit Kaliumhydroxidlösung.

9.3.: Bei Futtermitteln, die mehr als 5 % Carbonate, ausgedrückt als Calciumcarbonat, enthalten, wird der Tiegel (Nummer 4.2) mit der eingewogenen Probemenge an die Heizvorrichtung (Nummer 4.1) angeschlossen. Die Probe wird 3-mal mit je 30 ml Salzsäure (Nummer 3.6) gewaschen. Nach jeder Zugabe wird die Probe vor dem Absaugen etwa 1 min lang stehen gelassen. Anschließend wird 1-mal mit 30 ml Wasser gewaschen. Danach ist wie unter Nummer 5 angegeben weiterzuverfahren.

9.4.: Wenn ein Gerät benutzt wird, bei dem mehrere Glasfiltertiegel an derselben Heizvorrichtung gleichzeitig befestigt sind, dürfen in derselben Untersuchungsreihe keine 2 Einzelbestimmungen an ein und derselben Probe vorgenommen werden.

9.5.: Wenn nach dem Sieden mit Säure bzw. Lauge Schwierigkeiten bei der Filtration auftreten, wird der Heizvorrichtung durch das Auslassrohr Druckluft zugeführt und anschließend die Filtration fortgesetzt.

9.6.: Die Veraschungstemperatur darf 500 °C nicht überschreiten, um die Haltbarkeit der Glasfiltertiegel zu verlängern. Beim Erhitzen und Abkühlen sind vor allem übermäßige Temperatursprünge zu vermeiden.

I.
BESTIMMUNG DES ZUCKERGEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt an reduzierenden Zuckern und an Gesamtzucker nach Inversion, ausgedrückt als Glucose oder gegebenenfalls nach Multiplikation mit dem Faktor 0,95 als Saccharose, bestimmen. Sie wird bei Mischfuttermitteln angewendet. Für andere Futtermittel sind besondere Verfahren vorgesehen. Gegebenenfalls muss der Gehalt an Lactose getrennt bestimmt und dieses Ergebnis bei der Berechnung berücksichtigt werden. Die Methode ist anzuwenden, um den Zuckergehalt für die Berechnung des Energiegehalts des Futtermittels zu bestimmen. Ist der Zuckergehalt für andere Zwecke zu bestimmen, können andere Analysemethoden angewendet werden.

2.
Prinzip

Die Zucker werden in verdünntem Ethanol gelöst; die Lösung wird mit den Lösungen Carrez I und II geklärt. Nach dem Verdunsten des Ethanols werden vor und nach der Inversion die Bestimmungen nach der Luff-Schoorl-Methode durchgeführt.

3.
Reagenzien

3.1.: Ethanollösung (Volumenkonzentration = 40 %), Dichte: 0,948 g/ml bei 20 °C, auf den Umschlagspunkt von Phenolphthalein eingestellt.

3.2.: Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkacetat, Zn (CH₃COO)₂·2H₂O, und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.3.: Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat(II), K₄Fe(CN)₆·3H₂O, werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.4.: Methylorangelösung (Massenkonzentration = 0,1 %).

3.5.: Salzsäure 4 mol/l.

3.6.: Salzsäure 0,1 mol/l.

3.7.: Natriumhydroxidlösung 0,1 mol/l.

3.8.

Reagenz nach Luff-Schoorl:

Die Zitronensäurelösung (Nummer 3.8.2) unter vorsichtigem Rühren in die Natriumcarbonatlösung (Nummer 3.8.3) gießen. Nach Zugabe der Kupfersulfatlösung (Nummer 3.8.1) mit Wasser auf 1 l auffüllen. Über Nacht absetzen lassen und dann filtrieren.

Die Konzentration des so erhaltenen Reagenz (Cu 0,05 mol/l; Na₂CO₃ 1 mol/l) prüfen, siehe Nummer 5.4 letzter Absatz. Der pH-Wert der Lösung muss bei etwa 9,4 liegen.

3.8.1.: Kupfersulfatlösung: 25 g Kupfersulfat, CuSO₄·5H₂O, eisenfrei, werden in 100 ml Wasser gelöst.

3.8.2.: Zitronensäurelösung: 50 g Zitronensäure, C₆H₈O₇·Η₂O werden in 50 ml Wasser gelöst.

3.8.3.: Natriumcarbonatlösung: 143,8 g Natriumcarbonat, wasserfrei, werden in ca. 300 ml warmem Wasser gelöst. Abkühlen lassen.

3.9.: Natriumthiosulfatlösung 0,1 mol/l.

3.10.: Stärkelösung: Eine Aufschlämmung von 5 g löslicher Stärke in 30 ml Wasser wird zu 1 l siedendem Wasser hinzugefügt und 3 min lang im Sieden halten; dann wird abgekühlt und es werden gegebenenfalls 10 mg Quecksilberiodid als Konservierungsmittel hinzugefügt.

3.11.: Schwefelsäure 3 mol/l.

3.12.: Kaliumiodidlösung (Massenkonzentration = 30 %).

3.13.: Bimssteinkörner, mit Salzsäure ausgekocht, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

3.14.: 3-Methylbutan-1-ol.

4.
Geräte

Mechanisches Schüttelgerät: ca. 35 bis 40 min^-1.

5.
Verfahren

5.1.
Extraktion der Probe

Von der Probe werden 2,5 g auf 1 mg genau in einen 250-ml-Messkolben eingewogen. Nach Zugabe von 200 ml Ethanol (Nummer 3.1) wird der Kolben 1 h lang im Schüttelgerät gemischt. Anschließend werden 5 ml Carrez-Lösung I (Nummer 3.2) hinzugefügt, und es wird ca. 30 s lang gerührt. Dann werden 5 ml Carrez-Lösung II (Nummer 3.3) hinzugefügt, und es wird nochmals 1 min lang gerührt; nun wird mit Ethanol (Nummer 3.1) zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert. Vom Filtrat werden 200 ml abpipettiert und auf ungefähr die Hälfte des Volumens eingeengt, um den größten Teil des Ethanols zur Verdunstung zu bringen. Der Abdampfrückstand wird mit warmem Wasser in einen 200-ml-Messkolben übergespült, abgekühlt, mit Wasser zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und, falls erforderlich, filtriert. Diese Lösung wird für die Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern und nach Inversion zur Bestimmung des Gesamtzuckers verwendet.

5.2.
Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern

Eine Menge von höchstens 25 ml der Lösung, die weniger als 60 mg reduzierende Zucker, ausgedrückt als Glucose, enthält, wird abpipettiert, falls erforderlich mit destilliertem Wasser auf 25 ml aufgefüllt, und es wird der Gehalt an reduzierendem Zucker nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt. Das Ergebnis wird als Prozentsatz Glucose in der Probe ausgedrückt.

5.3.
Bestimmung des Gehalts an Gesamtzucker nach Inversion

Von der Lösung werden 50 ml in einen 100-ml-Messkolben pipettiert. Es werden einige Tropfen Methylorangelösung (Nummer 3.4) hinzugefügt und dann wird vorsichtig unter ständigem Rühren Salzsäure (Nummer 3.5) bis zum eindeutigen Umschlag nach Rot hinzugegeben. Dann werden 15 ml Salzsäure (Nummer 3.6) hinzugefügt, und der Kolben wird 30 min lang in ein Bad mit kräftig siedendem Wasser gestellt. Es wird schnell auf etwa 20 °C abgekühlt und es werden 15 ml Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.7) hinzugegeben. Nun wird mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt und homogenisiert. Es wird eine Menge von höchstens 25 ml entnommen, die weniger als 60 mg reduzierende Zucker, ausgedrückt als Glucose, enthält. Falls erforderlich, wird mit destilliertem Wasser auf 25 ml aufgefüllt und der Gehalt an reduzierenden Zuckern nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt. Das Ergebnis wird als Prozentsatz Glucose oder gegebenenfalls nach Multiplikation mit dem Faktor 0,95 als Saccharose ausgedrückt.

5.4.
Titration nach Luff-Schoorl

In einen 300-ml-Erlenmeyerkolben werden 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl (Nummer 3.8) pipettiert und anschließend genau 25 ml der geklärten Zuckerlösung hinzugefügt. Nach Zugabe von 2 Körnchen Bimsstein (Nummer 3.13) wird unter Schütteln mit der Hand über freier Flamme von mittlerer Höhe erhitzt, sodass die Flüssigkeit in etwa 2 min zum Sieden kommt. Anschließend wird der Erlenmeyerkolben sofort auf ein Drahtnetz mit einer Asbestscheibe, in die ein Loch von etwa 6 cm Durchmesser gestanzt wurde, gestellt; vorher wird unter dem Drahtnetz eine Flamme entzündet und so eingestellt, dass der Kolben nur am Boden erhitzt wird. Dann wird der Kolben mit einem Rückflusskühler verbunden. Von diesem Augenblick an wird der Kolben genau 10 min lang sieden gelassen. Anschließend wird er sofort in kaltem Wasser abgekühlt und nach etwa 5 min wird wie folgt titriert: Der Flüssigkeit werden 10 ml Kaliumiodidlösung (Nummer 3.12) und unmittelbar danach, aber vorsichtig (wegen der Gefahr des übermäßigen Schäumens), 25 ml Schwefelsäure (Nummer 3.11) zugegeben. Dann wird mit Natriumthiosulfatlösung (Nummer 3.9) zunächst bis zum Auftreten einer mattgelben Farbe titriert und nach Zugabe von Stärkelösung (Nummer 3.10) als Indikator die Titration zu Ende geführt. Die gleiche Titration wird in einer Mischung aus genau 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl (Nummer 3.8) und 25 ml Wasser nach Zugabe von 10 ml Kaliumiodidlösung (Nummer 3.12) und 25 ml Schwefelsäure (Nummer 3.11) durchgeführt, jedoch ohne vorheriges Erhitzen.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Aus der unten angeführten Tabelle wird die Menge Glucose in mg abgelesen, die der Differenz der Ergebnisse beider Titrationen, ausgedrückt in ml Natriumthiosulfatlösung (0,1 mol/l), entspricht. Das Ergebnis wird als Prozentsatz der Probe angegeben.

7.
Sonderverfahren

7.1.: Bei sehr stark melassehaltigen Futtermitteln und anderen wenig homogenen Futtermitteln werden 20 g in einen 1-l-Messkolben eingewogen, es werden 500 ml Wasser hinzugefügt und dann wird 1 h lang im Schüttelgerät gemischt. Danach wird — jedoch mit jeweils der 4-fachen Menge der Carrez-Lösungen I (Nummer 3.2) und II (Nummer 3.3) — wie unter Nummer 5.1 beschrieben geklärt. Anschließend wird mit Ethanol (Volumenkonzentration = 80 %) zur Marke aufgefüllt.
Die Lösung wird homogenisiert und filtriert. Das Ethanol wird, wie unter Nummer 5.1 beschrieben, entfernt. Bei Abwesenheit verkleisterter Stärke wird mit destilliertem Wasser zur Marke aufgefüllt.

7.2.: Bei Melasse und Futtermittel-Ausgangserzeugnissen, die reich an Zucker, aber praktisch stärkefrei sind (Johannisbrot, Zuckerrübentrockenschnitzel usw.), werden 5 g in einen 250-ml-Messkolben eingewogen und 200 ml destilliertes Wasser hinzugefügt. Dann wird 1 h lang oder, falls erforderlich, länger im Schüttelgerät gemischt. Danach wird mit den Carrez-Lösungen I (Nummer 3.2) und II (Nummer 3.3), wie unter Nummer 5.1 beschrieben, geklärt und anschließend mit kaltem Wasser zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert. Zur Bestimmung des Gesamtzuckergehalts wird, wie unter Nummer 5.3 beschrieben, weiterverfahren.

8.
Bemerkungen

8.1.: Es wird empfohlen, vor dem Erhitzen mit dem Luff-Schoorl-Reagenz (unabhängig vom Volumen) etwa 1 ml 3-Methylbutan-1-ol (Nummer 3.14) hinzuzufügen, um die Schaumbildung zu vermeiden.

8.2.: Die Differenz zwischen dem Gehalt an Gesamtzucker nach Inversion, ausgedrückt als Glucose, und dem Gehalt an reduzierenden Zuckern, ausgedrückt als Glucose, ergibt nach Multiplikation mit dem Faktor 0,95 das Ergebnis als Prozentsatz Saccharose.

8.3.: Zur Bestimmung des Gehalts an reduzierenden Zuckern, mit Ausnahme von Milchzucker (Lactose), gibt es 2 Möglichkeiten:

8.3.1.: Für eine annähernde Berechnung wird der aus einer getrennten Bestimmung ermittelte Lactosegehalt mit 0,675 multipliziert und das Ergebnis von dem Gehalt an reduzierenden Zuckern abgezogen.

8.3.2.

Für eine genaue Berechnung der reduzierenden Zucker (mit Ausnahme von Lactose) ist es notwendig, dass beiden endgültigen Bestimmungen die gleiche Menge der Einwaage zugrunde liegt. Die eine Bestimmung wird in einem Teil der nach Nummer 5.1. hergestellten Lösung durchgeführt, die zweite Bestimmung in einem Teil der Lösung, die bei der Bestimmung des Lactosegehalts mittels der für diesen Zweck vorgesehenen Methode (nach Vergärung der anderen Zuckerarten und Klärung) hergestellt wird.

In beiden Fällen wird der anwesende Zucker nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt und in mg Glucose berechnet. Diese beiden Werte werden voneinander subtrahiert und die Differenz wird als Prozentsatz der Probe ausgedrückt.

Beispiel

Die beiden abpipettierten Mengen entsprechen bei jeder Bestimmung einer Probeneinwaage von 250 mg.

Im ersten Fall werden 17 ml Natriumthiosulfatlösung 0,1 mol/l, entsprechend 44,2 mg Glucose, verbraucht; im zweiten Fall werden 11 ml, entsprechend 27,6 mg Glucose, verbraucht.

Die Differenz beträgt also 16,6 mg Glucose.

Der Gehalt an reduzierenden Zuckern (mit Ausnahme von Lactose), berechnet als Glucose, ist demnach

4 ×16,6106,64%

Tabelle für 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl

ml Na₂S₂O₃ 0,1 mol/l, 2 min lang erhitzen, 10 min lang sieden

Na₂S₂O₃ 0,1 mol/l	Glucose, Fructose, Invertzucker C₆H₁₂O₆	Lactose C₁₂H₂₂O₁₁	Na₂S₂O₃ 0,1 mol/l
ml	mg	Differenz	mg	Differenz	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Na₂S₂O₃

0,1 mol/l

Glucose, Fructose, Invertzucker

C₆H₁₂O₆

Lactose

C₁₂H₂₂O₁₁

Na₂S₂O₃

0,1 mol/l

Differenz

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

27,6

30,3

33,0

35,7

38,5

41,3

44,2

47,1

50,0

53,0

56,0

59,1

62,2

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,0

3,1

3,6

7,3

11,0

14,7

18,4

22,1

25,8

29,5

33,2

37,0

40,8

44,6

48,4

52,2

56,0

59,9

63,8

67,7

71,7

75,7

79,8

83,9

88,0

3,7

3,8

3,9

4,0

4,1

J.
BESTIMMUNG DES LACTOSEGEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Lactosegehalt von Futtermitteln bestimmen, die mehr als 0,5 % Lactose enthalten.

2.
Prinzip

Die Zucker werden in Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Hefe — Saccharomyces cerevisiae — vergoren, wobei die Lactose nicht angegriffen wird. Nach Klärung und Filtration wird der Gehalt an Lactose im Filtrat nach der Luff-Schoorl-Methode bestimmt.

3.
Reagenzien

3.1.: Saccharomyces-cerevisiae-Suspension: 25 g frische Hefe werden in 100 ml Wasser suspendiert. Im Kühlschrank ist die Suspension höchstens 1 Woche haltbar.

3.2.: Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkacetat, Zn (CH₃COO)₂·2H₂O, und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.3.: Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat(II), K₄Fe(CN)₆·3H₂O, werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.4.: Reagenz nach Luff-Schoorl:
Die Zitronensäurelösung (Nummer 3.4.2) wird unter vorsichtigem Rühren in die Natriumcarbonatlösung (Nummer 3.4.3) gegossen. Nach Zugabe der Kupfersulfatlösung (Nummer 3.4.1) wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt. Über Nacht absetzen lassen und dann filtrieren. Die Konzentration des so erhaltenen Reagenz (Cu 0,05 mol/l; Na₂CO₃ 1 mol/l) muss geprüft werden. Der pH-Wert der Lösung muss bei etwa 9,4 liegen.

3.4.1.: Kupfersulfatlösung: 25 g Kupfersulfat, CuSO₄·5H₂O, eisenfrei, werden in 100 ml Wasser gelöst.

3.4.2.: Zitronensäurelösung: 50 g Zitronensäure, C₆H₈O₇·Η₂O werden in 50 ml Wasser gelöst.

3.4.3.: Natriumcarbonatlösung: 143,8 g Natriumcarbonat, wasserfrei, werden in ca. 300 ml warmem Wasser gelöst. Die Lösung wird abkühlen gelassen.

3.5.: Bimssteinkörner, mit Salzsäure ausgekocht, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

3.6.: Kaliumiodidlösung (Massenkonzentration = 30 %).

3.7.: Schwefelsäure 3 mol/l.

3.8.: Natriumthiosulfatlösung 0,1 mol/l.

3.9.: Stärkelösung: Eine Aufschlämmung von 5 g löslicher Stärke in 30 ml Wasser wird zu 1 l siedendem Wasser hinzugefügt und 3 min lang im Sieden halten; dann wird abgekühlt und es werden gegebenenfalls 10 mg Quecksilberiodid als Konservierungsmittel hinzugefügt.

4.
Geräte

Wasserbad mit Thermostat, auf 38 bis 40 °C eingestellt.

5.
Verfahren

Von der Probe wird 1 g auf 1 mg genau eingewogen und mit 25 bis 30 ml Wasser in einen 100-ml-Messkolben gebracht. Der Messkolben wird 30 min lang in ein Bad mit siedendem Wasser gestellt und dann auf etwa 35 °C abgekühlt. Anschließend werden 5 ml Hefesuspension (Nummer 3.1) zugefügt und es wird homogenisiert. Der Kolben wird 2 h lang in einem Wasserbad bei 38 bis 40 °C stehen gelassen und auf etwa 20 °C abgekühlt. Danach werden 2,5 ml Carrez-Lösung I (Nummer 3.2) hinzugefügt, und es wird 30 s lang gerührt. Dann werden 2,5 ml Carrez-Lösung II (Nummer 3.3) hinzugefügt, und es wird nochmals 30 s lang gerührt. Nun wird mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt, gemischt und filtriert. Vom Filtrat wird eine Menge von höchstens 25 ml, die möglichst 40 bis 80 mg Lactose enthält, in einen 300-ml-Erlenmeyerkolben abpipettiert. Gegebenenfalls wird mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt. Auf dieselbe Weise wird ein Blindversuch mit 5 ml Hefesuspension (Nummer 3.1) ausgeführt. Dann wird der Gehalt an Lactose nach der Luff-Schoorl-Methode wie folgt bestimmt: Nach Zugabe von genau 25 ml des Reagenz nach Luff-Schoorl (Nummer 3.4) und von 2 Körnchen Bimsstein (Nummer 3.5) wird unter Schütteln mit der Hand über freier Flamme von mittlerer Höhe erhitzt, sodass die Flüssigkeit in etwa 2 min zum Sieden kommt. Anschließend wird der Erlenmeyerkolben sofort auf ein Drahtnetz mit einer Asbestscheibe, in die ein Loch von etwa 6 cm Durchmesser gestanzt wurde, gestellt; vorher wird unter dem Drahtnetz eine Flamme entzündet und so eingestellt, dass der Kolben nur am Boden erhitzt wird. Dann wird der Kolben mit einem Rückflusskühler verbunden. Von diesem Augenblick an wird der Kolben genau 10 min lang sieden gelassen. Anschließend wird er sofort in kaltem Wasser abgekühlt und nach etwa 5 min wird wie folgt titriert: Zu der Flüssigkeit werden 10 ml Kaliumiodidlösung (Nummer 3.6) und unmittelbar danach, aber vorsichtig (wegen der Gefahr des übermäßigen Schäumens), 25 ml Schwefelsäure (Nummer 3.7) hinzugegeben. Dann wird mit Natriumthiosulfatlösung (Nummer 3.8) zunächst bis zum Auftreten einer mattgelben Farbe titriert und nach Zugabe von Stärkelösung (Nummer 3.9) als Indikator die Titration zu Ende geführt. Die gleiche Titration wird in einer Mischung aus genau 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl (Nummer 3.4) und 25 ml Wasser nach Zugabe von 10 ml Kaliumiodidlösung (Nummer 3.6) und 25 ml Schwefelsäure (Nummer 3.7) durchgeführt, jedoch ohne vorheriges Erhitzen.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Aus der zugehörigen Tabelle wird die Menge Lactose in mg abgelesen, die der Differenz der Ergebnisse beider Titrationen, ausgedrückt in ml Natriumthiosulfatlösung (0,1 mol/l), entspricht. Das Ergebnis entspricht dem Gehalt an wasserfreier Lactose und wird als Prozentsatz der Probe ausgedrückt.

7.
Bemerkung

1.: Wenn mehr als 40 % vergärbare Zucker vorhanden sind, werden mehr als 5 ml Hefesuspension (Nummer 3.1) verwendet.

2.

Bei laktosereduzierten Futtermitteln (z. B. Katzenmilch) wird die Laktose in Fructose umgewandelt, die nicht innerhalb von 2 h komplett fermentiert ist, wodurch höhere oder falsch positive Messergebnisse entstehen (weil Fruktoserückstände im Extrakt verbleiben).

Tabelle für 25 ml Reagenz nach Luff-Schoorl

ml Na₂S₂O₃ 0,1 mol/l, 2 min lang erhitzen, 10 min lang sieden

Na₂S₂O₃ 0,1 mol/l	Glucose, Fructose, Invertzucker C₆H₁₂O₆	Lactose C₁₂H₂₂O₁₁	Na₂S₂O₃ 0,1 mol/l
ml	mg	Differenz	mg	Differenz	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Na₂S₂O₃

0,1 mol/l

Glucose, Fructose, Invertzucker

C₆H₁₂O₆

Lactose

C₁₂H₂₂O₁₁

Na₂S₂O₃

0,1 mol/l

Differenz

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

27,6

30,3

33,0

35,7

38,5

41,3

44,2

47,1

50,0

53,0

56,0

59,1

62,2

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,0

3,1

3,6

7,3

11,0

14,7

18,4

22,1

25,8

29,5

33,2

37,0

40,8

44,6

48,4

52,2

56,0

59,9

63,8

67,7

71,7

75,7

79,8

83,9

88,0

3,7

3,8

3,9

4,0

4,1

K.
BESTIMMUNG DES STÄRKEGEHALTS

POLARIMETRISCHES VERFAHREN

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt an Stärke und ihrer Abbauprodukte mit hoher Molmasse in Futtermitteln zum Zweck der Prüfung ihrer Übereinstimmung mit dem angegebenen Energiegehalt (Anhang VII) und mit der Verordnung (EG) Nr. 767/2009 bestimmen. Die Methode ist anzuwenden, um den Stärkegehalt für die Berechnung des Energiegehalts des Futtermittels zu bestimmen. Ist der Stärkegehalt für andere Zwecke zu bestimmen, können andere Analysemethoden angewendet werden.

2.
Prinzip

Die Methode basiert auf einer doppelten Bestimmung. Bei der ersten Bestimmung wird die Probe mit verdünnter Salzsäure behandelt. Nach Klärung und Filtration wird die optische Drehung der Lösung polarimetrisch gemessen. Bei der zweiten Bestimmung wird die Probe mit 40 %igem Ethanol extrahiert. Nach Behandlung des Filtrats mit Salzsäure wird geklärt, filtriert und die optische Drehung unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten Bestimmung gemessen. Der Unterschied zwischen den beiden Messungen, multipliziert mit einem bekannten Faktor, ergibt den Stärkegehalt der Probe.

3.
Reagenzien

3.1.: Salzsäure, Lösung (Massenanteil = 25 %) Dichte: 1,126 g/ml.

3.2.: Salzsäure, Lösung (Massenkonzentration = 1,13 %).
Die Konzentration muss durch Titration mit Natriumhydroxidlösung (0,1 mol/l) in Gegenwart von Methylrot (Massenkonzentration = 0,1 %) in Ethanol (Volumenkonzentration = 94 %) geprüft werden. Zur Neutralisierung von 10 ml werden 30,94 ml NaOH (0,1 mol/l) benötigt.

3.3.: Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkacetat, Zn (CH₃COO)₂·2H₂O, und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.4.: Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat(II), K₄Fe(CN)₆·3H₂O, werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.5.: Ethanol, Lösung (Volumenkonzentration = 40 %), Dichte: 0,948 g/ml bei 20 °C.

4.
Geräte

4.1.: 250-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen und Rückflusskühler.

4.2.: Polarimeter oder Saccharimeter.

5.
Verfahren

5.1.
Vorbereitung der Probe

Die Probe muss so fein zermahlen werden, dass sie vollständig durch ein Rundlochsieb mit einem Lochdurchmesser von 0,5 mm passiert werden kann.

5.2.
Bestimmung der gesamten optischen Drehung (P oder S) (siehe Bemerkung 7.1)

Von der zermahlenen Probe werden 2,5 g auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen. Es werden 25 ml Salzsäure (Nummer 3.2) hinzugefügt und der Kolben wird geschüttelt, bis sich der Stoff gleichmäßig verteilt hat; dann werden weitere 25 ml Salzsäure (Nummer 3.2) hinzugegeben. Der Kolben wird in ein Bad mit kochendem Wasser gestellt und während der ersten 3 min kräftig und regelmäßig geschüttelt, um die Bildung von Klumpen zu verhindern. Die in dem Wasserbad enthaltene Wassermenge muss ausreichen, um das Wasser auch dann noch über dem Siedepunkt zu halten, wenn der Kolben eingetaucht wird. Während des Schüttelns darf der Kolben nicht aus dem Wasser herausgenommen werden. Nach genau 15 min wird der Kolben aus dem Wasserbad entfernt, es werden 30 ml kaltes Wasser hinzugefügt und es wird unverzüglich auf 20 °C abgekühlt. Danach werden 5 ml Carrez-Lösung I (Nummer 3.3) hinzugefügt, und es wird ca. 30 s lang geschüttelt. Anschließend werden 5 ml Carrez-Lösung II (Nummer 3.4) hinzugefügt, und es wird nochmals ca. 30 s lang geschüttelt. Dann wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, gemischt und filtriert. Ist das Filtrat nicht vollständig klar (was selten vorkommt), muss die Bestimmung mit größeren Mengen Carrez-Lösungen I und II, z. B. 10 ml, wiederholt werden. Anschließend wird die optische Drehung der Lösung in einem 200-mm-Rohr mit einem Polarimeter oder einem Saccharimeter gemessen.

5.3.
Bestimmung der optischen Drehung (P’ oder S’) der in 40 %igem Ethanol löslichen Substanzen

Von der Probe werden 5 g auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen und es werden etwa 80 ml Ethanol (Nummer 3.5) hinzugefügt (siehe Bemerkung 7.2). Anschließend wird der Kolben 1 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen; währenddessen wird er 6-mal kräftig geschüttelt, damit sich die Analysenprobe gründlich mit dem Ethanol vermischt. Dann wird mit Ethanol (Nummer 3.5) zur Marke aufgefüllt, gemischt und filtriert. Von dem Filtrat werden 50 ml (= 2,5 g der Probe) in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben abpipettiert und es werden 2,1 ml Salzsäure (Nummer 3.1) hinzugefügt; der Kolben wird kräftig geschüttelt, an einen Rückflusskühler angeschlossen und in ein Bad mit siedendem Wasser gestellt. Nach genau 15 min wird der Erlenmeyerkolben aus dem Wasserbad herausgenommen und der Inhalt in einen 100-ml-Messkolben mit einer kleinen Menge von kaltem Wasser überspült; anschließend wird auf 20 °C abgekühlt. Danach wird mit den Carrez-Lösungen I (Nummer 3.3) und II (Nummer 3.4) geklärt, mit Wasser zur Marke aufgefüllt, gemischt und filtriert und die optische Drehung gemessen, wie unter Nummer 5.2 Absätze 2 und 3 beschrieben.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Der Stärkegehalt (%) wird wie folgt berechnet:

6.1.
Polarimetrische Messung

Stärkegehalt %2000 × P – P'αD20°

P=: Optische Drehung insgesamt in Winkelgrad
P’=: Optische Drehung in Winkelgrad der in 40 %igem Ethanol löslichen Substanzen
αD20°=: Spezifische optische Drehung von reiner Stärke. Für diesen Faktor werden die nachstehenden, allgemein anerkannten Werte angewendet:

+ 185,9°:: Reisstärke,
+ 185,7°:: Kartoffelstärke,
+ 184,6°:: Maisstärke,
+ 182,7°:: Weizenstärke,
+ 181,5°:: Gerstenstärke,
+ 181,3°:: Haferstärke,
+ 184,0°:: sonstige Stärkearten sowie Stärkegemische in Mischfuttermitteln.

6.2.
Saccharimetrische Messung

Stärkegehalt %2000αD20°×2 N ×0,665 × S – S'100–26,6N × S – S'αD20°

S=

Optische Drehung insgesamt in Saccharimeter-Grad

S’=

Optische Drehung in Saccharimeter-Grad der in 40 %igem Ethanol löslichen Substanzen

N=

Gewicht (g) von Saccharose in 100 ml Wasser, das bei Messung mit einem 200-mm-Rohr eine optische Drehung von 100 Saccharimeter-Grad bewirkt:

16,29 g für die französischen Saccharimeter,

26,00 g für die deutschen Saccharimeter,

20,00 g für gemischte Saccharimeter.

αD20°=

Spezifische optische Drehung von reiner Stärke (siehe Nummer 6.1).

6.3.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,4 (absolut) bei Stärkegehalten von weniger als 40 % und 1 % (relativ) bei Stärkegehalten von 40 % und mehr nicht überschreiten.

7.
Bemerkungen

7.1.: Enthält die Probe mehr als 6 % Carbonate, berechnet als Calciumcarbonat, so müssen diese vor der Bestimmung der gesamten optischen Drehung durch Behandlung mit der genau notwendigen Menge verdünnter Schwefelsäure zerstört werden.

7.2.: Bei Erzeugnissen mit hohem Lactosegehalt, z. B. bei Molkenpulver oder Magermilchpulver, wird nach Zusatz von 80 ml Ethanol (Nummer 3.5) wie folgt verfahren: Der Messkolben wird an einen Rückflusskühler angeschlossen und 30 min lang in ein Wasserbad von 50 °C gestellt. Nach dem Abkühlen wird das Verfahren, wie unter Nummer 5.3 beschrieben, fortgeführt.

7.3.

Folgende Futtermittel-Ausgangserzeugnisse führen, sofern sie in größeren Mengen in Futtermitteln vorhanden sind, erwiesenermaßen zu Interferenzen bei der Bestimmung des Stärkegehalts mithilfe des polarimetrischen Verfahrens und könnten so falsche Ergebnisse zur Folge haben:

—

(Zucker-)Rübenerzeugnisse wie (Zucker-)Rübenschnitzel, (Zucker-)Rübenmelasse, (Zucker-)Rübenmelasseschnitzel, (Zucker-)Rübenvinasse, (Rüben-)Zucker,

—

Zitrustrester,

—

Leinsamen; Leinkuchen; Leinextraktionsschrot,

—

Rapssamen; Rapskuchen; Rapsextraktionsschrot; Rapsschalen,

—

Sonnenblumenkerne; Sonnenblumenextraktionsschrot; Sonnenblumenextraktionsschrot aus teilgeschälter Saat,

—

Kokoskuchen; Kokosextraktionsschrot,

—

Kartoffelpülpe,

—

Trockenhefe,

—

Erzeugnisse mit hohem Inulingehalt (z. B. Topinambur-Chips und -Mehl),

—

Grieben/Grammeln

—

Sojabohnenerzeugnisse.

In diesen Fällen kann die in der Verordnung (EG) Nr. 121/2008 der Kommission⁽⁷⁾ festgelegte Analysemethode angewandt werden. Diese Methode kann auch bei Futtermitteln mit weniger als 1 % Stärke angewandt werden.

L.
BESTIMMUNG DES ROHASCHEGEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Rohaschegehalt von Futtermitteln bestimmen.

2.
Prinzip

Die Probe wird bei 550 °C verascht; der Rückstand wird gewogen.

3.
Reagenzien

Ammoniumnitrat, Lösung (Massenkonzentration = 20 %).

4.
Geräte

4.1.: Heizplatte.

4.2.: Elektrischer Muffelofen mit Thermostat.

4.3.: Veraschungsschalen aus Quarzglas, Porzellan oder Platin, entweder rechteckig (ca. 60 × 40 × 25 mm) oder rund (Durchmesser: 60 bis 75 mm, Höhe: 20 bis 40 mm).

5.
Verfahren

Etwa 5 g (2,5 g bei Stoffen, die zur Blasenbildung neigen) der Probe werden auf 1 mg genau in eine vorher bei 550 °C geglühte, abgekühlte und tarierte Veraschungsschale eingewogen. Die Schale wird auf der Heizplatte allmählich bis zum Verkohlen des Stoffes erhitzt. Die Veraschung erfolgt gemäß Nummer 5.1 oder 5.2.

5.1.: Die Schale wird in den auf 550 °C eingestellten kalibrierten Muffelofen gebracht und darin bei dieser Temperatur so lange gehalten, bis sich eine weiße, hellgraue oder rötliche Asche bildet, die offensichtlich frei von Kohlepartikeln ist. Dann wird die Schale in einen Exsikkator gestellt und unmittelbar nach dem Abkühlen gewogen.

5.2.: Die Schale wird 3 h lang in den auf 550 °C eingestellten kalibrierten Muffelofen gebracht. Dann wird die Schale in einen Exsikkator gestellt und unmittelbar nach dem Abkühlen gewogen. Anhand einer zweiten Veraschung von 30 min Dauer ist sicherzustellen, dass das Gewicht der Asche konstant bleibt (der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 1 mg nicht überschreiten).

6.
Berechnung der Ergebnisse

Das Gewicht des Rückstands wird berechnet, indem das Leergewicht abgezogen wird. Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

7.
Bemerkungen

7.1.: Bei schwer zerstörbaren Stoffen werden der abgekühlten Rohasche nach einer ersten Veraschung von mindestens 3 h einige Tropfen 20%iger Ammoniumnitratlösung oder Wasser zugefügt (jedoch vorsichtig, um ein Zerstäuben oder Verkleben der Asche zu vermeiden). Nach Trocknung im Trockenschrank wird die Veraschung weitergeführt. Der Vorgang wird gegebenenfalls bis zur vollständigen Veraschung wiederholt.

7.2.: Bei Stoffen, die der unter Nummer 7.1 beschriebenen Behandlung widerstehen, ist wie folgt vorzugehen: Nach einer Veraschung von 3 h Dauer wird die Asche mit warmem Wasser aufgenommen und durch einen kleinen aschefreien Filter abfiltriert. In der ursprünglichen Schale werden Filter und dessen Inhalt verascht. Das Filtrat wird in die abgekühlte Schale gebracht, bis zur Trockne eingedampft, verascht und gewogen.

7.3.: Bei Ölen und Fetten wird eine Probe von 25 g in eine Schale entsprechender Abmessung genau eingewogen. Es wird dann durch Anzünden des Stoffes mit einem Streifen aus aschefreiem Filterpapier verkohlt. Nach der Verkohlung wird mit möglichst geringer Menge Wasser angefeuchtet. Anschließend wird getrocknet und die Veraschung, wie unter Nummer 5 beschrieben, zu Ende geführt.

M.
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN IN SALZSÄURE UNLÖSLICHER ASCHE

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt an in Salzsäure unlöslichen, mineralischen Bestandteilen des Futtermittels bestimmen. Abhängig von der Art der Probe können 2 Verfahren angewandt werden.

1.1.: Verfahren A: anzuwenden bei organischen Futtermittel-Ausgangserzeugnissen und bei den meisten Mischfuttermitteln.

1.2.: Verfahren B: anzuwenden bei Mineralstoffen und Mineralstoffmischungen sowie bei allen Mischfuttermitteln, deren Gehalt an in Salzsäure unlöslichen Bestandteilen bei der Bestimmung nach Verfahren A mehr als 1 % beträgt.

2.
Prinzip

2.1.: Verfahren A: Die Probe wird verascht. Die Asche wird in Salzsäure zum Sieden gebracht und der unlösliche Rückstand abfiltriert und gewogen.

2.2.: Verfahren B: Die Probe wird mit Salzsäure behandelt. Die Lösung wird abfiltriert, der Rückstand wird verascht, und die so erhaltene Asche nach Verfahren A weiterbehandelt.

3.
Reagenzien

3.1.: Salzsäure 3 mol/l.

3.2.: Trichloressigsäure, Lösung (Massenkonzentration = 20 %).

3.3.: Trichloressigsäure, Lösung (Massenkonzentration = 1 %).

4.
Geräte

4.1.: Heizplatte.

4.2.: Elektrischer Muffelofen mit Thermostat.

4.3.: Veraschungsschalen aus Quarzglas, Porzellan oder Platin, entweder rechteckig (ca. 60 × 40 × 25 mm) oder rund (Durchmesser: 60 bis 75 mm, Höhe: 20 bis 40 mm).

4.4.: Aschefreie Filter.

5.
Verfahren

5.1.
Verfahren A:

Die Einwaage wird unter den Bedingungen, die für die Bestimmung des Rohaschegehalts beschrieben sind, verascht. Es kann auch die bei dieser Analyse erhaltene Asche verwendet werden. Die Asche wird zusammen mit 75 ml Salzsäure (Nummer 3.1) in ein Becherglas von 250 bis 400 ml Inhalt überführt. Es wird vorsichtig zum Sieden erhitzt und 15 min lang weiter in schwachem Sieden gehalten. Die warme Lösung wird durch einen aschefreien Papierfilter filtriert und der Rückstand wird mit warmem Wasser bis zum Ausbleiben der sauren Reaktion ausgewaschen. Der Filter mit dem Rückstand wird nach dem Trocknen bei einer Temperatur von mindestens 550 °C und höchstens 700 °C in einer tarierten Veraschungsschale verascht und anschließend im Exsikkator gekühlt und gewogen.

5.2.
Verfahren B

Von der Probe werden 5 g auf 1 mg genau in ein Becherglas von 250 bis 400 ml Fassungsvermögen eingewogen. Dann werden nacheinander 25 ml Wasser und 25 ml Salzsäure (Nummer 3.1) zugegeben, gemischt, und es wird bis zum Nachlassen des Aufbrausens gewartet. Zuletzt werden weitere 50 ml Salzsäure (Nummer 3.1) zugegeben. Nach dem Nachlassen der eventuell erneut auftretenden Gasentwicklung wird das Becherglas 30 min lang oder, wenn notwendig, länger in ein siedendes Wasserbad gestellt, bis die vollständige Hydrolyse eventuell vorhandener Stärke eingetreten ist. Es wird warm durch einen aschefreien Filter filtriert. Der Filter wird mit etwa 50 ml warmem Wasser ausgewaschen (siehe Bemerkung 7). Anschließend wird der Filter mit Rückstand in eine Veraschungsschale gestellt, getrocknet und bei einer Temperatur von mindestens 550 °C und höchstens 700 °C verascht. Die Asche wird mit 75 ml Salzsäure (Nummer 3.1) in ein Becherglas von 250 bis 400 ml Fassungsvermögen überführt und anschließend, wie unter Nummer 5.1 Absatz beschrieben, weiterbehandelt.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Das Gewicht des Rückstands wird berechnet, indem das Leergewicht abgezogen wird. Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

7.
Bemerkung

Treten bei der Filtration Schwierigkeiten auf, so wird die Bestimmung wiederholt. Hierbei werden anstelle von 50 ml Salzsäure (Nummer 3.1) 50 ml Trichloressigsäure, Lösung (Massenkonzentration = 20 %) (Nummer 3.2), zugegeben; der Filter wird mit einer warmen 1%igen Trichloressigsäurelösung (Nummer 3.3) ausgewaschen.

N.
BESTIMMUNG DES GESAMTPHOSPHORGEHALTS

Der Gesamtphosphorgehalt wird anhand folgender Methode bestimmt:

—: der Analysemethode gemäß EN 15510: Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung von Calcium, Natrium, Phosphor, Magnesium, Kalium, Eisen, Zink, Kupfer, Mangan, Cobalt, Molybdän und Blei mittels ICP-AES oder
—: der Analysemethode gemäß EN 15621: Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung von Calcium, Natrium, Phosphor, Magnesium, Kalium, Schwefel, Eisen, Zink, Kupfer, Mangan und Cobalt nach Druckaufschluss mittels ICP-AES oder
—: der nachstehend beschriebenen fotometrischen Methode.

FOTOMETRISCHE METHODE

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt an Gesamtphosphor in Futtermitteln bestimmen. Sie ist besonders für die Untersuchung von Futtermitteln mit einem geringen Phosphorgehalt geeignet. In bestimmten Fällen (phosphorreiche Erzeugnisse) kann eine gravimetrische Methode angewandt werden.

2.
Prinzip

Die Probe wird entweder auf trockenem Wege (bei organischen Futtermitteln) oder auf nassem Wege (bei Mineralstoffen und flüssigen Futtermitteln) aufgeschlossen und in Säure gelöst. Die Lösung wird mit dem Vanadat-Molybdat-Reagenz behandelt. Die Extinktion der gelb gefärbten Lösung wird bei 430 nm im Spektralfotometer gemessen.

3.
Reagenzien

3.1.: Calciumcarbonat.

3.2.: Salzsäure, ρ₂₀ = 1,10 g/ml (ca. 6 mol/l).

3.3.: Salpetersäure, ρ₂₀ = 1,045 g/ml.

3.4.: Salpetersäure, ρ₂₀ = 1,38 bis 1,42 g/ml.

3.5.: Schwefelsäure, ρ₂₀ = 1,84 g/ml.

3.6.: Vanadat-Molybdat-Reagenz: 200 ml Ammoniumheptamolybdatlösung (Nummer 3.6.1) werden mit 200 ml Ammoniummonovanadatlösung (Nummer 3.6.2) und 134 ml Salpetersäure (Nummer 3.4) in einem 1-l-Messkolben gemischt und mit Wasser zur Marke aufgefüllt.

3.6.1.: Ammoniumheptamolybdatlösung: 100 g Ammoniumheptamolybdat, (NH₄) 6Mo₇O₂₄·4H₂O, werden in heißem Wasser gelöst. 10 ml Ammoniakwasser (D: 0,91 g/ml) werden hinzugefügt, und das Volumen wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.6.2.: Ammoniummonovanadatlösung: 2,35 g Ammoniummonovanadat, NH₄VO₃, werden in 400 ml heißem Wasser gelöst. 20 ml verdünnte Salpetersäure (7 ml HNO₃ (Nummer 3.4) + 13 ml H₂O) werden unter ständigem Rühren langsam hinzugefügt, und das Volumen wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.7.: Phosphor-Standardlösung 1 mg je ml: 4,387 g Kaliumdihydrogenphosphat, KH₂PO₄, werden in Wasser gelöst. Das Volumen wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt..

4.
Geräte

4.1.: Veraschungsschalen aus Quarzglas, Platin oder Porzellan.

4.2.: Elektrischer Muffelofen mit Thermostat auf 550 °C eingestellt.

4.3.: Kjeldahl-Kolben, 250 ml.

4.4.: Messkolben und Präzisions-Pipetten.

4.5.: Spektralfotometer.

4.6.: Reagenzgläser, ca. 16 mm Durchmesser, mit Stopfen graduiert bis zu 14,5 mm Durchmesser; Fassungsvermögen: 25 bis 30 ml.

5.
Verfahren

5.1.
Vorbereitung der Lösung

Je nach der Art der Probe wird die Lösung gemäß Nummer 5.1.1 oder 5.1.2 vorbereitet.

5.1.1.
Allgemeines Verfahren

Von der Probe werden 1 g oder mehr auf 1 mg genau in einen Kjeldahl-Kolben eingewogen und mit 20 ml Schwefelsäure (Nummer 3.5) versetzt; dann wird geschüttelt, um das Material vollständig mit der Säure zu benetzen und um zu verhindern, dass es an den Wandungen des Kolbens anhaftet; anschließend wird der Kolben erhitzt und 10 min lang im Sieden gehalten. Nach geringem Abkühlen werden 2 ml Salpetersäure (Nummer 3.4) hinzugefügt; es wird schwach erhitzt und wieder etwas abgekühlt. Dann wird noch ein wenig Salpetersäure (Nummer 3.4) hinzugegeben und erneut zum Sieden erhitzt. Das Verfahren wird so oft wiederholt, bis die Lösung farblos geworden ist. Hierauf wird abgekühlt, etwas Wasser zugesetzt und die Flüssigkeit in einen 500-ml-Messkolben überführt, wobei der Kjeldahl-Kolben mit heißem Wasser ausgespült wird. Nach Abkühlen wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert.

5.1.2.
Verfahren für Proben, die organische Stoffe enthalten, aber frei sind von Calcium- bzw. Magnesiumdihydrogenphosphaten

Von der Probe werden 2,5 g auf 1 mg genau in eine Veraschungsschale eingewogen und mit 1 g Calciumcarbonat (Nummer 3.1) vollständig vermischt. Im Muffelofen wird bei 550 °C verascht, bis die Asche weiß oder grau ist (kleine Mengen Kohle stören nicht). Die Asche wird in ein 250-ml-Becherglas gebracht. Es werden 20 ml Wasser und so viel Salzsäure (Nummer 3.2) zugefügt, bis das Aufbrausen ausbleibt. Zuletzt werden weitere 10 ml Salzsäure (Nummer 3.2) zugegeben. Dann wird das Becherglas auf ein Sandbad gestellt und bis zur Trockne eingedampft, um die Kieselsäure unlöslich zu machen. Der Rückstand wird in 10 ml Salpetersäure (Nummer 3.3) aufgenommen und 5 min lang auf dem Sandbad oder der Heizplatte zum Sieden erhitzt, wobei der Rückstand nicht ganz trocken werden darf. Die Flüssigkeit wird in einen 500-ml-Messkolben übergespült, wobei das Becherglas mehrmals mit heißem Wasser ausgewaschen wird. Nach Abkühlen wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert.

5.2.
Entwicklung der Färbung und Messung der Extinktion

Ein aliquoter Teil des nach Nummer 5.1.1 oder 5.1.2 erhaltenen Filtrats wird verdünnt, um eine Konzentration an Phosphor von höchstens 40 μg/ml zu erhalten. Von dieser Lösung werden 10 ml in ein Reagenzglas (Nummer 4.6) pipettiert und es werden 10 ml Vanadat-Molybdat-Reagenz (Nummer 3.6) hinzugefügt. Das Reagenzglas wird geschüttelt und dann mindestens 10 min lang bei einer Temperatur von 20 °C stehen gelassen. Anschließend wird die Extinktion im Spektralfotometer bei 430 nm gegen eine Lösung von 10 ml Wasser und 10 ml Vanadat-Molybdat-Reagenz (Nummer 3.6) gemessen.

5.3.
Kalibrationskurve

Aus der Standardlösung (Nummer 3.7) werden Lösungen hergestellt, die 5, 10, 20, 30 bzw. 40 μg Phosphor je ml enthalten. Zu jeweils 10 ml dieser Lösungen werden 10 ml Vanadat-Molybdat-Reagenz (Nummer 3.6) hinzugefügt. Das Reagenzglas wird geschüttelt und dann mindestens 10 min lang bei einer Temperatur von 20 °C stehen gelassen. Dann wird die Extinktion entsprechend den unter Nummer 5.2 genannten Bedingungen gemessen. Die Kalibrationskurve wird aufgestellt, indem die Extinktionswerte auf der Ordinate und die entsprechende Phosphormenge auf der Abszisse aufgetragen werden. Bei Phosphorkonzentrationen von 0 bis 40 μg/ml ist die Kurve linear.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Der Phosphorgehalt der Analysenprobe wird mithilfe der Kalibrationskurve bestimmt. Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—: 3 % relativ zum höheren Wert bei einem Phosphorgehalt von unter 5 %,
—: 0,15 % absolut bei einem Phosphorgehalt von 5 % oder mehr.

O.
BESTIMMUNG DES CHLORGEHALTS AUS CHLORIDEN

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Chlorgehalt aus wasserlöslichen Chloriden, herkömmlicherweise als Natriumchlorid bezeichnet, bestimmen. Sie ist bei allen Futtermitteln anwendbar.

2.
Prinzip

Die Chloride werden in Wasser gelöst. Handelt es sich um Erzeugnisse, die organische Stoffe enthalten, wird eine Klärung vorgenommen. Die Lösung wird mittels Salpetersäure schwach angesäuert, und die Chloride werden mit einer Silbernitratlösung als Silberchlorid gefällt. Der Silbernitratüberschuss wird mit einer Ammoniumthiocyanatlösung nach der Volhard-Methode zurücktitriert.

3.
Reagenzien

3.1.: Ammoniumthiocyanatlösung 0,1 mol/l.

3.2.: Silbernitratlösung 0,1 mol/l.

3.3.: Gesättigte Ammonium-Eisen(III)-Sulfatlösung (NH₄)Fe(SO₄)₂.

3.4.: Salpetersäure, Dichte: 1,38 g/ml.

3.5.: Diethylether.

3.6.: Aceton.

3.7.: Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkacetat, Zn (CH₃COO)₂·2H₂O, und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.8.: Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat(II), K₄Fe(CN)₆·3H₂O, werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.9.: Aktivkohle, chloridfrei und keine Chloride adsorbierend.

4.
Geräte

Mechanisches Schüttelgerät: ca. 35 bis 40 min^-1.

5.
Verfahren

5.1.
Vorbereitung der Lösung

Je nach der Art der Probe wird die Lösung gemäß Nummer 5.1.1, 5.1.2 oder 5.1.3 hergestellt. Gleichzeitig ist ein Blindversuch ohne die zu analysierende Probe durchzuführen.

5.1.1.
Proben, die frei von organischen Stoffen sind

Eine Menge von höchstens 10 g der Probe mit einem Gehalt von höchstens 3 g Chlor in Form von Chloriden wird auf 1 mg genau abgewogen und in einen 500-ml-Messkolben mit 400 ml Wasser von etwa 20 °C gebracht. Dann wird 30 min lang in dem Schüttelgerät rotiert, zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert.

5.1.2.
Proben, die organische Stoffe enthalten (mit Ausnahme der unter 5.1.3 angeführten Erzeugnisse)

Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau eingewogen und mit 1 g Aktivkohle in einen 500-ml-Messkolben gebracht. Hierzu werden 400 ml Wasser von etwa 20 °C und 5 ml Carrez-Lösung I (Nummer 3.7) gegeben, es wird 30 s lang gerührt und anschließend werden 5 ml Carrez-Lösung II (Nummer 3.8) zugesetzt. Dann wird 30 min lang in dem Schüttelgerät rotiert, zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert.

5.1.3.
Backfutter, Leinkuchen und Leinmehl, Erzeugnisse mit einem hohen Leinmehlgehalt oder sonstige Erzeugnisse mit einem hohen Gehalt an Pflanzenschleim oder kolloidalen Stoffen (z. B. verkleisterte Stärke)

Die Lösung wird, wie unter 5.1.2 beschrieben, zubereitet, jedoch nicht filtriert. Es wird dekantiert (falls erforderlich, zentrifugiert); dann werden 100 ml der überstehenden Lösung in einen 200-ml-Messkolben pipettiert. Es wird mit Aceton (Nummer 3.6) gemischt und mit demselben Lösungsmittel zur Marke aufgefüllt, homogenisiert und filtriert.

5.2.
Titration

Von dem Filtrat, das nach Nummer 5.1.1, 5.1.2 oder 5.1.3 erhalten wurde, werden (je nach dem zu erwartenden Chlorgehalt) 25 bis 100 ml in einen Erlenmeyerkolben pipettiert. Die aliquote Menge darf höchstens 150 mg Chlor (Cl) enthalten. Falls erforderlich, wird mit Wasser auf mindestens 50 ml verdünnt. Dann werden 5 ml Salpetersäure (Nummer 3.4), 2 ml der gesättigten Ammonium-Eisen(III)-Sulfatlösung (Nummer 3.3) und 2 Tropfen Ammoniumthiocyanatlösung (Nummer 3.1) aus einer bis zum Nullpunkt gefüllten Bürette hinzugesetzt. Anschließend wird aus einer Bürette Silbernitratlösung (Nummer 3.2) zugegeben, bis ein Überschuss von 5 ml vorhanden ist. Dann werden 5 ml Diethylether (Nummer 3.5) zugegeben, und es wird kräftig geschüttelt, um den Niederschlag zum Ausflocken zu bringen. Der Überschuss an Silbernitrat wird mit Ammoniumthiocyanatlösung (Nummer 3.1) titriert, bis eine rotbraune Farbe auftritt, die 1 min lang beständig ist.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Die Menge Chlor (X), ausgedrückt als % Natriumchlorid, wird nach folgender Formel berechnet: X5,845× V1 – V2m wobei:

V₁=: zugegebene Silbernitratlösung 0,1 mol/l, in ml,
V₂=: Ammoniumthiocyanatlösung 0,1 mol/l, die für die Titration verbraucht werden, in ml,
m=: Probeneinwaage (aliquoter Teil) in g.

Falls der Blindversuch einen Verbrauch an Silbernitratlösung 0,1 mol/l anzeigt, wird dieser Wert von dem Volumen (V₁ – V₂) abgezogen.

7.
Bemerkungen

7.1.: Die Titration kann auch potenziometrisch oder amperometrisch erfolgen.

7.2.: Bei sehr öl- und fettreichen Erzeugnissen ist eine vorherige Entfettung mit Diethylether oder Petrolether durchzuführen.

7.3.: Bei Fischmehl kann die Titration nach der Mohr-Methode durchgeführt werden.

Fußnote(n):

(1): Für die Trocknung von Getreide, Mehl, Grütze und Grieß muss der Trockenschrank eine Wärmekapazität haben, mit der er nach Beladung mit der Höchstzahl gleichzeitig zu trocknender Analysenproben die voreingestellte Temperatur von 131 °C in weniger als 45 min wieder erreicht. Die Lüftung muss so beschaffen sein, dass die Ergebnisse nach 2-stündiger Trocknung einer sein gesamtes Fassungsvermögen auslastenden Anzahl an Weichweizenproben von den Ergebnissen nach 4-stündiger Trocknung um weniger als 0,15 % abweichen.
(2): Zur Berechnung im Einzelnen wird verwiesen auf EN ISO 6498 — Futtermittel — Leitfaden für die Probenvorbereitung.
(3): Der Gehalt an N lässt sich in allen Futtermitteln bestimmen, nur lässt sich der Umrechnungsfaktor 6,25 zur Berechnung des Rohproteingehalts möglicherweise nicht auf Futtermittel-Ausgangserzeugnisse aus Insekten (niedrigerer Umrechnungsfaktor) und bestimmtes Heimtierfutter und bestimmte Blutplasmaproteine (höherer Umrechnungsfaktor) anwenden.
(4): Die Analysemethode gemäß EN 17180 ist als alternative Methode für die Zwecke amtlicher Kontrollen zur Bestimmung des Gehalts an Aminosäuren in Futtermitteln mit mehr als 10 % Aminosäuren genannt.
(5): Diese Methode wurde nicht durch einen Ringversuch für Vormischungen validiert, die mehr als 10 % Futtermittelzusatzstoffe enthalten. Sie kann jedoch mit entsprechenden leichten Änderungen auch auf diese Matrizen angewendet werden, sofern sie anschließend intern validiert wird. Nähere Informationen unter https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/feed-additives/authorisation.
(6): Soll das Öl oder Fett später einer Qualitätsprüfung unterzogen werden, sind die Bimssteinkörner durch Glasperlen zu ersetzen.
(7): Verordnung (EG) Nr. 121/2008 der Kommission vom 11. Februar 2008 zur Festlegung der Analysemethode zur Bestimmung des Stärkegehalts in Zubereitungen von der zur Fütterung verwendeten Art (KN-Code 2309) (ABl. L 37 vom 12.2.2008, S. 3).

ANHANG II ANHANG IV

Tipp: Verwenden Sie die Pfeiltasten der Tastatur zur Navigation zwischen Normen.

ANHANG III VO (EG) 2009/152

ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER ZUSAMMENSETZUNG VON FUTTERMITTEL-AUSGANGSERZEUGNISSEN UND MISCHFUTTERMITTELN

A. BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS

1. Zweck und Anwendungsbereich

2.Prinzip

3.Geräte

4.Verfahren

4.1.Vorbereitung

4.1.1.Futtermittel, außer den unter Nummer 4.1.2 und 4.1.3 genannten

4.1.2.Getreide und Grütze

4.1.3.Flüssige oder breiige Futtermittel; Futtermittel, die überwiegend aus Ölen und Fetten bestehen

4.2.Trocknung

4.2.1.Futtermittel, außer den unter Nummer 4.2.2 und 4.2.3 genannten

4.2.2.Getreide, Mehl, Grütze und Grieß

4.2.3.Mischfuttermittel mit einem Saccharose- oder Lactosegehalt von mehr als 4 %: Futtermittel-Ausgangserzeugnisse wie z. B. Johannisbrotschrot, hydrolysierte Getreideerzeugnisse, Malzkeime, Zuckerrübenschnitzel, Fisch- und Zuckerpresssäfte

4.3.Vortrocknung (Teiltrocknung)

5.Berechnung der Ergebnisse

5.1.Trocknung ohne Vortrocknung

5.2.Trocknung mit Vortrocknung(2)

5.3.Wiederholbarkeit

6.Bemerkung

B.BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS IN TIERISCHEN UND PFLANZLICHEN FETTEN UND ÖLEN

1.Zweck und Anwendungsbereich

2.Prinzip

3.Geräte

4.Verfahren

5.Berechnung der Ergebnisse

Wiederholbarkeit

C.BESTIMMUNG DES STICKSTOFFGEHALTS UND BERECHNUNG DES ROHPROTEINGEHALTS

1.Zweck und Anwendungsbereich

2.Prinzip

3.Reagenzien

4.Geräte

5.Verfahren

5.1.Aufschluss

5.2.Destillation

5.2.1.Destillation von Schwefelsäure

5.2.2.Destillation von Borsäure

5.3.Titration

5.3.1.Schwefelsäure

5.3.2.Borsäure

5.4.Blindversuch

6.Berechnung der Ergebnisse

6.1.Berechnung für die Titration nach Nummer 5.3.1

6.2.Berechnung für die Titration nach Nummer 5.3.2

6.2.1.Titration mit Salzsäure

6.2.2.Titration mit Schwefelsäure

7.Beurteilung des Verfahrens

7.1.Wiederholbarkeit

7.2.Vergleichbarkeit

7.3.Genauigkeit

8.Bemerkungen

D.BESTIMMUNG DES HARNSTOFFGEHALTS

1.Zweck und Anwendungsbereich

2.Prinzip

3.Reagenzien

4.Geräte

5.Verfahren

5.1.Analysengang der Probe

5.2.Kalibrationskurve

6.Berechnung der Ergebnisse

7.Beurteilung des Verfahrens

7.1.Wiederholbarkeit

7.2.Vergleichbarkeit

8.Ergebnisse eines Ringversuchs

9.Bemerkungen

E.BESTIMMUNG DES GEHALTS AN AMINOSÄUREN (AUẞER TRYPTOPHAN)

1.Zweck und Anwendungsbereich

2.Prinzip

2.1.Freie Aminosäuren

2.2.Gesamtaminosäuren

3.Reagenzien

4.Geräte

5.Verfahren

5.1.Vorbereitung der Probe

5.2.Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren

5.3.Bestimmung des Gehalts an Gesamtaminosäuren

5.3.1.Oxidation

5.3.2.Hydrolyse

5.3.3.pH-Wert-Einstellung

A.

BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS

1.

Zweck und Anwendungsbereich

2.
Prinzip

3.
Geräte

4.
Verfahren

4.1.
Vorbereitung

4.1.1.
Futtermittel, außer den unter Nummer 4.1.2 und 4.1.3 genannten

4.1.2.
Getreide und Grütze

4.1.3.
Flüssige oder breiige Futtermittel; Futtermittel, die überwiegend aus Ölen und Fetten bestehen

4.2.
Trocknung

4.2.1.
Futtermittel, außer den unter Nummer 4.2.2 und 4.2.3 genannten

4.2.2.
Getreide, Mehl, Grütze und Grieß

4.2.3.
Mischfuttermittel mit einem Saccharose- oder Lactosegehalt von mehr als 4 %: Futtermittel-Ausgangserzeugnisse wie z. B. Johannisbrotschrot, hydrolysierte Getreideerzeugnisse, Malzkeime, Zuckerrübenschnitzel, Fisch- und Zuckerpresssäfte

4.3.
Vortrocknung (Teiltrocknung)

5.
Berechnung der Ergebnisse

5.1.
Trocknung ohne Vortrocknung

5.2.
Trocknung mit Vortrocknung⁽²⁾

5.3.
Wiederholbarkeit

6.
Bemerkung

B.
BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS IN TIERISCHEN UND PFLANZLICHEN FETTEN UND ÖLEN

1.
Zweck und Anwendungsbereich

2.
Prinzip

3.
Geräte

4.
Verfahren

5.
Berechnung der Ergebnisse

C.
BESTIMMUNG DES STICKSTOFFGEHALTS UND BERECHNUNG DES ROHPROTEINGEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

2.
Prinzip

3.
Reagenzien

4.
Geräte

5.
Verfahren

5.1.
Aufschluss

5.2.
Destillation

5.2.1.
Destillation von Schwefelsäure

5.2.2.
Destillation von Borsäure

5.3.
Titration

5.3.1.
Schwefelsäure

5.3.2.
Borsäure

5.4.
Blindversuch

6.
Berechnung der Ergebnisse

6.1.
Berechnung für die Titration nach Nummer 5.3.1

6.2.
Berechnung für die Titration nach Nummer 5.3.2

6.2.1.
Titration mit Salzsäure

6.2.2.
Titration mit Schwefelsäure

7.
Beurteilung des Verfahrens

7.1.
Wiederholbarkeit

7.2.
Vergleichbarkeit

7.3.
Genauigkeit

8.
Bemerkungen

D.
BESTIMMUNG DES HARNSTOFFGEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

2.
Prinzip

3.
Reagenzien

4.
Geräte

5.
Verfahren

5.1.
Analysengang der Probe

5.2.
Kalibrationskurve

6.
Berechnung der Ergebnisse

7.
Beurteilung des Verfahrens

7.1.
Wiederholbarkeit

7.2.
Vergleichbarkeit

8.
Ergebnisse eines Ringversuchs

9.
Bemerkungen

E.
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN AMINOSÄUREN (AUẞER TRYPTOPHAN)

1.
Zweck und Anwendungsbereich

2.
Prinzip

2.1.
Freie Aminosäuren

2.2.
Gesamtaminosäuren

3.
Reagenzien

4.
Geräte

5.
Verfahren

5.1.
Vorbereitung der Probe

5.2.
Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren

5.3.
Bestimmung des Gehalts an Gesamtaminosäuren

5.3.1.
Oxidation

5.3.2.
Hydrolyse

5.3.3.
pH-Wert-Einstellung

5.3.4.
Probenlösung für die Chromatografie

5.4.
Chromatografie

6.
Berechnung der Ergebnisse