ANHANG IV VO (EG) 2009/152

ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG VON FUTTERMITTELN AUF IHREN GEHALT AN ZUGELASSENEN ZUSATZSTOFFEN

A.

BESTIMMUNG DES VITAMIN-A-GEHALTS

Der Vitamin-A-Gehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: der Analysemethode gemäß EN 17547 Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung des Gehalts an Vitamin A, E und D⁽¹⁾ — Verfahren mittels Reinigung durch Festphasenextraktion und Hochleistungs-Flüssigchromatographie oder
—: durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) unter Verwendung eines UV- oder Fluoreszenzdetektors, wie im Folgenden unter den Nummern 1 bis 9 beschrieben.

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Vitamin-A-(Retinol-)Gehalts in Futtermitteln. Unter Vitamin A wird der nach dieser Methode ermittelte Gehalt an all-trans-Vitamin-A-Alkohol und seinen cis-Isomeren verstanden. Der Vitamin-A-Gehalt wird in Internationalen Einheiten (IE) je kg angegeben. Eine IE entspricht der Aktivität von 0,300 μg all-trans-Vitamin-A-Alkohol oder 0,344 μg all-trans-Vitamin-A-Acetat oder 0,550 μg all-trans-Vitamin-A-Palmitat. Die Bestimmungsgrenze beträgt 2000 IE Vitamin A/kg.

2.
Prinzip

Die Probe wird mit ethanolischer Kaliumhydroxidlösung hydrolysiert, und das Vitamin A wird mit Petrolether extrahiert. Das Lösungsmittel wird eingedampft; der Rückstand wird in Methanol gelöst und, falls notwendig, auf die erforderliche Konzentration verdünnt. Der Vitamin-A-Gehalt wird mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (RP-HPLC) unter Verwendung eines UV- oder Fluoreszenzdetektors bestimmt. Die chromatografischen Bedingungen werden so gewählt, dass keine Ruftrennung zwischen all-trans-Vitamin-A-Alkohol und seinen cis-Isomeren erfolgt.

3.
Reagenzien

3.1.: Ethanol, σ = 96 %.

3.2.: Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 °C.

3.3.: Methanol

3.4.: Kaliumhydroxid-Lösung, c = 50 g/100 ml.

3.5.: Natriumascorbat-Lösung, c = 10 g/100 ml (siehe Bemerkung 7.7).

3.6.: Natriumsulfid, Na₂S · x H₂O (x = 7 bis 9).

3.6.1.: Natriumsulfid-Lösung, c = 0,5 mol/l in Glycerin, β = 120 g/l (für x = 9) (siehe Bemerkung 7.8).

3.7.: Phenolphthalein-Lösung, c = 2 g/100 ml in Ethanol (Nummer 3.1).

3.8.: 2-Propanol.

3.9.: Mobile Phase für die HPLC: Mischung von Methanol (Nummer 3.3) und Wasser z. B. 980 + 20 (V+V) Das Mischungsverhältnis ist der jeweils verwendeten Säule anzupassen.

3.10.: Stickstoff, sauerstofffrei.

3.11.: All-trans-Vitamin-A-Acetat, reinst, mit zertifizierter Aktivität, z. B. 2,80 × 106 IE/g

3.11.1.: Stammlösung von all-trans-Vitamin-A-Acetat: 50 mg Vitamin-A-Acetat (Nummer 3.11) auf 0,1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben einwiegen. In 2-Propanol (Nummer 3.8) lösen und mit demselben Lösungsmittel zur Marke auffüllen. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 1400 IE Vitamin A je ml. Der genaue Gehalt ist gemäß Nummer 5.6.3.1 zu bestimmen.

3.12.: All-trans-Vitamin-A-Palmitat, reinst, mit zertifizierter Aktivität, z. B. 1,80 × 106 IE/g

3.12.1.: Stammlösung von all-trans-Vitamin-A-Palmitat: 80 mg Vitamin-A-Palmitat (Nummer 3.12) auf 0,1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben einwiegen. In 2-Propanol (Nummer 3.8) lösen und mit demselben Lösungsmittel zur Marke auffüllen. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 1400 IE Vitamin A je ml. Der genaue Gehalt ist gemäß Nummer 5.6.3.2 zu bestimmen.

3.13.: 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (siehe Bemerkung 7.5).

4.
Geräte

4.1.: Vakuum-Rotationsverdampfer.

4.2.: Braunglasgeräte

4.2.1.: Stehkolben oder Erlenmeyerkolben, 500 ml, mit Schliffhülse.

4.2.2.: Messkolben mit Schliffstopfen, enghalsig, 10, 25, 100 und 500 ml.

4.2.3.: Scheidetrichter, konische Form, 1000 ml, mit Schliffstopfen.

4.2.4.: Spitzkolben, 250 ml, mit Schliffhülsen.

4.3.: Allihn-Rückflusskühler, Mantellänge 300 mm, Kernschliff mit Adapter für Gaseinleitung.

4.4.: Phasentrennungsfaltenfilter, Durchmesser 185 mm (z. B. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).

4.5.: HPLC-Einrichtung mit Injektionssystem

4.5.1.: HPLC-Trennsäule, 250 mm × 4 mm, C₁₈, 5 oder 10 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule (Leistungskriterium: nur ein Peak für alle Retinol-Isomeren unter diesen HPLC-Bedingungen).

4.5.2.: UV- oder Fluoreszenzdetektor mit variabler Wellenlängeneinstellung.

4.6.: Spektralfotometer mit Quarz-Küvetten von 10 mm Schichtdicke.

4.7.: Wasserbad mit Magnetrührer.

4.8.: Extraktionsapparat (Abbildung 1) bestehend aus:

4.8.1.: 1-l-Standzylinder mit Schliff und Schliffstopfen,

4.8.2.: Schliffeinsatz mit Seitenarm und einem in der Höhe verschiebbaren Rohr in der Mitte. Das verschiebbare Rohr muss ein U-förmiges unteres Ende und eine Düse am entgegengesetzten Ende haben, sodass die obere Flüssigkeitsphase aus dem Zylinder in den Scheidetrichter überführt werden kann.

5.
Verfahren

Anmerkung:: Vitamin A ist empfindlich gegenüber Licht (UV-Strahlung) und Oxidation. Daher muss unter Ausschluss von Licht (Verwendung von Braunglasgeräten oder von mit Aluminiumfolie umhüllten Glasgeräten) und Sauerstoff (Stickstoffspülung) gearbeitet werden. Während der Extraktion muss das Luftpolster über der Flüssigkeit durch Stickstoff ersetzt werden (zur Vermeidung von Überdruck Stopfen immer wieder lüften).

5.1.
Vorbereitung der Probe

Die Probe wird unter Vermeidung von Erwärmung so fein vermahlen, dass sie ein Sieb mit 1 mm Maschenweite passieren kann. Das Mahlen darf erst unmittelbar vor dem Einwiegen und Verseifen erfolgen, da sonst Vitamin-A-Verluste auftreten können. Wenn die Größenverteilung der Partikel geeignet ist, darf die Probe (dürfen die Proben) nicht gemahlen werden (z. B. bei Vormischungen und Futtermittelzusatzstoffen).

5.2.
Verseifung

Je nach Vitamin-A-Gehalt 2 bis 25 g der Probe auf 1 mg genau in einen 500-ml-Steh- oder Erlenmeyerkolben (Nummer 4.2.1) einwiegen. Bei niedrigen Konzentrationen kann das Probengewicht erhöht werden, um genügend Partikel in der Testmenge zu erhalten. Nacheinander unter Schwenken 130 ml Ethanol (Nummer 3.1), etwa 100 mg BHT (Nummer 3.13), 2 ml Natriumascorbat-Lösung (Nummer 3.5) und 2 ml Natriumsulfid-Lösung (Nummer 3.6) zusetzen. Den Kolben mit einem Rückflusskühler (Nummer 4.3) verbinden und in ein Wasserbad mit Magnetrührer (Nummer 4.7) geben. Bis zum Sieden erhitzen und 5 min am Rückflusskühler kochen. Anschließend 25 ml Kaliumhydroxidlösung (Nummer 3.4) durch den Rückflusskühler (Nummer 4.3) zugeben, und unter ständigem Rühren und schwachem Stickstoffstrom 25 min weiterkochen. Den Kühler mit etwa 20 ml Wasser ausspülen und den Kolbeninhalt auf Zimmertemperatur abkühlen.

5.3.
Extraktion

Die Verseifungslösung wird mit insgesamt 250 ml Wasser quantitativ in einen 1000-ml-Scheidetrichter (Nummer 4.2.3) oder in den Extraktionsapparat (Nummer 4.8) überspült. Der Verseifungskolben wird mit 25 ml Ethanol (Nummer 3.1) und anschließend mit 100 ml Petrolether (Nummer 3.2) nachgewaschen, und die Spülflüssigkeiten werden ebenfalls in den Scheidetrichter oder den Extraktionsapparat überführt. Das Wasser/Ethanol-Verhältnis in den vereinigten Lösungen muss etwa 2:1 betragen. 2 min kräftig schütteln und dann 2 min absetzen lassen.

5.3.1.
Extraktion mithilfe eines Scheidetrichters (Nummer 4.2.3)

Nach Phasentrennung (siehe Bemerkung 7.3) wird die Petroletherphase in einen anderen Scheidetrichter (Nummer 4.2.3) überführt. Diese Extraktion 2-mal mit je 100 ml Petrolether (Nummer 3.2) und 2-mal mit je 50 ml Petrolether (Nummer 3.2) wiederholen. Die vereinigten Extrakte werden im Scheidetrichter unter leichtem Schwenken (Vermeidung von Emulsionsbildung) 2-mal mit jeweils 100 ml Wasser gespült und dann durch mehrmaliges Schütteln mit weiteren Portionen von 100 ml Wasser so oft gewaschen, bis das Waschwasser bei Zugabe von Phenolphthalein-Lösung (Nummer 3.7) farblos bleibt (4-maliges Waschen ist normalerweise ausreichend). Zur Entfernung eventuell suspendierten Wassers wird der gewaschene Extrakt durch einen trockenen Phasentrennungsfaltenfilter (Nummer 4.4) in einen 500-ml-Messkolben (Nummer 4.2.2) filtriert. Scheidetrichter und Filter mit 50 ml Petrolether (Nummer 3.2) nachwaschen, mit Petrolether (Nummer 3.2) zur Marke auffüllen und gut schütteln.

5.3.2.
Extraktion mithilfe eines Extraktionsapparats (Nummer 4.8)

Nach Phasentrennung (siehe Bemerkung 7.3) wird der Stopfen des Standzylinders (Nummer 4.8.1) durch den Schliffeinsatz (Nummer 4.8.2) ersetzt und das verschiebbare Rohr so eingestellt, dass sich das U-förmige untere Ende gerade über dem Niveau der Grenzfläche befindet. Durch Druckausübung von einer am Seitenarm angebrachten Stickstoffleitung wird die obere Petroletherphase in einen 1000-ml-Scheidetrichter (Nummer 4.2.3) überführt. 100 ml Petrolether (Nummer 3.2) werden in den Standzylinder gegeben, der mit einem Stopfen verschlossen und gründlich geschüttelt wird. Nach der Phasentrennung wird die obere Phase wie zuvor in den Scheidetrichter überführt. Diese Extraktion wird noch 1-mal mit 100 ml Petrolether (Nummer 3.2) und 2-mal mit je 50 ml Petrolether (Nummer 3.2) wiederholt, und die Petroletherphasen werden in den Scheidetrichter überführt. Die vereinigten Petroletherextrakte, wie unter 5.3.1 erläutert, waschen und wie dort beschrieben weiterverfahren.

5.4.
Vorbereitung der Probenlösung für die HPLC

Ein aliquoter Teil der Petrolether-Lösung (gemäß Nummer 5.3.1 oder 5.3.2) wird in einen 250-ml-Spitzkolben (Nummer 4.2.4) pipettiert. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck und bei einer Badtemperatur von höchstens 40 °C am Rotationsverdampfer (Nummer 4.1) fast bis zur Trockne eingedampft. Danach wird unter Stickstoff (Nummer 3.10) Druckausgleich geschaffen und der Kolben vom Rotationsverdampfer abgenommen. Das restliche Lösungsmittel wird im Stickstoffstrom (Nummer 3.10) abgeblasen, und der Rückstand wird sofort in einer definierten Menge (10 bis 100 ml) Methanol (Nummer 3.3) aufgenommen (die Konzentration von Vitamin A muss etwa 5 bis 30 IE/ml betragen).

5.5.
Bestimmung durch HPLC

Die Abtrennung von Vitamin A erfolgt mithilfe einer Umkehrphasen-C₁₈-Säule (Nummer 4.5.1), und die Konzentration wird mithilfe eines UV-Detektors (325 nm) oder eines Fluoreszenzdetektors (Anregung: 325 nm, Emission: 475 nm) (Nummer 4.5.2) gemessen. Hierzu wird ein aliquoter Teil (z. B. 20 μl) der nach Nummer 5.4 erhaltenen methanolischen Lösung auf die Trennsäule gegeben und mit der mobilen Phase (Nummer 3.9) eluiert. Die mittlere Peakhöhe (-fläche) von mehreren Einspritzungen derselben Probenlösung wird ermittelt. In gleicher Weise werden auch die mittleren Peakhöhen (-flächen) von mehreren Einspritzungen der Kalibrierlösungen (Nummer 5.6.2) bestimmt. HPLC-Parameter Die folgenden Angaben sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen:

HPLC-Trennsäule (Nummer 4.5.1):	250 × 4 mm, C18, 5 oder 10 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule
Mobile Phase (Nummer 3.9):	Mischung von Methanol (Nummer 3.3) und Wasser z. B. 980 + 20 (V+V)
Durchflussrate:	1 bis 2 ml/min
Detektor (Nummer 4.5.2):	UV-Detektor (325 nm) oder Fluoreszenzdetektor (Anregung: 325 nm, Emission: 475 nm

5.6.
Kalibrierung

5.6.1.
Herstellen der Gebrauchsstandardlösungen

20 ml der Vitamin-A-Acetat-Stammlösung (Nummer 3.11.1) oder 20 ml der Vitamin-A-Palmitat-Stammlösung (Nummer 3.12.1) in einen 500-ml-Steh- oder Erlenmeyerkolben (Nummer 4.2.1) pipettieren und, wie unter 5.2 beschrieben, aber ohne Zugabe von BHT, hydrolysieren. Anschließend mit Petrolether (Nummer 3.2) gemäß Nummer 5.3 extrahieren und mit Petrolether (Nummer 3.2) auf 500 ml auffüllen. 100 ml dieses Extrakts werden am Rotationsverdampfer (siehe 5.4) fast bis zur Trockne eingedampft. Das verbleibende Lösungsmittel wird im Stickstoffstrom (Nummer 3.10) abgeblasen, und der Rückstand wird in 10,0 ml Methanol (Nummer 3.3) aufgenommen. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 560 IE Vitamin A je ml. Der genaue Gehalt ist nach Nummer 5.6.3.3 zu bestimmen. Die Gebrauchsstandardlösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden. Von dieser Gebrauchsstandardlösung werden 2,0 ml in einen 20-ml-Messkolben pipettiert. Es wird mit Methanol (Nummer 3.3) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Der Sollgehalt dieser verdünnten Gebrauchsstandardlösung beträgt 56 IE Vitamin A je ml.

5.6.2.
Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrationskurve

Von der verdünnten Gebrauchsstandardlösung werden 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml bzw. 10,0 ml in jeweils einen 20-ml-Messkolben pipettiert. Es wird mit Methanol (Nummer 3.3) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Der Sollgehalt dieser Lösungen beträgt 2,8 IE, 5,6 IE, 14,0 IE bzw. 28,0 IE Vitamin A je ml. Von jeder Kalibrierlösung werden mehrmals 20 μl eingespritzt, und die mittleren Peakhöhen (-flächen) werden gemessen. Anhand der so ermittelten mittleren Peakhöhen (-flächen) und unter Berücksichtigung der Ergebnisse der UV-Kontrolle (Nummer 5.6.3.3) wird eine Kalibrationskurve erstellt.

5.6.3.
UV-Kontrolle der Standardlösungen

5.6.3.1.
Vitamin-A-Acetat-Stammlösung

Von der Vitamin-A-Acetat-Stammlösung (Nummer 3.11.1) werden 2,0 ml in einen 50-ml-Messkolben (Nummer 4.2.2) pipettiert, und es wird mit 2-Propanol (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 56 IE Vitamin A je ml. Von dieser verdünnten Vitamin-A-Acetat-Lösung werden 3,0 ml in einen 25-ml-Messkolben pipettiert; es wird mit 2-Propanol (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 6,72 IE Vitamin A je ml. Das UV-Spektrum dieser Lösung wird gegen 2-Propanol (Nummer 3.8) im Spektralfotometer (Nummer 4.6) zwischen 300 und 400 nm gemessen. Das Extinktionsmaximum muss zwischen 325 und 327 nm liegen. Berechnung des Vitamin-A-Gehalts: IE Vitamin AmlE326 ×19,0 E1 cm1 %für Vitamin – A – Acetat1 530 bei 326 nm in 2–Propanol

5.6.3.2.
Vitamin-A-Palmitat-Stammlösung

Von der Vitamin-A-Palmitat-Stammlösung (Nummer 3.12.1) werden 2,0 ml in einen 50-ml-Messkolben (Nummer 4.2.2) pipettiert, und es wird mit 2-Propanol (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 56 IE Vitamin A je ml. Von dieser verdünnten Vitamin-A-Palmitat-Lösung werden 3,0 ml in einen 25-ml-Messkolben pipettiert; es wird zur Marke mit 2-Propanol (Nummer 3.8) aufgefüllt. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 6,72 IE Vitamin A je ml. Das UV-Spektrum dieser Lösung wird gegen 2-Propanol (Nummer 3.8) im Spektralfotometer (Nummer 4.6) zwischen 300 und 400 nm gemessen. Das Extinktionsmaximum muss zwischen 325 und 327 nm liegen. Berechnung des Vitamin-A-Gehalts: IE Vitamin AmlE326 ×19,0 E1 cm1 %für Vitamin – A – Palmitat957 bei 326 nm in 2 – Propanol

5.6.3.3.
Vitamin-A-Gebrauchsstandardlösung

Von der gemäß Nummer 5.6.1 hergestellten, unverdünnten Vitamin-A-Gebrauchsstandardlösung werden 3,0 ml in einen 50-ml-Messkolben (Nummer 4.2.2) pipettiert, und es wird mit 2-Propanol (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt. 5,0 ml dieser Lösung werden in einen 25-ml-Messkolben pipettiert; es wird mit 2-Propanol (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 6,72 IE Vitamin A je ml. Das UV-Spektrum dieser Lösung wird gegen 2-Propanol (Nummer 3.8) im Spektralfotometer (Nummer 4.6) zwischen 300 und 400 nm gemessen. Das Extinktionsmaximum muss zwischen 325 und 327 nm liegen. Berechnung des Vitamin-A-Gehalts: IE Vitamin AmlE325 ×18,30 E1 cm1 %für Vitamin – A – Alkohol1 821 bei 325 nm in 2–Propanol

6.
Berechnung der Ergebnisse

Aus der mittleren Höhe (Fläche) der Vitamin-A-Peaks der Probenlösung wird anhand der Kalibrationskurve (Nummer 5.6.2) die Konzentration der Probenlösung in IE/ml bestimmt. Der Vitamin-A-Gehalt w (in IE/kg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet: w500 × c × V2 × 1 000V1 × mIEkg wobei:

c=: Vitamin-A-Konzentration der Probenlösung (Nummer 5.4) in IE/ml,
V₁=: Volumen der Probenlösung (Nummer 5.4) in ml,
V₂=: Volumen des unter 5.4 entnommenen aliquoten Teils in ml,
m=: Probeneinwaage in g.

7.
Bemerkungen

7.1.: Bei Proben mit niedriger Vitamin-A-Konzentration kann es zweckmäßig sein, die Petroletherextrakte von zwei Verseifungsansätzen (Einwaage 25 g) zu einer Probenlösung für die HPLC-Bestimmung zu vereinigen.

7.2.: Die Einwaage für die Analyse darf höchstens 2 g Fett enthalten.

7.3.: Bei schlechter Phasentrennung können etwa 10 ml Ethanol (Nummer 3.1) zur Zerstörung der Emulsion zugegeben werden.

7.4.: Bei Lebertran oder anderen reinen Fetten ist die Verseifungsdauer auf 45 bis 60 min zu erhöhen.

7.5.: Statt BHT kann Hydrochinon verwendet werden.

7.6.: Bei Verwendung einer Normalphasensäule ist die Trennung der Retinolisomeren möglich. Allerdings müssen in diesem Fall für die Berechnungen die Peakhöhen (-flächen) aller cis- und trans-Isomeren addiert werden.

7.7.: Statt Natriumascorbat-Lösung können etwa 150 mg Ascorbinsäure verwendet werden.

7.8.: Statt Natriumsulfid-Lösung können etwa 50 mg EDTA verwendet werden.

7.9.

Bei der Bestimmung des Gehalts an Vitamin A in Milchaustausch-Futtermitteln sind folgende Aspekte zu berücksichtigen:

—: bei der Verseifung (Nummer 5.2): Aufgrund des Fettgehalts in der Probe ist gegebenenfalls die Menge der eingesetzten Kaliumhydroxidlösung (Nummer 3.4) zu erhöhen;
—: bei der Extraktion (Nummer 5.3): Aufgrund des Vorhandenseins von Emulsionen ist gegebenenfalls eine Anpassung des Wasser/Ethanol-Verhältnisses von 2:1 erforderlich.

Um festzustellen, ob die angewandte Analysemethode zuverlässige Ergebnisse für diese spezifische Matrix (Milchaustausch-Futtermittel) liefert, ist ein Wiederfindungstest an einer weiteren Probeneinwaage durchzuführen. Ist die Wiederfindungsrate kleiner als 80 %, muss das Analyseergebnis um die Wiederfindung korrigiert werden.

8.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 15 % des höheren Werts nicht überschreiten.

9.
Ergebnisse eines Ringversuchs⁽²⁾

L =: Anzahl der Laboratorien

n =: Anzahl der Einzelwerte

s_r =: Standardabweichung der Wiederholbarkeit

s_R =: Standardabweichung der Vergleichbarkeit

r =: Wiederholbarkeit

R =: Vergleichbarkeit

VK_r =: Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit

VK_R =: Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit

	Vormischungen	Fertigfutter-vormischungen	Mineralfutter	Eiweiß-konzentrat	Ferkelaufzuchtfutter
L	13	12	13	12	13
n	48	45	47	46	49
Mittelwert [IE/kg]	17,02 × 106	1,21 × 106	537100	151800	18070
sr [IE/kg]	0,51 × 106	0,039 × 106	22080	12280	682
r [IE/kg]	1,43 × 106	0,109 × 106	61824	34384	1910
VK_r [%]	3,0	3,5	4,1	8,1	3,8
sR [IE/kg]	1,36 × 106	0,069 × 106	46300	23060	3614
R [IE/kg]	3,81 × 106	0,193 × 106	129640	64568	10119
VK_R [%]	8,0	6,2	8,6	15	20

Abbildung 1

B.
BESTIMMUNG DES VITAMIN-E-GEHALTS

Der Vitamin-E-Gehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: der Analysemethode gemäß EN 17547 Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung des Gehalts an Vitamin A, E und D⁽³⁾ — Verfahren mittels Reinigung durch Festphasenextraktion und Hochleistungs-Flüssigchromatographie oder
—: durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) unter Verwendung eines UV- oder Fluoreszenzdetektors, wie im Folgenden unter den Nummern 1 bis 9 beschrieben.

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Vitamin-E-Gehalts in Futtermitteln. Der Vitamin-E-Gehalt wird in mg DL-α-Tocopherol-Acetat je kg angegeben. 1 mg DL-α-Tocopherol-Acetat entspricht 0,91 mg DL-α-Tocopherol (Vitamin E). Die Bestimmungsgrenze beträgt 2 mg Vitamin E/kg. Diese Grenze wird nur mit dem Fluoreszenzdetektor erreicht. Bei einem UV-Detektor beträgt die Bestimmungsgrenze 10 mg/kg.

2.
Prinzip

Die Probe wird mit ethanolischer Kaliumhydroxidlösung hydrolysiert, und das Vitamin E wird mit Petrolether extrahiert. Das Lösungsmittel wird eingedampft; der Rückstand wird in Methanol gelöst und, falls notwendig, auf die erforderliche Konzentration verdünnt. Der Vitamin-E-Gehalt wird mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (RP-HPLC) unter Verwendung eines UV- oder Fluoreszenzdetektors bestimmt.

3.
Reagenzien

3.1.: Ethanol, σ = 96 %.

3.2.: Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 °C.

3.3.: Methanol

3.4.: Kaliumhydroxid-Lösung, c = 50 g/100 ml.

3.5.: Natriumascorbat-Lösung, c = 10 g/100 ml (siehe Bemerkung 7.7).

3.6.: Natriumsulfid, Na₂S · x H₂O (x = 7 bis 9).

3.6.1.: Natriumsulfid-Lösung, c = 0,5 mol/l in Glycerin, β = 120 g/l (für x = 9) (siehe Bemerkung 7.8).

3.7.: Phenolphthalein-Lösung, c = 2 g/100 ml in Ethanol (Nummer 3.1).

3.8.: Mobile Phase für die HPLC: Mischung von Methanol (Nummer 3.3) und Wasser z. B. 980 + 20 (V+V) Das Mischungsverhältnis ist der jeweils verwendeten Säule anzupassen.

3.9.: Stickstoff, sauerstofffrei.

3.10.: DL-α-Tocopherol-Acetat, reinst, mit zertifizierter Aktivität

3.10.1.: DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammlösung: 100 mg DL-α-Tocopherol-Acetat (Nummer 3.10) auf 0,1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben einwiegen. In Ethanol (Nummer 3.1) lösen und mit demselben Lösungsmittel zur Marke auffüllen. 1 ml dieser Lösung enthält 1 mg DL-α-Tocopherol-Acetat. (UV-Kontrolle siehe 5.6.1.3; Stabilisierung siehe Bemerkung 7.4).

3.11.: DL-α-Tocopherol, reinst, mit zertifizierter Aktivität

3.11.1.: DL-α-Tocopherol-Stammlösung: Von DL-α-Tocopherol (Nummer 3.11) werden 100 mg auf 0,1 mg genau in einen 100-ml Messkolben eingewogen. In Ethanol (Nummer 3.1) lösen und mit demselben Lösungsmittel zur Marke auffüllen. 1 ml dieser Lösung enthält 1 mg DL-α-Tocopherol. (UV-Kontrolle siehe 5.6.2.3; Stabilisierung siehe Bemerkung 7.4).

3.12.: 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (siehe Bemerkung 7.5).

4.
Geräte

4.1.: Rotationsfilmverdampfer.

4.2.: Braunglasgeräte

4.2.1.: Stehkolben oder Erlenmeyerkolben, 500 ml, mit Schliffhülse.

4.2.2.: Messkolben mit Schliffstopfen, enghalsig, 10, 25, 100 und 500 ml.

4.2.3.: Scheidetrichter, konische Form, 1000 ml, mit Schliffstopfen.

4.2.4.: Spitzkolben, 250 ml, mit Schliffhülsen.

4.3.: Allihn-Rückflusskühler, Mantellänge 300 mm, Kernschliff mit Adapter für Gaseinleitung.

4.4.: Phasentrennungsfaltenfilter, Durchmesser 185 mm (z. B. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).

4.5.: HPLC-Einrichtung mit Injektionssystem

4.5.1.: HPLC-Trennsäule, 250 mm × 4 mm, C₁₈, 5 oder 10 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule,

4.5.2.: UV- oder Fluoreszenzdetektor mit variabler Wellenlängeneinstellung.

4.6.: Spektralfotometer mit Quarz-Küvetten von 10 mm Schichtdicke.

4.7.: Wasserbad mit Magnetrührer.

4.8.: Extraktionsapparat (Abbildung 1) bestehend aus:

4.8.1.: 1-l-Standzylinder mit Schliff und Schliffstopfen,

4.8.2.: Schliffeinsatz mit Seitenarm und einem in der Höhe verschiebbaren Rohr in der Mitte. Das verschiebbare Rohr muss ein U-förmiges unteres Ende und eine Düse am entgegengesetzten Ende haben, sodass die obere Flüssigkeitsphase aus dem Zylinder in den Scheidetrichter überführt werden kann.

5.
Verfahren

Anmerkung:: Vitamin E ist empfindlich gegenüber Licht (UV-Strahlung) und Oxidation. Daher muss unter Ausschluss von Licht (Verwendung von Braunglasgeräten oder von mit Aluminiumfolie umhüllten Glasgeräten) und Sauerstoff (Stickstoffspülung) gearbeitet werden. Während der Extraktion muss das Luftpolster über der Flüssigkeit durch Stickstoff ersetzt werden (zur Vermeidung von Überdruck Stopfen immer wieder lüften).

5.1.
Vorbereitung der Probe

5.2.
Verseifung

Je nach Vitamin-E-Gehalt 2 bis 25 g der Probe auf 0,01 g genau in einen 500-ml-Steh- oder Erlenmeyerkolben (Nummer 4.2.1) einwiegen. Nacheinander unter Schwenken 130 ml Ethanol (Nummer 3.1), etwa 100 mg BHT (Nummer 3.12), 2 ml Natriumascorbat-Lösung (Nummer 3.5) und 2 ml Natriumsulfid-Lösung (Nummer 3.6) zusetzen. Den Kolben mit dem Rückflusskühler (Nummer 4.3) verbinden und in ein Wasserbad mit Magnetrührer (Nummer 4.7) geben. Bis zum Sieden erhitzen und 5 min am Rückflusskühler kochen. Anschließend 25 ml Kaliumhydroxidlösung (Nummer 3.4) durch den Rückflusskühler (Nummer 4.3) zugeben, und unter ständigem Rühren und schwachem Stickstoffstrom 25 min weiterkochen. Den Kühler mit etwa 20 ml Wasser ausspülen und den Kolbeninhalt auf Zimmertemperatur abkühlen.

5.3.
Extraktion

5.3.1.
Extraktion mithilfe eines Scheidetrichters (Nummer 4.2.3)

5.3.2.
Extraktion mithilfe eines Extraktionsapparats (Nummer 4.8)

Nach Phasentrennung (siehe Bemerkung 7.3) wird der Stopfen des Standzylinders (Nummer 4.8.1) durch den Schliffeinsatz (Nummer 4.8.2) ersetzt und das verschiebbare Rohr so eingestellt, dass sich das U-förmige untere Ende gerade über dem Niveau der Grenzfläche befindet. Durch Druckausübung von einer am Seitenarm angebrachten Stickstoffleitung wird die obere Petroletherphase in einen 1000-ml-Scheidetrichter (Nummer 4.2.3) überführt. 100 ml Petrolether (Nummer 3.2) werden in den Standzylinder gegeben, der mit einem Stopfen verschlossen und gründlich geschüttelt wird. Nach der Phasentrennung wird die obere Phase wie zuvor in den Scheidetrichter überführt. Diese Extraktion wird noch 1-mal mit 100 ml Petrolether (Nummer 3.2) und 2-mal mit je 50 ml Petrolether (Nummer 3.2) wiederholt, und die Petroletherphasen werden in den Scheidetrichter überführt. Die vereinigten Petroletherextrakte, wie unter Nummer 5.3.1 erläutert, waschen und wie dort beschrieben weiterverfahren.

5.4.
Vorbereitung der Probenlösung für die HPLC

Ein aliquoter Teil der Petrolether-Lösung (gemäß Nummer 5.3.1 oder 5.3.2) wird in einen 250-ml-Spitzkolben (Nummer 4.2.4) pipettiert. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck und bei einer Badtemperatur von höchstens 40 °C am Rotationsverdampfer (Nummer 4.1) fast bis zur Trockne eingedampft. Danach wird unter Stickstoff (Nummer 3.9) Druckausgleich geschaffen und der Kolben vom Rotationsverdampfer abgenommen. Das restliche Lösungsmittel wird im Stickstoffstrom (Nummer 3.9) abgeblasen, und der Rückstand wird sofort in einer definierten Menge (10 bis 100 ml) Methanol (Nummer 3.3) aufgenommen (die Konzentration von DL-α-Tocopherol muss etwa 5 bis 30 μg/ml betragen).

5.5.
Bestimmung durch HPLC

Die Abtrennung von Vitamin E erfolgt mithilfe einer Umkehrphasen-C₁₈-Säule (Nummer 4.5.1), und die Konzentration wird mithilfe eines Fluoreszenzdetektors (Anregung: 295 nm, Emission: 330 nm) oder eines UV-Detektors (292 nm) (Nummer 4.5.2) gemessen. Hierzu wird ein aliquoter Teil (z. B. 20 μl) der nach Nummer 5.4 erhaltenen methanolischen Lösung auf die Trennsäule gegeben und mit der mobilen Phase (Nummer 3.8) eluiert. Die mittlere Peakhöhe (-fläche) von mehreren Einspritzungen derselben Probenlösung wird ermittelt. In gleicher Weise werden auch die mittleren Peakhöhen (-flächen) von mehreren Einspritzungen der Kalibrierlösungen (Nummer 5.6.2) bestimmt.

HPLC-Parameter

Die folgenden Angaben sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen:

HPLC-Trennsäule (Nummer 4.5.1):	250 mm × 4 mm, C₁₈, 5 oder 10 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule
Mobile Phase (Nummer 3.8):	Mischung von Methanol (Nummer 3.3) und Wasser z. B. 980 + 20 (V+V).
Durchflussrate:	1 bis 2 ml/min
Detektor (Nummer 4.5.2)	Fluoreszenzdetektor (Anregung: 295 nm; Emission: 330 nm) oder UV-Detektor (292 nm)

5.6.
Kalibrierung (DL-α-Tocopherol-Acetat oder DL-α-Tocopherol)

5.6.1.
DL-α-Tocopherol-Acetat-Standard

5.6.1.1.
Herstellen der Gebrauchsstandardlösung

Von der DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammlösung (Nummer 3.10.1) werden 25 ml in einen 500-ml-Steh- oder Erlenmeyerkolben (Nummer 4.2.1) pipettiert und, wie unter 5.2 beschrieben, hydrolysiert. Anschließend mit Petrolether (Nummer 3.2) gemäß Nummer 5.3 extrahieren und mit Petrolether auf 500 ml auffüllen. Von diesem Extrakt werden 25 ml am Rotationsverdampfer (siehe 5.4) fast bis zur Trockne eingedampft. Das verbleibende Lösungsmittel wird im Stickstoffstrom (Nummer 3.9) abgeblasen, und der Rückstand wird in 25,0 ml Methanol (Nummer 3.3) aufgenommen. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 45,5 μg DL-α-Tocopherol je ml; das entspricht 50,0 μg DL-α-Tocopherol-Acetat je ml. Die Gebrauchsstandardlösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

5.6.1.2.
Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrationskurve

Von der Gebrauchsstandardlösung werden 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml bzw. 10,0 ml in jeweils einen 20-ml-Messkolben pipettiert; es wird mit Methanol (Nummer 3.3) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Der Sollgehalt dieser Lösungen beträgt 2,5 μg/ml, 5,0 μg/ml, 10,0 μg/ml bzw. 25,0 μg/ml DL-α-Tocopherol-Acetat, d. h. 2,28 μg/ml, 4,55 μg/ml, 9,10 μg/ml bzw. 22,8 μg/ml DL-α-Tocopherol. Von jeder Kalibrierlösung werden mehrmals 20 μl eingespritzt, und die mittleren Peakhöhen (-flächen) werden gemessen. Anhand der so ermittelten mittleren Peakhöhen (-flächen) wird eine Kalibrationskurve erstellt.

5.6.1.3.
UV-Kontrolle der DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammlösung (Nummer 3.10.1)

Von der DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammlösung (Nummer 3.10.1) werden 5,0 ml mit Ethanol auf 25,0 ml aufgefüllt. Das UV-Spektrum dieser Lösung wird gegen Ethanol (Nummer 3.1) im Spektralfotometer (Nummer 4.6) zwischen 250 und 320 nm gemessen. Das Extinktionsmaximum muss bei 284 nm liegen: E1 cm1 %43,6bei 284 nm in Ethanol Bei der vorliegenden Verdünnung muss eine Extinktion von 0,84 bis 0,88 erzielt werden.

5.6.2.
DL-α-Tocopherol-Standard

5.6.2.1.
Herstellen der Gebrauchsstandardlösung

Von der DL-α-Tocopherol-Stammlösung (Nummer 3.11.1) werden 2 ml in einen 50-ml-Messkolben pipettiert und in Methanol (Nummer 3.3) gelöst; es wird mit Methanol zur Marke aufgefüllt. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 40 μg DL-α-Tocopherol je ml; das entspricht 44,0 μg DL-α-Tocopherol-Acetat je ml. Die Gebrauchsstandardlösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

5.6.2.2.
Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrationskurve

Von der Gebrauchsstandardlösung werden 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml bzw. 10,0 ml in jeweils einen 20-ml-Messkolben pipettiert; es wird mit Methanol (Nummer 3.3) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Der Sollgehalt dieser Lösungen beträgt 2,0 μg/ml, 4,0 μg/ml, 8,0 μg/ml bzw. 20,0 μg/ml DL-α-Tocopherol, d. h. 2,20 μg/ml, 4,40 μg/ml, 8,79 μg/ml bzw. 22,0 μg/ml DL-α-Tocopherol-Acetat. Von jeder Kalibrierlösung werden mehrmals 20 μl eingespritzt, und die mittleren Peakhöhen (-flächen) werden gemessen. Anhand der so ermittelten mittleren Peakhöhen (-flächen) wird eine Kalibrationskurve erstellt.

5.6.2.3.
UV-Kontrolle der DL-α-Tocopherol-Stammlösung (Nummer 3.11.1)

Von der DL-α-Tocopherol-Stammlösung (Nummer 3.11.1) werden 2,0 ml mit Ethanol auf 25,0 ml aufgefüllt; das UV-Spektrum dieser Lösung wird gegen Ethanol (Nummer 3.1) im Spektralfotometer (Nummer 4.6) zwischen 250 und 320 nm gemessen. Das Extinktionsmaximum muss bei 292 nm liegen: E1 cm1 %75,8bei 292 nm in Ethanol Bei der vorliegenden Verdünnung muss eine Extinktion von 0,6 erzielt werden.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Aus der mittleren Höhe (Fläche) der Vitamin-E-Peaks der Probenlösung wird anhand der Kalibrationskurve (Nummer 5.6.1.2 oder 5.6.2.2) die Konzentration der Probenlösung in μg/ml (berechnet als DL-α-Tocopherol-Acetat) bestimmt. Der Vitamin-E-Gehalt w (in mg/kg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet: w500 × c × V2V1 × mmgkg wobei:

c=: Vitamin-E-Konzentration (als DL-α-Tocopherol-Acetat) der Probenlösung (Nummer 5.4) in μg/ml,
V₁=: Volumen der Probenlösung (Nummer 5.4) in ml,
V₂=: Volumen des unter 5.4 entnommenen aliquoten Teils in ml,
m=: Probeneinwaage in g.

7.
Bemerkungen

7.1.: Bei Proben mit niedriger Vitamin-E-Konzentration kann es zweckmäßig sein, die Petroletherextrakte von zwei Verseifungsansätzen (Einwaage 25 g) zu einer Probenlösung für die HPLC-Bestimmung zu vereinigen.

7.2.: Die Einwaage für die Analyse darf höchstens 2 g Fett enthalten.

7.3.: Bei schlechter Phasentrennung können etwa 10 ml Ethanol (Nummer 3.1) zur Zerstörung der Emulsion zugegeben werden.

7.4.: Nach der spektralfotometrischen Vermessung der DL-α-Tocopherol-Acetat- oder der DL-α-Tocopherol-Lösung nach Nummer 5.6.1.3 bzw. 5.6.2.3 empfiehlt es sich, der Lösung (Nummer 3.10.1 bzw. 3.10.2) etwa 10 mg BHT (Nummer 3.12) zuzusetzen und die Lösung im Kühlschrank aufzubewahren (Haltbarkeit höchstens 4 Wochen).

7.5.: Statt BHT kann Hydrochinon verwendet werden.

7.6.: Bei Verwendung einer Normalphasensäule ist die Trennung von α-, β-, γ- und δ-Tocopherol möglich.

7.7.: Statt Natriumascorbat-Lösung können etwa 150 mg Ascorbinsäure verwendet werden.

7.8.: Statt Natriumsulfid-Lösung können etwa 50 mg EDTA verwendet werden.

7.9: Vitamin-E-Acetat hydrolysiert unter alkalischen Bedingungen sehr schnell und ist deshalb sehr oxidationsanfällig, insbesondere in Gegenwart von Spurenelementen wie Eisen oder Kupfer. Bei der Bestimmung des Vitamin-E-Gehalts in Vormischungen, bei denen ein Gehalt von 5000 mg/kg überschritten wird, könnte es zu einem Abbau von Vitamin E kommen. Deshalb wird zur Bestätigung eine HPLC-Methode mit einem enzymatischen Aufschluss der Vitamin-E-Formel ohne einen alkalischen Verseifungsschritt empfohlen.

8.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 15 % des höheren Werts nicht überschreiten.

9.
Ergebnisse eines Ringversuchs⁽⁴⁾

L =: Anzahl der Laboratorien

n =: Anzahl der Einzelwerte

s_r =: Standardabweichung der Wiederholbarkeit

s_R =: Standardabweichung der Vergleichbarkeit

r =: Wiederholbarkeit

R =: Vergleichbarkeit

VK_r =: Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit

VK_R =: Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit.

	Vormischungen	Fertigfutter-vormischungen	Mineralfutter	Eiweiß-konzentrat	Ferkelaufzuchtfutter
L	12	12	12	12	12
n	48	48	48	48	48
Mittelwert [mg/kg]	17380	1187	926	315	61,3
s_r [mg/kg]	384	45,3	25,2	13,0	2,3
r [mg/kg]	1075	126,8	70,6	36,4	6,4
VK_r [%]	2,2	3,8	2,7	4,1	3,8
s_R [mg/kg]	830	65,0	55,5	18,9	7,8
R [mg/kg]	2324	182,0	155,4	52,9	21,8
VK_R [%]	4,8	5,5	6,0	6,0	12,7

Abbildung 2

C.
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN DEN SPURENELEMENTEN EISEN, KUPFER, MANGAN UND ZINK

Der Eisen-, Kupfer-, Mangan- und Zinkgehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 15510 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung von Calcium, Natrium, Phosphor, Magnesium, Kalium, Eisen, Zink, Kupfer, Mangan, Cobalt, Molybdän und Blei mittels ICP-AES” oder
—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 15621 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung von Calcium, Natrium, Phosphor, Magnesium, Kalium, Schwefel, Eisen, Zink, Kupfer, Mangan und Cobalt nach Druckaufschluss mittels ICP-AES” oder
—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17053 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung von Spurenelementen, Schwermetallen und anderen Elementen in Futtermitteln mittels ICP-MS (Multimethode)” oder
—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 6869 „Futtermittel — Bestimmung der Gehalte an Calcium, Kupfer, Eisen, Magnesium, Mangan, Kalium, Natrium und Zink — Atomabsorptionsspektrometrisches Verfahren” oder
—: mit der unter den Nummern 1 bis 8 beschriebene Methode der Flammen-Atomabsorptionsspektrometrie (FAAS).

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an den Spurenelementen Eisen, Kupfer, Mangan und Zink in Futtermitteln.⁽⁵⁾ Die Bestimmungsgrenzen liegen bei:

—: Eisen (Fe): 20 mg/kg,
—: Kupfer (Cu): 10 mg/kg,
—: Mangan (Mn): 20 mg/kg,
—: Zink (Zn): 20 mg/kg,

2.
Prinzip

Die Probe wird nach Zerstörung eventuell vorhandener organischer Substanz in Salzsäure gelöst. Die Elemente Eisen, Kupfer, Mangan und Zink werden nach entsprechender Verdünnung der Analysenlösung mittels Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt.

3.
Reagenzien

Vorbemerkungen

Das zur Herstellung der Reagenzien und Analysenlösungen verwendete Wasser muss „frei” von den zu bestimmenden Kationen sein, d. h., das Wasser muss entweder in einer Borsilikatglas- oder Quarzapparatur 2-fach destilliert oder durch doppelten Ionenaustausch gereinigt worden sein. Die zur Analyse verwendeten Reagenzien müssen mindestens von analysenreiner Qualität sein. Die Abwesenheit des zu bestimmenden Elements wird mittels eines Blindversuchs kontrolliert. Falls erforderlich, sind die Reagenzien einer zusätzlichen Reinigung zu unterziehen. Anstelle der nachfolgend beschriebenen Standardlösungen können auch handelsübliche Standardlösungen verwendet werden, deren Reinheit garantiert und vor der Verwendung kontrolliert wurde.

3.1.: Salzsäure (D: 1,19 g/ml).

3.2.: Salzsäure (6 mol/l).

3.3.: Salzsäure (0,5 mol/l).

3.4.: Fluorwasserstoffsäure (Volumenkonzentration = 38 bis 40 %); Eisengehalt: weniger als 1 mg/l; Glührückstand (als Sulfat): weniger als 10 mg/l.

3.5.: Schwefelsäure (D: 1,84 g/ml).

3.6.: Wasserstoffperoxid, ca. 100 Volumina Sauerstoff (Massenanteil = 30 %).

3.7.: Eisen-Standardlösung (1000 μg Fe/ml), wie folgt zubereitet, oder eine gleichwertige handelsübliche Lösung: 1 g Eisendraht wird in 200 ml 6 mol/l Salzsäure (Nummer 3.2) gelöst. Es werden 16 ml Wasserstoffperoxid (Nummer 3.6) zugegeben; dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt:

3.7.1.: Eisen-Gebrauchsstandardlösung (100 μg Fe/ml): Die Standardlösung (Nummer 3.7) wird im Verhältnis 1:9 mit Wasser verdünnt.

3.8.

Kupfer-Standardlösung (1000 μg Cu/ml), wie folgt zubereitet, oder eine gleichwertige handelsübliche Lösung:

—: In 25 ml 6 mol/l Salzsäure (Nummer 3.2) wird 1 g Kupfer in Pulverform gelöst. Es werden 5 ml Wasserstoffperoxid (Nummer 3.6) zugegeben, und dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.8.1.: Kupfer-Gebrauchsstandardlösung (10 μg Cu/ml): Die Standardlösung (Nummer 3.8) wird im Verhältnis 1:9 mit Wasser verdünnt; anschließend wird die so entstandene Lösung wiederum im Verhältnis 1:9 mit Wasser verdünnt.

3.9.

Mangan-Standardlösung (1000 μg Mn/ml), wie folgt zubereitet, oder eine gleichwertige handelsübliche Lösung:

—: In 25 ml 6 mol/l Salzsäure (Nummer 3.2) wird 1 g Mangan in Pulverform gelöst; dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.9.1.: Mangan-Gebrauchsstandardlösung (10 μg Mn/ml): Die Standardlösung (Nummer 3.9) wird im Verhältnis 1:9 mit Wasser verdünnt; anschließend wird die so entstandene Lösung wiederum im Verhältnis 1:9 mit Wasser verdünnt.

3.10.

Zink-Standardlösung (1000 μg Zn/ml), wie folgt zubereitet, oder eine gleichwertige handelsübliche Lösung:

—: In 25 ml 6 mol/l Salzsäure (Nummer 3.2) wird 1 g Zink in Streifen- oder Plattenform gelöst; dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.10.1.: Zink-Gebrauchsstandardlösung (10 μg Zn/ml): Die Standardlösung (Nummer 3.10) wird im Verhältnis 1:9 mit Wasser verdünnt; anschließend wird die so entstandene Lösung wiederum im Verhältnis 1:9 mit Wasser verdünnt.

3.11.: Lanthanchloridlösung: In 150 ml Wasser wird 12 g Lanthanoxid gelöst und 100 ml 6 mol/l Salzsäure (Nummer 3.2) zugegeben. Dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

4.
Geräte

4.1.: Muffelofen mit Regelvorrichtung und gegebenenfalls mit Temperaturanzeige.

4.2.: Glasgeräte müssen aus resistentem Borsilikatglas sein. Es wird empfohlen, Glasgeräte zu benutzen, die ausschließlich der Bestimmung des Gehalts an Spurenelementen vorbehalten bleiben.

4.3.: Atomabsorptions-Spektralfotometer; das Gerät muss innerhalb des vorgesehenen Messbereichs hinsichtlich seiner Empfindlichkeit und Genauigkeit den Anforderungen der jeweiligen Methode genügen.

5.
Verfahren⁽⁶⁾

5.1.
Proben mit organischen Bestandteilen

5.1.1.
Veraschung und Herstellung der Analysenlösung⁽⁷⁾

5.1.1.1.

Von der Probe werden 5 bis 10 g (auf 0,2 mg genau abgewogen) in eine Quarz- oder Platinschale gegeben (siehe Anmerkung b) und im Trockenschrank bei 105 °C getrocknet; dann wird die Schale in den kalten Muffelofen (Nummer 4.1) verbracht. Der Ofen wird geschlossen (siehe Anmerkung c) und die Temperatur innerhalb von ca. 90 min langsam auf 450 bis 475 °C erhöht. Diese Temperatur wird 4 bis 16 h (z. B. über Nacht) aufrechterhalten, um Kohleteilchen zu entfernen; dann wird der Ofen geöffnet und abkühlen gelassen (siehe Anmerkung d).

Die Asche wird mit Wasser angefeuchtet und in ein 250-ml-Becherglas gegeben. Die Schale wird mit insgesamt etwa 5 ml Salzsäure (Nummer 3.1) ausgespült, die anschließend langsam und vorsichtig (da es aufgrund von CO₂-Bildung eventuell zu einer heftigen Reaktion kommen kann) in das Becherglas gegeben wird. Unter Schütteln wird Salzsäure (Nummer 3.1) tropfenweise zugegeben, bis die Schaumbildung aufhört. Die Salzsäure wird unter gelegentlichem Umrühren mit einem Glasstab bis zur Trockne abgedampft.

Dem Rückstand werden 15 ml 6 mol/l Salzsäure (Nummer 3.2) und anschließend etwa 120 ml Wasser zugefügt. Umgerührt wird mit dem Glasstab, der in dem Becherglas zu belassen ist. Letzteres wird mit einem Uhrglas abgedeckt. Die Flüssigkeit wird langsam zum Sieden gebracht und so lange im Sieden gehalten, bis die Asche vollständig gelöst ist. Dann wird durch ein aschefreies Filterpapier filtriert und das Filtrat in einem 250-ml-Messkolben aufgefangen. Das Becherglas und der Filter werden mit 5 ml heißer 6 mol/l Salzsäure (Nummer 3.2) und 2-mal mit kochendem Wasser ausgewaschen. Anschließend wird der Messkolben mit Wasser zur Marke aufgefüllt (HCl-Konzentration etwa 0,5 mol/l).

5.1.1.2.

Sollte der Filterrückstand schwarz aussehen (Kohlenstoff), so wird er im Trockenschrank abermals bei 450 bis 475 °C verascht. Diese Veraschung, die nur wenige Stunden erfordert (etwa 3 bis 5 h) ist abgeschlossen, wenn die Asche weiß oder nahezu weiß aussieht. Der Rückstand wird mit etwa 2 ml Salzsäure (Nummer 3.1) aufgenommen, zur Trockne eingedampft und mit 5 ml 6 mol/l Salzsäure (Nummer 3.2) versetzt. Nach dem Erwärmen wird die Lösung in den Messkolben filtriert, und Letzterer mit Wasser zur Marke aufgefüllt (HCl-Konzentration etwa 0,5 mol/l).

Anmerkungen:

a): Bei der Bestimmung des Gehalts an Spurenelementen ist unbedingt auf die Gefahr von Verunreinigungen, insbesondere durch Zink, Kupfer und Eisen zu achten. Deshalb müssen die bei der Probenvorbereitung benutzten Geräte frei von diesen Metallen sein.
Um die Gefahr von Verunreinigungen einzuschränken, ist in staubfreier Luft, mit absolut reinen Geräten und sorgfältig gewaschenen Glasgeräten zu arbeiten. Die Zinkbestimmung ist für Verunreinigungen durch Glasgeräte, Reagenzien, Staub usw. besonders anfällig.
b): Die Einwaage wird nach dem etwa zu erwartenden Spurenelementgehalt des Futtermittels unter Berücksichtigung der Empfindlichkeit des verwendeten Spektralfotometers berechnet. Bei Futtermitteln, die einen niedrigen Gehalt an Spurenelementen aufweisen, kann es erforderlich sein, eine Probe von 10 bis 20 g einzuwiegen und das Volumen der Analysenlösung auf 100 ml zu begrenzen.
c): Die Veraschung muss in einem geschlossenen Muffelofen ohne Einblasen von Luft oder Sauerstoff erfolgen.
d): Die vom Pyrometer angezeigte Temperatur darf 475 °C nicht überschreiten.

5.1.2.
Spektralfotometrische Bestimmung

5.1.2.1.
Herstellen der Kalibrierlösungen

Aus den Gebrauchsstandardlösungen 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 und 3.10.1 werden für jedes der zu bestimmenden Spurenelemente eine Reihe von Kalibrierlösungen hergestellt. Jede dieser Kalibrierlösungen hat eine HCl-Konzentration von etwa 0,5 mol/l und (im Falle von Eisen, Mangan und Zink) einen Lanthanchlorid-Gehalt, der einer Massenkonzentration von 0,1 % La (w/v) entspricht. Die gewählten Spurenelementkonzentrationen müssen im Empfindlichkeitsbereich des verwendeten Spektralfotometers liegen. Die nachfolgenden Tabellen zeigen Beispiele für die Zusammensetzung typischer Reihen von Kalibrierlösungen. Je nach Typ und Empfindlichkeit des verwendeten Spektralfotometers kann es jedoch erforderlich sein, für die Kalibrierlösungen eine andere Konzentration zu wählen.

Eisen

μg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml Gebrauchsstandardlösung (Nummer 3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
ml HCl (Nummer 3.2)	7	7	7	7	7	7	7
10 ml Lanthanchloridlösung (Nummer 3.11) zugeben und mit Wasser auf 100 ml auffüllen.

Kupfer

μg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml Gebrauchsstandardlösung (Nummer 3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (Nummer 3.2)	8	8	8	8	8	8	8

Mangan

μg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml Gebrauchsstandardlösung (Nummer 3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (Nummer 3.2)	7	7	7	7	7	7	7
10 ml Lanthanchloridlösung (Nummer 3.11) zugeben und mit Wasser auf 100 ml auffüllen.

Zink

μg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml Gebrauchsstandardlösung (Nummer 3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
ml HCl (Nummer 3.2)	7	7	7	7	7	7	7
10 ml Lanthanchloridlösung (Nummer 3.11) zugeben und mit Wasser auf 100 ml auffüllen.

5.1.2.2.
Herstellen der Analysenlösung

Für die Bestimmung des Kupfergehalts kann die nach Nummer 5.1.1 hergestellte Analysenlösung in der Regel direkt verwendet werden. Gegebenenfalls wird ein aliquoter Teil dieser Analysenlösung in einen 100-ml-Messkolben pipettiert und mit 0,5 mol/l Salzsäure (Nummer 3.3) zur Marke aufgefüllt, um ihre Konzentration in den Bereich der Kalibrierlösungen zu bringen. Für die Bestimmung des Gehalts an Eisen, Mangan und Zink wird ein aliquoter Teil der nach Nummer 5.1.1 hergestellten Lösung in einen 100-ml-Messkolben pipettiert. Es werden 10 ml Lanthanchloridlösung (Nummer 3.11) zugegeben und mit 0,5 mol/l Salzsäure (Nummer 3.3) zur Marke aufgefüllt (siehe Bemerkung 8).

5.1.2.3.
Blindversuch

Es wird ein Blindversuch ausgeführt, der alle Verfahrensschritte umfassen muss, nur dass das Probematerial selbst weggelassen wird. Die Kalibrierlösung „0” ersetzt nicht den Blindversuch.

5.1.2.4.
Messung der Atomabsorption

Die Atomabsorption der Kalibrierlösungen und der Analysenlösungen ist mit oxydierender Luft-Azetylen-Flamme bei folgenden Wellenlängen zu messen:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Jede Messung ist 4-mal auszuführen.

5.2.
Mineralfutter

Enthält die Probe keine organischen Substanzen, so erübrigt sich eine vorherige Veraschung. In diesem Fall wird dann ab Nummer 5.1.1.1 zweiter Absatz weiter verfahren. Ein Abrauchen mit Fluorwasserstoffsäure kann entfallen.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Die Spurenelementkonzentration in der Analysenlösung wird mithilfe einer Kalibrationskurve berechnet und das Ergebnis in mg Spurenelement/kg der Probe (ppm) ausgedrückt.

7.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen eines Analytikers bei ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—: 5 mg/kg absolut für Spurenelementgehalte bis 50 mg/kg,
—: 10 % des höheren Werts für Spurenelementgehalte von 50 bis 100 mg/kg,
—: 10 mg/kg absolut für Spurenelementgehalte von 100 bis 200 mg/kg,
—: 5 % des höheren Werts für Spurenelementgehalte von mehr als 200 mg/kg.

8.
Bemerkung

Das Vorhandensein von größeren Phosphatmengen kann die Bestimmung des Gehalts an Eisen, Mangan und Zink beeinträchtigen. Diese Interferenzen sind durch die Zugabe von Lanthanchloridlösung (Nummer 3.11) zu korrigieren. Weist die Probe jedoch das Gewichtsverhältnis Ca + Mg/P > 2 auf, kann auf die Zugabe von Lanthanchloridlösung (Nummer 3.11) zu der Analysenlösung und den Kalibrierlösungen verzichtet werden.

D.
BESTIMMUNG DES HALOFUGINONGEHALTS

DL-trans-7-Brom-6-chlor-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-4(3H)-chinazolinon-hydrobromid

Der Halofuginongehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17299 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Screening und Bestimmung von zugelassenen Kokzidiostatika in Konzentrationen von Zusatzstoffen und deren Verschleppungen im Bereich von 1 % und 3 % sowie von nicht registrierten Kokzidiostatika und von einem Antibiotikum in Konzentrationen unterhalb von Zusatzstoffen in Mischfuttermitteln mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Nachweis (LC-MS/MS)” oder
—: durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektors, wie im Folgenden unter den Nummern 1 bis 8 beschrieben.

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Halofuginongehalts von Futtermitteln. Die Bestimmungsgrenze beträgt 1 mg/kg.

2.
Prinzip

Nach der Behandlung mit heißem Wasser wird Halofuginon als freie Base mit Ethylacetat extrahiert und anschließend durch Ausschütteln mit Salzsäure in das Hydrochlorid überführt. Der Extrakt wird durch Ionenaustauschchromatografie gereinigt. Der Halofuginongehalt wird mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektors bestimmt.

3.
Reagenzien

3.1.: Acetonitril, HPLC-Qualität.

3.2.: Amberlite XAD-2-Harz.

3.3.: Ammoniumacetat.

3.4.: Ethylacetat.

3.5.: Essigsäure (Eisessig).

3.6.: Halofuginon-Standardsubstanz: DL-trans-7-Brom-6-chlor-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-4(3H)-chinazolinon-hydrobromid, E 764

3.6.1.: Halofuginon-Standard-Stammlösung, 100 mg/ml
Von Halofuginon (Nummer 3.6) werden 50 mg auf 0,1 mg genau in einen 500-ml-Messkolben eingewogen und in Ammoniumacetat-Pufferlösung (Nummer 3.18) gelöst. Es wird mit der Pufferlösung zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung ist 3 Wochen haltbar, wenn sie im Dunkeln bei 5 °C aufbewahrt wird.

3.6.2.: Kalibrierlösungen
Von der Standard-Stammlösung (Nummer 3.6.1) werden 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 bzw. 6,0 ml jeweils in einen 100-ml-Messkolben überführt. Es wird mit der mobilen Phase (Nummer 3.21) zur Marke aufgefüllt und durchmischt. Diese Lösungen enthalten Halofuginon in Konzentrationen von 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 bzw. 6,0 μg/ml. Die Lösungen müssen vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.7.: Salzsäure (ρ₂₀ = ca. 1,16 g/ml).

3.8.: Methanol

3.9.: Silbernitrat.

3.10.: Natriumascorbat.

3.11.: Natriumcarbonat (Soda).

3.12.: Natriumchlorid.

3.13.: EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz).

3.14.: Wasser, HPLC-Qualität.

3.15.: Natriumcarbonatlösung, c = 10 g/100 ml.

3.16.: Mit Natriumchlorid gesättigte Natriumcarbonatlösung, c = 5 g/100 ml
50 g Natriumcarbonat (Nummer 3.11) werden in Wasser gelöst und auf 1 l verdünnt; dann wird Natriumchlorid (Nummer 3.12) zugegeben, bis die Lösung gesättigt ist.

3.17.: Salzsäure, ca. 0,1 mol/l
10 ml Salzsäure (Nummer 3.7) werden mit Wasser auf 1 l verdünnt.

3.18.: Ammoniumacetat-Pufferlösung, ca. 0,25 mol/l
19,3 g Ammoniumacetat (Nummer 3.3) und 30 ml Essigsäure (Nummer 3.5) werden in Wasser (Nummer 3.14) gelöst und auf 1 l verdünnt.

3.19.: Vorbereitung des Amberlite XAD-2-Harzes
Eine ausreichende Menge Amberlite (Nummer 3.2) wird mit Wasser chloridfrei gewaschen. Die Prüfung der Waschflüssigkeit erfolgt mit Silbernitratlösung (Nummer 3.20). Danach wird das Harz mit 50 ml Methanol (Nummer 3.8) gewaschen. Das Methanol wird verworfen und das Harz in frischem Methanol aufbewahrt.

3.20.: Silbernitratlösung, ca. 0,1 mol/l
0,17 g Silbernitrat (Nummer 3.9) werden in 10 ml Wasser gelöst.

3.21.: Mobile Phase für die HPLC:
500 ml Acetonitril (Nummer 3.1) werden mit 300 ml Ammoniumacetat-Pufferlösung (Nummer 3.18) und 1200 ml Wasser (Nummer 3.14) gemischt. Der pH-Wert wird mit Essigsäure (Nummer 3.5) auf 4,3 eingestellt. Die Lösung wird durch einen 0,22-μm-Filter (Nummer 4.8) filtriert und entgast (z. B. durch 10-minütige Ultraschallbehandlung). Diese Lösung ist 1 Monat lang haltbar, wenn sie in einem verschlossenen Gefäß im Dunkeln aufbewahrt wird.

4.
Geräte

4.1.: Ultraschallbad.

4.2.: Rotationsfilmverdampfer.

4.3.: Zentrifuge.

4.4.: HPLC-Einrichtung mit UV-Detektor mit variabler Wellenlängeneinstellung oder Diodenarray-Detektor

4.4.1.: HPLC-Trennsäule, 300 mm × 4 mm, C₁₈, 10 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule.

4.5.: Glassäule (300 mm × 10 mm) mit gesintertem Glasfilter und Absperrhahn.

4.6.: Glasfaserfilter, 150 mm Durchmesser.

4.7.: Membranfilter, 0,45 μm Porengröße.

4.8.: Membranfilter, 0,22 μm Porengröße.

5.
Verfahren

Anmerkung:: Halofuginon ist als freie Base in Alkali- und Ethylacetat-Lösungen instabil. Es darf höchstens 30 min in Ethylacetat bleiben.

5.1.
Allgemeines

5.1.1.: Zur Prüfung, dass weder Halofuginon noch Störsubstanzen vorhanden sind, ist eine Blindprobe zu untersuchen.

5.1.2.

Die Wiederfindungsrate wird ermittelt, indem eine Blindprobe untersucht wird, die mit Halofuginon angereichert wurde. Die zugesetzte Menge an Halofuginon sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen. Zur Anreicherung auf einen Gehalt von 3 mg/kg werden 300 μl der Standard-Stammlösung (Nummer 3.6.1) zu 10 g der Blindprobe gegeben. Es wird gemischt und 10 min gewartet, bevor mit der Extraktion (Nummer 5.2) fortgefahren wird.

Anmerkung:: Für den Zweck dieser Methode muss die Blindprobe ähnlich zusammengesetzt sein wie die zu untersuchende Probe, und Halofuginon darf nicht nachweisbar sein.

5.2.
Extraktion

Von der vorbereiteten Probe werden 10 g auf 0,1 g genau in ein 200-ml-Zentrifugenglas eingewogen. Es werden 0,5 g Natriumascorbat (Nummer 3.10), 0,5 g EDTA (Nummer 3.13) und 20 ml Wasser hinzugefügt, und es wird gemischt. Das Zentrifugenglas wird 5 min in ein 80 °C heißes Wasserbad gestellt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 20 ml Natriumcarbonatlösung (Nummer 3.15) hinzugefügt, und es wird gemischt. Unmittelbar danach werden 100 ml Ethylacetat (Nummer 3.4) hinzugefügt, und es wird 15 s kräftig von Hand geschüttelt. Danach wird das Zentrifugenglas mit gelockertem Stopfen 3 min in ein Ultraschallbad (Nummer 4.1) gestellt. Es wird 2 min zentrifugiert und die Ethylacetatphase durch einen Glasfaserfilter (Nummer 4.6) in einen 500-ml-Scheidetrichter dekantiert. Die Extraktion der Probe wird mit weiteren 100 ml Ethylacetat wiederholt. Die vereinigten Extrakte werden 1 min lang mit 50 ml der mit Natriumchlorid gesättigten Natriumcarbonatlösung (Nummer 3.16) gewaschen. Die wässrige Phase wird verworfen. Die organische Phase wird 1 min mit 50 ml Salzsäure (Nummer 3.17) extrahiert. Die untere Säurephase wird in einen 250-ml-Scheidetrichter abgelassen. Die organische Phase wird erneut 1,5 min mit weiteren 50 ml Salzsäure extrahiert. Die beiden Säureextrakte werden vereinigt und durch ca. 10 s langes Schütteln mit 10 ml Ethylacetat (Nummer 3.4) gewaschen. Die wässrige Phase wird quantitativ in einen 250-ml-Rundkolben überführt und die organische Phase verworfen. Das restliche in der sauren Lösung enthaltene Ethylacetat wird mithilfe des Rotationsverdampfers (Nummer 4.2) entfernt. Die Temperatur des Wasserbads darf 40 °C nicht überschreiten. Bei einem Unterdruck von ca. 25 mbar wird das restliche Ethylacetat bei 38 °C innerhalb von 5 min entfernt.

5.3.
Clean-up

5.3.1.
Vorbereitung der Amberlitesäule

Für jeden Probenextrakt wird eine XAD-2-Säule vorbereitet. Von dem vorbereiteten Amberlite (Nummer 3.19) werden 10 g mit Methanol (Nummer 3.8) in eine Glassäule (Nummer 4.5) eingefüllt. Auf das obere Ende des Harzbettes wird ein kleiner Glaswattebausch gebracht. Das Methanol wird aus der Säule ablaufen gelassen und das Harz mit 100 ml Wasser gewaschen. Sobald die Flüssigkeit das obere Ende des Harzbettes erreicht hat, wird der Absperrhahn geschlossen. Vor Gebrauch ist die Säule 10 min zu äquilibrieren. Die Säule darf nie trockenlaufen.

5.3.2.
Clean-up der Probe

Der Extrakt (Nummer 5.2) wird quantitativ auf die vorbereitete Amberlitesäule (Nummer 5.3.1) aufgebracht und eluiert. Das Eluat wird verworfen. Die Elutionsgeschwindigkeit darf 20 ml/min nicht überschreiten. Der Rundkolben wird mit 20 ml Salzsäure (Nummer 3.17) gespült und die Austauschersäule mit der Spülflüssigkeit gewaschen. Die eventuell auf der Säule verbliebene saure Lösung wird mit einem Luftstrom restlos ausgeblasen. Die Waschlösungen werden verworfen. Es werden 100 ml Methanol (Nummer 3.8) auf die Säule gegeben und ein Eluat von 5 bis 10 ml in einem 250-ml-Rundkolben aufgefangen. Das restliche Methanol wird 10 min lang zur Äquilibrierung auf dem Harz belassen; anschließend wird die Elution mit einer Elutionsgeschwindigkeit von höchstens 20 ml/min fortgesetzt und das Eluat in demselben Rundkolben aufgefangen. Das Methanol wird am Rotationsverdampfer (Nummer 4.2) abgedampft, wobei die Temperatur des Wasserbads 40 °C nicht übersteigen darf. Der Rückstand wird unter Verwendung der mobilen Phase (Nummer 3.21) quantitativ in einen 10-ml-Messkolben überführt. Es wird mit der mobilen Phase zur Marke aufgefüllt und gemischt. Ein aliquoter Teil wird durch einen Membranfilter (Nummer 4.7) filtriert. Diese Lösung wird für die HPLC-Bestimmung (Nummer 5.4) aufbewahrt.

5.4.
HPLC-Bestimmung

5.4.1.
Parameter

Die folgenden Angaben sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen:

HPLC-Trennsäule (Nummer 4.4.1),

Mobile Phase für die HPLC (Nummer 3.21),

Durchflussrate: 1,5 bis 2 ml/min

Detektionswellenlänge: 243 nm

Einspritzvolumen: 40 bis 100 μl.

Die Stabilität des chromatografischen Systems wird überprüft, indem die Kalibrierlösung (Nummer 3.6.2), die 3,0 μg/ml enthält, mehrmals eingespritzt wird, bis konstante Peakhöhen (-flächen) und Retentionszeiten erreicht sind.

5.4.2.
Erstellung der Kalibrationskurve

Jede Kalibrierlösung (Nummer 3.6.2) wird mehrmals eingespritzt, und die Peakhöhen (-flächen) für die einzelnen Konzentrationen werden gemessen. Es wird eine Kalibrationskurve gezeichnet, indem die mittleren Peakhöhen oder -flächen auf der Ordinate und die dazugehörigen Konzentrationen in μg/ml auf der Abszisse aufgetragen werden.

5.4.3.
Bestimmung der Probenlösung

Der Probenextrakt (Nummer 5.3.2) wird mehrmals eingespritzt, wobei dasselbe Volumen wie für die Einspritzung der Kalibrierlösungen verwendet wird, und die mittlere Peakhöhe (-fläche) der Halofuginonpeaks wird ermittelt.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Aus der mittleren Peakhöhe (-fläche) der Halofuginonpeaks der Probenlösung wird anhand der Kalibrationskurve (Nummer 5.4.2) die Konzentration der Probenlösung in μg/ml bestimmt. Der Halofuginongehalt w (in mg/kg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet: wc × 10m wobei:

c =:: Halofuginonkonzentration der Probenlösung in μg/ml,
m =:: Probeneinwaage in g.

7.
Überprüfung der Ergebnisse

7.1.
Identität

Die Identität des Analyten kann durch Co-Chromatografie oder mithilfe eines Diodenarray-Detektors bestätigt werden, wobei die Spektren der Probenlösung und der Kalibrierlösung (Nummer 3.6.2), die 6,0 μg/ml enthält, verglichen werden.

7.1.1.
Co-Chromatografie

Eine Probenlösung wird mit einer geeigneten Menge einer Kalibrierlösung (Nummer 3.6.2) versetzt. Die Menge des zugesetzten Halofuginons muss dem erwarteten Halofuginongehalt der Probenlösung entsprechen. Unter Berücksichtigung der zugesetzten Menge und der Verdünnung des Extrakts darf nur die Höhe des Halofuginonpeaks vergrößert sein. Die Peakbreite in halber Höhe darf höchstens ± 10 % von der des Peaks der nicht angereicherten Probenlösung abweichen.

7.1.2.
Diodenarray-Detektion

Die Ergebnisse werden gemäß den nachstehenden Kriterien beurteilt:

a): Die Wellenlängen bei maximaler Absorption des Proben- und des Standardspektrums an der Peakspitze des Chromatogramms müssen innerhalb eines Bereichs übereinstimmen, der durch das Auflösungsvermögen des Detektionssystems bestimmt wird. Für die Diodenarray-Detektion beträgt dieser Bereich in der Regel ± 2 nm.
b): Zwischen 225 und 300 nm dürfen sich das Proben- und das Standardspektrum an den Peakspitzen des Chromatogramms in den Bereichen zwischen 10 und 100 % relativer Absorption nicht unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichung zwischen den beiden Spektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 % der Absorption des Standardanalyten beträgt.
c): Zwischen 225 und 300 nm dürfen sich die Spektren des Probenextrakts im Anstieg, an der Spitze und im Abstieg des Probenpeaks in den Bereichen zwischen 10 und 100 % relativer Absorption nicht unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichung der Spektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 % der Absorption des Spektrums am Peakmaximum beträgt.

Wird eines dieser Kriterien nicht erfüllt, gilt das Vorhandensein des Analyten als nicht bestätigt.

7.2.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf bei einem Halofuginongehalt von bis zu 3 mg/kg 0,5 mg/kg nicht überschreiten.

7.3.
Wiederfindungsrate

Für eine angereicherte Blindprobe muss die Wiederfindung mindestens 80 % betragen.

8.
Ergebnisse eines Ringversuchs

Es wurde ein Ringversuch⁽⁸⁾ durchgeführt, bei dem 3 Proben von 8 Laboratorien untersucht wurden. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst:

Ergebnisse

NN=: nicht nachweisbar

S_R=: Standardabweichung der Vergleichbarkeit

VK_R=: Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit (%)

Wiederfindung=: Wiederfindung (%)

	Probe A (Blindprobe) nach Erhalt	Probe B (Mehl)		Probe C (Pellets)
		Nach Erhalt	Nach 2 Monaten	Nach Erhalt	Nach 2 Monaten
Mittelwert [mg/kg]	NN	2,80	2,42	2,89	2,45
S_R [mg/kg]	—	0,45	0,43	0,40	0,42
VK_R [%]	—	16	18	14	17
Wiederfindung [%]		86	74	88	75

E.
BESTIMMUNG DES ROBENIDINGEHALTS

1,3-bis[(4-Chlorobenzyliden)amino]-guanidin-hydrochlorid

Der Robenidingehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17299 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Screening und Bestimmung von zugelassenen Kokzidiostatika in Konzentrationen von Zusatzstoffen und deren Verschleppungen im Bereich von 1 % und 3 % sowie von nicht registrierten Kokzidiostatika und von einem Antibiotikum in Konzentrationen unterhalb von Zusatzstoffen in Mischfuttermitteln mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Nachweis (LC-MS/MS)” oder
—: durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektors, wie im Folgenden unter den Nummern 1 bis 8 beschrieben.

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Robenidingehalts von Futtermitteln. Die Bestimmungsgrenze beträgt 5 mg/kg.

2.
Prinzip

Die Probe wird mit angesäuertem Methanol extrahiert. Der Extrakt wird getrocknet und ein aliquoter Teil zum Clean-up auf eine Aluminiumoxidsäule gegeben. Robenidin wird mit Methanol von der Säule eluiert, eingeengt und mit der mobilen Phase auf ein geeignetes Volumen gebracht. Der Robenidingehalt wird mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektors bestimmt.

3.
Reagenzien

3.1.: Methanol

3.2.: Angesäuertes Methanol
In einen 500-ml-Messkolben werden 4,0 ml Salzsäure (ρ20 = 1,18 g/ml) überführt. Es wird mit Methanol (Nummer 3.1) zur Marke aufgefüllt und durchmischt. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.3.: Acetonitril, HPLC-Qualität.

3.4.: Molekularsieb
Typ 3A, 8 bis 12 Mesh (Korngröße 1,6 bis 2,5 mm, kristallines Aluminiumsilicat, Porendurchmesser 0,3 mm).

3.5.: Aluminiumoxid, sauer, Aktivitätsstufe I, für die Säulenchromatografie
100 g Aluminiumoxid werden in ein geeignetes Gefäß gegeben und mit 2,0 ml Wasser versetzt. Das Gefäß wird verschlossen und etwa 20 min geschüttelt. Das Aluminiumoxid ist in einem gut verschlossenen Behälter aufzubewahren.

3.6.: Kaliumdihydrogenphosphatlösung, c = 0,025 mol/l
In einem 1000-ml-Messkolben werden 3,40 g Kaliumdihydrogenphosphat in Wasser (HPLC-Qualität) gelöst. Es wird zur Marke aufgefüllt und durchmischt.

3.7.: Dinatriumhydrogenphosphatlösung, c = 0,025 mol/l
In einem 1 l-Messkolben werden 3,55 g wasserfreies Dinatriumhydrogenphosphat (oder 4,45 g Dihydrat oder 8,95 g Dodecahydrat) in Wasser (HPLC-Qualität) gelöst. Es wird zur Marke aufgefüllt und durchmischt.

3.8.

Mobile Phase für die HPLC

Folgende Reagenzien werden gemischt:

650 ml Acetonitril (Nummer 3.3),

250 ml Wasser (HPLC-Qualität),

50 ml Kaliumdihydrogenphosphatlösung (Nummer 3.6),

50 ml Dinatriumhydrogenphosphatlösung (Nummer 3.7).

Die Lösung wird durch einen 0,22-μm-Filter (Nummer 4.6) filtriert und entgast (z. B. durch 10-minütige Ultraschallbehandlung).

3.9.: Standardsubstanz
Robenidin, 1,3-bis[(4-Chlorbenzyliden)amino]-guanidin-hydrochlorid, rein

3.9.1.: Robenidin-Standard-Stammlösung, 300 μg/ml
Von der Robenidin-Standardsubstanz (Nummer 3.9) werden 30 mg auf 0,1 mg genau eingewogen, in einem 100-ml-Messkolben in angesäuertem Methanol (Nummer 3.2) gelöst und mit demselben Lösungsmittel zur Marke aufgefüllt und durchmischt. Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhüllt und im Dunkeln aufbewahrt.

3.9.2.: Robenidin-Standardlösung, 12 μg/ml
Von der Standard-Stammlösung (Nummer 3.9.1) werden 10,0 ml in einen 250-ml-Messkolben überführt. Es wird mit der mobilen Phase (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt und durchmischt. Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhüllt und im Dunkeln aufbewahrt.

3.9.3.: Kalibrierlösungen
Von der Robenidin-Standardlösung (Nummer 3.9.2) werden 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 bzw. 25,0 ml jeweils in einen 50-ml-Messkolben überführt. Es wird mit der mobilen Phase (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt und durchmischt. Diese Lösungen enthalten Robenidin in Konzentrationen von 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 bzw. 6,0 μg/ml. Die Lösungen müssen vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.10.: Wasser, HPLC-Qualität

4.
Geräte

4.1.: Glassäule
Braunglas mit Absperrhahn und Reservoir mit einem Fassungsvermögen von ca. 150 ml, Innendurchmesser 10 bis 15 mm, Länge 250 mm.

4.2.: Mechanischer Schüttler oder Magnetrührer.

4.3.: Rotationsfilmverdampfer.

4.4.: HPLC-Einrichtung mit UV-Detektor mit variabler Wellenlängeneinstellung oder Diodenarray-Detektor mit einem Messbereich von 250 bis 400 nm

4.4.1.: HPLC-Trennsäule: 300 mm × 4 mm, C₁₈, 10 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule.

4.5.: Glasfaser-Filterpapier, z. B. Whatman GF/A oder gleichwertig.

4.6.: Membranfilter, 0,22 μm Porengröße.

4.7.: Membranfilter, 0,45 μm Porengröße.

5.
Verfahren

Anmerkung:: Robenidin ist lichtempfindlich. Bei allen Verfahrensschritten sind Braunglasgeräte zu verwenden.

5.1.
Allgemeines

5.1.1.: Zur Prüfung, dass weder Robenidin noch Störsubstanzen vorhanden sind, ist eine Blindprobe zu untersuchen.

5.1.2.

Die Wiederfindungsrate wird ermittelt, indem eine Blindprobe (Nummer 5.1.1) untersucht wird, die mit Robenidin angereichert wurde. Die zugesetzte Menge an Robenidin sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen. Zur Anreicherung auf einen Gehalt von 60 mg/kg werden 3,0 ml der Standard-Stammlösung (Nummer 3.9.1) in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben gegeben. Die Lösung wird in einem Stickstoffstrom auf ca. 0,5 ml eingeengt. Dann werden 15 g der Blindprobe zugegeben. Es wird gemischt und 10 min stehen gelassen, bevor mit der Extraktion (Nummer 5.2) fortgefahren wird.

Anmerkung:: Für den Zweck dieser Methode muss die Blindprobe ähnlich zusammengesetzt sein wie die zu untersuchende Probe, und Robenidin darf nicht nachweisbar sein.

5.2.
Extraktion

Von der vorbereiteten Probe werden 15 g auf 0,01 g genau in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingewogen, mit 100,0 ml angesäuertem Methanol (Nummer 3.2) versetzt und nach Verschließen des Kolbens 1 h auf dem Schüttler (Nummer 4.2) geschüttelt. Die Lösung wird über Glasfaserfilterpapier (Nummer 4.5) filtriert und das gesamte Filtrat in einem 150-ml-Erlenmeyerkolben aufgefangen. Es werden 7,5 g Molekularsieb (Nummer 3.4) zugegeben, und nach Verschließen des Kolbens wird 5 min geschüttelt. Anschließend wird sofort durch ein Glasfaserfilterpapier filtriert. Diese Lösung wird für die Reinigung (Nummer 5.3) aufbewahrt.

5.3.
Reinigung

5.3.1.
Vorbereitung der Aluminiumoxid-Säule

In das untere Ende der Glassäule (Nummer 4.1) wird ein Glaswattebausch eingebracht, der mit einem Glasstab zusammengedrückt wird. Von dem vorbereiteten Aluminiumoxid (Nummer 3.5) werden 11,0 g auf die Säule aufgebracht. Dabei ist darauf zu achten, dass der Kontakt mit der Luft so gering wie möglich gehalten wird. Durch leichtes Klopfen an das untere Ende der befüllten Säule wird das Aluminiumoxid verdichtet.

5.3.2.
Reinigung der Probe

Von dem Probenextrakt (Nummer 5.2) werden 5,0 ml mit einer Pipette auf die Säule gegeben, wobei die Pipettenspitze die Säulenwand berühren soll. Nach Absorption der Lösung durch das Aluminiumoxid wird das Robenidin mit 100 ml Methanol (Nummer 3.1) bei einer Flussrate von 2-3 ml/min von der Säule eluiert und das Eluat in einem 250-ml-Rundkolben aufgefangen. Die Methanollösung wird am Rotationsverdampfer (Nummer 4.3) bei 40 °C und unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit 3 bis 4 ml der mobilen Phase (Nummer 3.8) erneut gelöst und quantitativ in einen 10-ml-Messkolben überführt. Der Kolben wird mehrmals mit je 1 bis 2 ml der mobilen Phase gespült, und die Spüllösungen werden in den Messkolben gegeben. Es wird mit der mobilen Phase zur Marke aufgefüllt und gemischt. Ein aliquoter Teil wird durch einen 0,45-μm-Membranfilter (Nummer 4.7) filtriert. Diese Lösung wird für die HPLC-Bestimmung (Nummer 5.4) aufbewahrt.

5.4.
HPLC-Bestimmung

5.4.1.
Parameter

Die folgenden Angaben sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren

HPLC-Trennsäule (Nummer 4.4.1),

mobile Phase für die HPLC (Nummer 3.8),

Durchflussrate: 1,5 bis 2 ml/min,

Detektionswellenlänge: 317 nm

Einspritzvolumen: 20 bis 50 μl.

Die Stabilität des chromatografischen Systems wird überprüft, indem die Kalibrierlösung (Nummer 3.9.3), die 3,6 μg/ml enthält, mehrmals eingespritzt wird, bis konstante Peakhöhen (-flächen) und Retentionszeiten erreicht sind.

5.4.2.
Erstellung der Kalibrationskurve

Jede Kalibrierlösung (Nummer 3.9.3) wird mehrmals eingespritzt, und die Peakhöhen (-flächen) für die einzelnen Konzentrationen werden gemessen. Es wird eine Kalibrationskurve erstellt, indem die mittleren Peakhöhen (-flächen) der Kalibrierlösungen auf der Ordinate und die dazugehörigen Konzentrationen in μg/ml auf der Abszisse aufgetragen werden.

5.4.3.
Bestimmung der Probenlösung

6.
Berechnung der Ergebnisse

Aus der mittleren Höhe (Fläche) der Robenidinpeaks der Probenlösung wird anhand der Kalibrationskurve (Nummer 5.4.2) die Konzentration der Probenlösung in μg/ml bestimmt. Der Robenidingehalt w (in mg/kg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet: wc × 200m wobei:

c=: Robenidinkonzentration der Probenlösung in μg/ml,
m=: Probeneinwaage in g.

7.
Überprüfung der Ergebnisse

7.1.
Identität

7.1.1.
Co-Chromatografie

Eine Probenlösung wird mit einer geeigneten Menge Kalibrierlösung (Nummer 3.9.3) versetzt. Die Menge des zugesetzten Robenidins muss dem erwarteten Robenidingehalt der Probenlösung entsprechen. Unter Berücksichtigung der zugesetzten Menge und der Verdünnung des Extrakts darf nur die Höhe des Robenidinpeaks vergrößert sein. Die Peakbreite in halber Höhe darf höchstens ± 10 % von der des Peaks der nicht angereicherten Probenlösung abweichen.

7.1.2.
Diodenarray-Detektion

Die Ergebnisse werden gemäß den nachstehenden Kriterien beurteilt:

a): Die Wellenlängen bei maximaler Absorption des Proben- und des Standardspektrums an der Peakspitze des Chromatogramms müssen innerhalb eines Bereichs übereinstimmen, der durch das Auflösungsvermögen des Detektionssystems bestimmt wird. Für die Diodenarray-Detektion beträgt dieser Bereich in der Regel ± 2 nm.
b): Zwischen 250 und 400 nm dürfen sich das Proben- und das Standardspektrum an den Peakspitzen des Chromatogramms in den Bereichen zwischen 10 und 100 % relativer Absorption nicht unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichung zwischen den beiden Spektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 % der Absorption des Standardanalyten beträgt.
c): Zwischen 250 und 400 nm dürfen sich die Spektren des Probenextrakts im Anstieg, an der Spitze und im Abstieg des Probenpeaks in den Bereichen zwischen 10 und 100 % relativer Absorption nicht unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichung der Spektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 % der Absorption des Spektrums am Peakmaximum beträgt.

Wird eines dieser Kriterien nicht erfüllt, gilt das Vorhandensein des Analyten als nicht bestätigt.

7.2.
Wiederholbarkeit

Bei einem Robenidingehalt von mehr als 15 mg/kg darf die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe 10 % des höheren Werts nicht überschreiten.

7.3.
Wiederfindungsrate

Für eine angereicherte Blindprobe muss die Wiederfindungsrate mindestens 85 % betragen.

8.
Ergebnisse eines Ringversuchs

Bei einem EU-Ringversuch wurden 4 Proben von Geflügel- und Kaninchenfutter in Form von Mehl oder Pellets von 12 Laboratorien analysiert. Jede Probe wurde doppelt analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst.

s_r=: Standardabweichung der Wiederholbarkeit

VK_r=: Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit, %

S_R=: Standardabweichung der Vergleichbarkeit

VK_R=: Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit, %

	Geflügelfutter		Kaninchenfutter
	Mehl	Pellets	Mehl	Pellets
Mittelwert [mg/kg]	27,00	27,99	43,6	40,1
s_r [mg/kg]	1,46	1,26	1,44	1,66
VK_r [%]	5,4	4,5	3,3	4,1
S_R [mg/kg]	4,36	3,36	4,61	3,91
VK_R [%]	16,1	12,0	10,6	9,7
Wiederfindung [%]	90,0	93,3	87,2	80,2

F.
BESTIMMUNG DES DICLAZURILGEHALTS

(±)-4-Chlorphenyl[2,6 dichlor-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)phenyl]acetonitrile.

Der Diclazurilgehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17299 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Screening und Bestimmung von zugelassenen Kokzidiostatika in Konzentrationen von Zusatzstoffen und deren Verschleppungen im Bereich von 1 % und 3 % sowie von nicht registrierten Kokzidiostatika und von einem Antibiotikum in Konzentrationen unterhalb von Zusatzstoffen in Mischfuttermitteln mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Nachweis (LC-MS/MS)” oder
—: mittels ternärer Gradienten-Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) unter Verwendung eines UV-Detektors, wie im Folgenden unter den Nummern 1 bis 9 beschrieben.

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Diclazurilgehalts von Futtermitteln und Vormischungen.⁽⁹⁾ Die Nachweisgrenze beträgt 0,1 mg/kg, die Bestimmungsgrenze 0,5 mg/kg. Niedrigere Bestimmungsgrenzen können zwar erreicht werden, aber dies ist vom Nutzer zu validieren.

2.
Prinzip

Nach Hinzufügen eines internen Standards wird die Probe mit angesäuertem Methanol extrahiert. Bei Futtermitteln wird ein aliquoter Teil des Extrakts mit einer C₁₈-Festphasen-Extraktionskartusche gereinigt. Diclazuril wird aus der Kartusche mit einem Gemisch aus angesäuertem Methanol und Wasser eluiert. Nach dem Einengen wird der Rückstand in DMF/Wasser gelöst. Bei Vormischungen wird der Extrakt eingeengt und der Rückstand in DMF/Wasser gelöst. Der Diclazurilgehalt wird mittels ternärer Gradienten-Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) über eine Umkehrphase unter Verwendung eines UV-Detektors bestimmt.

3.
Reagenzien

3.1.: Wasser, HPLC-Qualität.

3.2.: Ammoniumacetat.

3.3.: Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (TBHS).

3.4.: Acetonitril, HPLC-Qualität.

3.5.: Methanol, HPLC-Qualität.

3.6.: N,N-Dimethylformamid (DMF).

3.7.: Salzsäure, ρ₂₀ = 1,19 g/ml.

3.8.: Standardsubstanz: Diclazuril: 2,6-Dichlor-alpha-(4-chlorophenyl)-4-(4,5-dihydro–3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-(3H)-yl)benzacetonitril, rein.

3.8.1.: Diclazuril-Standard-Stammlösung, 500 μg/ml
Von der Diclazuril-Standardsubstanz (Nummer 3.8) werden 25 mg auf 0,1 mg genau in einen 50-ml-Messkolben eingewogen und in DMF (Nummer 3.6) gelöst; es wird mit DMF (Nummer 3.6) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhüllt (oder ein Messkolben aus braunem Glas verwendet) und im Kühlschrank aufbewahrt. Bei einer Temperatur von ≤ 4 °C ist diese Lösung 1 Monat lang haltbar.⁽¹⁰⁾

3.8.2.: Diclazuril-Standardlösung, 50 μg/ml
Von der Standard-Stammlösung (Nummer 3.8.1) werden 5,00 ml in einen 50-ml-Messkolben überführt; es wird mit DMF (Nummer 3.6) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhüllt (oder ein Messkolben aus braunem Glas verwendet) und im Kühlschrank aufbewahrt. Bei einer Temperatur von ≤ 4 °C ist diese Lösung 1 Monat lang haltbar.

3.9.: Interne Standardsubstanz: 2,6 Dichloro-α-(4-chlorophenyl)-4-(4,5-dihydro–3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-(3H)-yl)-α-methylbenzacetonitril (Methyldiclazuril)

3.9.1.: Interne Standardlösung, 500 μg/ml
Von der internen Standardsubstanz (Nummer 3.9) werden 25 mg auf 0,1 mg genau in einen 50-ml-Messkolben eingewogen und in DMF (Nummer 3.6) gelöst; es wird mit DMF (Nummer 3.6) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhüllt (oder ein Messkolben aus braunem Glas verwendet) und im Kühlschrank aufbewahrt. Bei einer Temperatur von ≤ 4 °C ist diese Lösung 1 Monat lang haltbar.

3.9.2.: Interne Standardlösung, 50 μg/ml
Von der internen Standardlösung (Nummer 3.9.1) werden 5,00 ml in einen 50-ml-Messkolben überführt; es wird mit DMF (Nummer 3.6) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhüllt (oder ein Messkolben aus braunem Glas verwendet) und im Kühlschrank aufbewahrt. Bei einer Temperatur von ≤ 4 °C ist diese Lösung 1 Monat lang haltbar.

3.9.3.: Interne Standardlösung für Vormischungen, p/1000 mg/ml (p = Diclazuril-Sollgehalt in der Vormischung in mg/kg)
Von der internen Standardsubstanz werden p/10 mg auf 0,1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen und mittels Ultraschallbad (Nummer 4.7) in DMF (Nummer 3.6) gelöst; es wird mit DMF (Nummer 3.6) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Der Messkolben wird mit Aluminiumfolie umhüllt (oder ein Messkolben aus braunem Glas verwendet) und im Kühlschrank aufbewahrt. Bei einer Temperatur von ≤ 4 °C ist diese Lösung 1 Monat lang haltbar.

3.10.: Kalibrierlösungen

3.10.1.: Kalibrierlösung, 1 μg/ml
In einen 50-ml-Messkolben werden 1,00 ml Diclazuril-Standardlösung (Nummer 3.8.2) und 2,00 ml interne Standardlösung (Nummer 3.9.2) pipettiert. Es werden 17 ml DMF (Nummer 3.6) hinzugefügt; anschließend wird mit Wasser (Nummer 3.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.10.2.: Kalibrierlösung, 2 μg/ml
In einen 50-ml-Messkolben werden 2,00 ml Diclazuril-Standardlösung (Nummer 3.8.2) und 2,00 ml interne Standardlösung (Nummer 3.9.2) pipettiert. Es werden 16 ml DMF (Nummer 3.6) hinzugefügt; anschließend wird mit Wasser (Nummer 3.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.10.3.: Kalibrierlösung, 3 μg/ml (Diclazuril)
In einen 50-ml-Messkolben werden 3,00 ml Diclazuril-Standardlösung (Nummer 3.8.2) und 2,00 ml interne Standardlösung (Nummer 3.9.2) pipettiert. Es werden 15 ml DMF (Nummer 3.6) hinzugefügt; anschließend wird mit Wasser (Nummer 3.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.10.4.: Kalibrierlösung, 4 μg/ml (Diclazuril)
In einen 50-ml-Messkolben werden 4,00 ml Diclazuril-Standardlösung (Nummer 3.8.2) und 2,00 ml interne Standardlösung (Nummer 3.9.2) pipettiert. Es werden 14 ml DMF (Nummer 3.6) hinzugefügt; anschließend wird mit Wasser (Nummer 3.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.10.5.

Kalibrierlösung, 5 μg/ml (Diclazuril)

In einen 50-ml-Messkolben werden 5,00 ml Diclazuril-Standardlösung (Nummer 3.8.2) und 2,00 ml interne Standardlösung (Nummer 3.9.2) pipettiert. Es werden 13 ml DMF (Nummer 3.6) hinzugefügt; anschließend wird mit Wasser (Nummer 3.1) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

Anmerkung:: Die Kalibrierlösungen (Nummer 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 und 3.10.5) decken Diclazurilkonzentrationen von 0,5 mg/kg bis 2,5 mg/kg in Futtermitteln ab, sofern das aktuelle Protokoll verwendet wird.

3.11.: C₁₈-Festphasen-Extraktionskartusche, z. B. Mega Bond Elut, Größe: 20 cc, Sorptionsmenge: 5000 mg (Vorkonditionierung gemäß Lieferantenleitlinien).

3.12.: Extraktionslösung: angesäuertes Methanol
5,0 ml Salzsäure (Nummer 3.7) werden in 1000 ml Methanol (Nummer 3.5) pipettiert und gemischt.

3.13.: Mobile Phase für die HPLC:

3.13.1.: Elutionsmittel A: Ammoniumacetat-Tetrabutylammoniumhydrogensulfat-Lösung,
5 g Ammoniumacetat (Nummer 3.2) und 3,4 g TBHS (Nummer 3.3) werden in 1000 ml Wasser (Nummer 3.1) gelöst und gemischt.

3.13.2.: Elutionsmittel B: Acetonitril (Nummer 3.4).

3.13.3.: Elutionsmittel C: Methanol (Nummer 3.5).

4.
Geräte

4.1.: Mechanischer Schüttler.

4.2.: HPLC-Einrichtung für ternären Gradienten

4.2.1.: HPLC-Trennsäule, 3 μm Korngröße, 100 mm × 4,6 mm, z. B. Hypersil ODS, oder vergleichbare Säule.

4.2.2.: UV-Detektor mit variabler Wellenlängeneinstellung oder Diodenarray-Detektor.

4.3.: Rotationsfilmverdampfer.

4.4.: Membranfilter (z. B. aus chemisch resistentem Nylon), 0,45 μm

4.5.: Einwegspritze, 5 ml

4.6.: Vakuumeinrichtung.

4.7.: Ultraschallbad.

5.
Verfahren

5.1.
Allgemeines

5.1.1.
Blindprobe

Zur Prüfung, dass weder Diclazuril noch Störsubstanzen vorhanden sind, ist eine Blindprobe zu untersuchen. Die Blindprobe muss ähnlich zusammengesetzt sein wie die zu untersuchende Probe, und Diclazuril oder Störsubstanzen dürfen nicht nachweisbar sein.

5.1.2.
Wiederfindungstest

Die Wiederfindungsrate wird ermittelt, indem eine Blindprobe untersucht wird, die mit Diclazuril angereichert wurde. Die zugesetzte Menge sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen. Zur Anreicherung auf einen Gehalt von 1 mg/kg werden 0,1 ml der Standard-Stammlösung (Nummer 3.8.1) zu 50 g der Blindprobe gegeben. Es wird gründlich gemischt, 10 min stehen gelassen und nochmals mehrfach gemischt, bevor mit der Extraktion (Nummer 5.2) fortgefahren wird. Ist eine der zu untersuchenden Probe ähnliche Blindprobe nicht verfügbar (siehe 5.1.1), so kann ein Wiederfindungstest mithilfe des Standard-Additionsverfahrens durchgeführt werden. In diesem Fall wird die zu untersuchende Probe mit einer Diclazurilmenge angereichert, die der bereits in der Probe vorhandenen Menge entspricht. Diese Probe wird zusammen mit der nicht angereicherten Probe untersucht, und die Wiederfindungsrate kann durch Subtraktion ermittelt werden.

5.2.
Extraktion

5.2.1.
Mischfuttermittel

Von der Probe werden 50 g auf 0,01 g genau eingewogen und in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben überführt. Es werden 1,00 ml der internen Standardlösung (Nummer 3.9.2) und 200 ml Extraktionslösung (Nummer 3.12) hinzugefügt. Anschließend wird der Kolben verschlossen. Die Mischung wird über Nacht auf dem Schüttler (Nummer 4.1) geschüttelt und anschließend 10 min stehen gelassen. Ein aliquoter Teil von 20 ml der überstehenden Lösung wird in einen geeigneten Glasbehälter überführt und mit 20 ml Wasser (Nummer 3.1) verdünnt. Diese Lösung wird auf eine Extraktionskartusche (Nummer 3.11) gegeben und mittels Vakuum (Nummer 4.6) hindurch gesaugt. Die Kartusche wird mit 25 ml einer Mischung aus Extraktionslösung (Nummer 3.12) und Wasser (Nummer 3.1), 65 + 35 (V+V), ausgewaschen. Die gesammelten Fraktionen werden verworfen, und der Wirkstoff und der interne Standard werden mit 25 ml einer Mischung aus Extraktionslösung (Nummer 3.12) und Wasser, 80 + 20 (V+V), eluiert. Diese Fraktion wird mithilfe eines Rotationsverdampfers (Nummer 4.3) bei 60 °C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 1,0 ml DMF (Nummer 3.6) gelöst; es werden 1,5 ml Wasser (Nummer 3.1) hinzugefügt, gemischt, durch einen Membranfilter (Nummer 4.4) filtriert und auf eine Einwegspritze (Nummer 4.5) gezogen. Anschließend wird die HPLC-Bestimmung (Nummer 5.3) durchgeführt.

5.2.2.
Vormischungen

Von der Probe wird 1 g auf 0,001 g genau eingewogen und in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben überführt. Es werden 1,00 ml interne Standardlösung (Nummer 3.9.3) und 200 ml Extraktionslösung (Nummer 3.12) hinzugefügt, und der Kolben wird verschlossen. Die Mischung wird über Nacht auf dem Schüttler (Nummer 4.1) geschüttelt und anschließend 10 min stehen gelassen. Ein 10000/p-ml-Aliquot (p = Diclazuril-Sollgehalt in der Vormischung in mg/kg) der überstehenden Lösung wird in einen Rundkolben geeigneter Größe überführt. Es wird mithilfe eines Rotationsverdampfers (Nummer 4.3) bei vermindertem Druck und 60 °C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 10,0 ml DMF (Nummer 3.6) gelöst; es werden 15,0 ml Wasser (Nummer 3.1) hinzugefügt und gemischt. Anschließend wird die HPLC-Bestimmung (Nummer 5.3) durchgeführt.

5.3.
HPLC-Bestimmung

5.3.1.
Parameter

Die folgenden Angaben sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren oder besseren Ergebnissen führen.

—

HPLC-Trennsäule (Nummer 4.2.1): 100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, 3 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule

—

Mobile Phase:

—: Elutionsmittel A (Nummer 3.13.1): wässrige Lösung von Ammoniumacetat und Tetrabutylammonium-Hydrogensulfat
—: Elutionsmittel B (Nummer 3.13.2): Acetonitril
—: Elutionsmittel C (Nummer 3.13.3): Methanol

—

Elutionsmodus: — linearer Gradient

—: Anfangsbedingungen: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V+V+V)
—: nach 10 min Gradientenelution 30 min lang: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V+V+V)
—: Mit Elutionsmittel B 10 min spülen.

—

Durchflussrate: 1,5 bis 2 ml/min

—

Einspritzvolumen: 20 μl

—

Detektionswellenlänge: 280 nm

Die Stabilität des chromatografischen Systems wird überprüft, indem die Kalibrierlösung (Nummer 3.10.2), die 2 μg/ml Diclazuril und interner Standard enthält, mehrmals eingespritzt wird, bis konstante Peakhöhen (-flächen) und Retentionszeiten erreicht sind.

5.3.2.
Chromatografische Analyse der Kalibrierlösungen

Es werden zweimal je 20 μl der Kalibrierlösungen (Nummer 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 und 3.10.5) eingespritzt, für Diclazuril und den internem Standard werden die Peakhöhen ermittelt und integriert, dann wird die Kalibrierkurve anhand des Verhältnisses der mittleren Peakhöhe oder -fläche von Diclazuril zur mittleren Peakhöhe oder -fläche des internen Standards gegenüber der Diclazurilkonzentration in den Kalibrierlösungen (μg/ml) aufgezeichnet.

5.3.3.
Chromatografische Analyse der Probenlösungen

Von der Probenlösung (Nummer 5.2.1 oder 5.2.2) werden zweimal 20 μl eingespritzt, und für Diclazuril und den internen Standard wird die mittlere Peakhöhe (-fläche) bestimmt.

6.
Berechnung der Ergebnisse

6.1.
Mischfuttermittel

Der Diclazurilgehalt w (in mg/kg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet: wHeightd,sHeighti,s– ba×10Vm oder wAread,sAreai,s– ba×10Vm wobei:

—: Höhe (d,s) = Peakhöhe von Diclazuril in der Probenlösung (Nummer 5.2.1)
—: Fläche (d,s) = Peakfläche von Diclazuril in der Probenlösung (Nummer 5.2.1)
—: Höhe (i,s) = Peakhöhe des internen Standards in der Probenlösung (Nummer 5.2.1)
—: Fläche (i,s) = Peakfläche des internen Standards in der Probenlösung (Nummer 5.2.1)
—: b = Schnittpunkt der mit den Kalibrierlösungen (Nummer 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 und 3.10.5) gemäß Nummer 5.3.2 aufgetragenen Kalibrierkurve.
—: a = Steigung der mit den Kalibrierlösungen (Nummer 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 und 3.10.5) gemäß Nummer 5.3.2 aufgetragenen Kalibrierkurve.
—: m = Probeneinwaage in g
—: V = endgültiges Volumen in ml des Probenextrakts nach erneuter Lösung gemäß Nummer 5.2.1 (d. h. 2,5 ml).

6.2.
Vormischungen

Der Diclazurilgehalt w (in mg/kg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet: wHeightd,sHeighti,s– ba×0.02Vm × p oder wAread,sAreai,s– ba×0.02Vm × p wobei:

—: Höhe (d,s) = Peakhöhe von Diclazuril in der Probenlösung (Nummer 5.2.2)
—: Fläche (d,s) = Peakfläche von Diclazuril in der Probenlösung (Nummer 5.2.2)
—: Höhe (i,s) = Peakhöhe des internen Standards in der Probenlösung (Nummer 5.2.2)
—: Fläche (i,s) = Peakfläche des internen Standards in der Probenlösung (Nummer 5.2.2)
—: b = Schnittpunkt der mit den Kalibrierlösungen (Nummer 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 und 3.10.5) gemäß Nummer 5.3.2 aufgetragenen Kalibrierkurve
—: a = Steigung der mit den Kalibrierlösungen (Nummer 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 und 3.10.5) gemäß Nummer 5.3.2 aufgetragenen Kalibrierkurve.
—: m = Probeneinwaage in g
—: V = endgültiges Volumen in ml des Probenextrakts nach erneuter Lösung gemäß Nummer 5.2.2 (d. h. 25 ml).
—: p = Diclazuril-Sollgehalt in der Vormischung in mg/kg.

7.
Überprüfung der Ergebnisse

7.1.
Identität

Die Identität des Analyten kann durch Co-Chromatografie oder mithilfe eines Diodenarray-Detektors bestätigt werden, wobei die Spektren der Probenlösung (Nummer 5.2.1 oder 5.2.2) und der Kalibrierlösung (Nummer 3.10.2) verglichen werden.

7.1.1.
Co-Chromatografie

Eine nach Nummer 5.2.1 oder 5.2.2 hergestellte Probenlösung wird mit einer geeigneten Menge Kalibrierlösung (Nummer 3.10.2) angereichert. Die Menge des zugesetzten Diclazurils muss dem erwarteten Diclazurilgehalt der Probenlösung entsprechen. Unter Berücksichtigung der zugesetzten Menge und der Verdünnung des Extrakts darf nur die Höhe des Diclazurilpeaks und des Peaks des internen Standards vergrößert sein. Die Peakbreite in halber Höhe darf höchstens ± 10 % von der des ursprünglichen Diclazurilpeaks oder Standardpeaks des nicht angereicherten Probenextrakts abweichen.

7.1.2.
Diodenarray-Detektion

Die Ergebnisse werden gemäß den nachstehenden Kriterien beurteilt:

a): Die Wellenlängen bei maximaler Absorption des Proben- und des Standardspektrums an der Peakspitze des Chromatogramms müssen innerhalb eines Bereichs übereinstimmen, der durch das Auflösungsvermögen des Detektionssystems bestimmt wird. Für die Diodenarray-Detektion beträgt dieser Bereich in der Regel ± 2 nm.
b): Zwischen 230 und 320 nm dürfen sich das Proben- und das Standardspektrum an den Peakspitzen des Chromatogramms in den Bereichen zwischen 10 und 100 % relativer Absorption nicht unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichung zwischen den beiden Spektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 % der Absorption des Standardanalyten beträgt.
c): Zwischen 230 und 320 nm dürfen sich die Spektren des Probenextrakts im Anstieg, an der Spitze und im Abstieg des Probenpeaks in den Bereichen zwischen 10 und 100 % relativer Absorption nicht unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichung zwischen den Spektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 % der Absorption des Spektrums am Peakmaximum beträgt.

Wird eines dieser Kriterien nicht erfüllt, gilt das Vorhandensein des Analyten als nicht bestätigt.

7.2.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier unabhängiger Messungen an zwei Teilproben darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—: 30 % relativ zum höheren Wert bei Diclazurilgehalten zwischen 0,5 und 2,5 mg/kg,
—: 0,75 mg/kg bei Diclazurilgehalten zwischen 2,5 mg/kg und 5 mg/kg,
—: 15 % relativ zum höheren Wert bei Diclazurilgehalten von mehr als 5 mg/kg.

7.3.
Wiederfindungsrate

Bei einer angereicherten (Blind-)Probe muss die Wiederfindungsrate mindestens 80 % betragen.

8.
Ergebnisse eines Ringversuchs

Es wurden zwei Ringversuche durchgeführt. Im ersten, 1994 von einer anderen Gruppe von Laboratorien durchgeführten Ringversuch handelte es sich bei den untersuchten Proben um zwei Vormischungen (O 100, A 100) und drei Proben von Ergänzungsfuttermitteln für Geflügel (L1, Z1, K1). Eine der Proben aus Vormischungen war mit einer organischen Matrix (O 100) und die andere mit einer anorganischen Matrix (A 100) gemischt. Der theoretische Diclazurilgehalt liegt bei 100 mg/kg. Die Laboratorien wurden beauftragt, jede der Proben 1- oder 2-mal zu untersuchen. (Nähere Informationen zu diesem ersten Ringversuch sind dem Journal of AOAC International, Band 77, Nr. 6, 1994, S. 1359-1361, zu entnehmen.) Im zweiten Ringversuch wurden drei Mischfuttermittel für Geflügel, eines mit Diclazuril in einer Konzentration von 0,9 mg/kg (MAT 1), eines mit 1,5 mg/kg (MAT 2) und eine Blindprobe (MAT 3), analysiert. (Nähere Informationen zu diesem zweiten Ringversuch sind dem Technischen Bericht der JRC (2016) und dem Journal of AOAC International, Band 102, Nr. 2, 2019, S. 646-652, zu entnehmen.) Die Ergebnisse der beiden Ringstudien sind der nachstehenden Tabelle zu entnehmen:

L =: Anzahl der Laboratorien

n =: Anzahl der Einzelwerte

S_r =: Standardabweichung der Wiederholbarkeit

VK_r =: Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit

S_R =: Standardabweichung der Vergleichbarkeit

VK_R =: Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit

LOQ =: Bestimmungsgrenze

	Probe 1A 100	Probe 2O 100	Probe 3 L1	Probe 4 Z1	Probe 5 K1	Probe 6 MAT 1	Probe 7 MAT 2	Probe 8 MAT 3
L	11	11	11	11	6	10	9	10
n	19	18	19	19	12	20	18	10
Mittelwert (mg/kg)	100,8	103,5	0,89	1,15	0,89	1,0	1,5	< LOQ
S_r (mg/kg)	5,88	7,64	0,15	0,02	0,03	0,11	0,07	—
VK_r (%)	5,83	7,38	17,32	1,92	3,34	11,2	4,5	—
S_R (mg/kg)	7,59	7,64	0,17	0,11	0,12	0,18	0,21	—
VK_R (%)	7,53	7,38	18,61	9,67	13,65	18,1	14,3	—
Sollgehalt (mg/kg)	100	100	1,0	1,0	1,0	0,9	1,5	—
Referenz^(*)	Erste Studie aus dem Jahr 1994	Erste Studie aus dem Jahr 1994	Erste Studie aus dem Jahr 1994	Erste Studie aus dem Jahr 1994	Erste Studie aus dem Jahr 1994	Zweite Studie aus dem Jahr 2015	Zweite Studie aus dem Jahr 2015	Zweite Studie aus dem Jahr 2015

9.
Allgemeine Anmerkungen

Es muss vorab erwiesen sein, dass das Diclazurilsignal im linearen Konzentrationsbereich liegt. Zumindest bei der Analyse von Diclazuril in Mischfuttermitteln mit hohem Fettgehalt (zu diesem Zweck mehr als 12 % Fett) kann die Analysemethode durch andere HPLC-basierte Methoden ersetzt werden, etwa durch eine Methode auf der Basis von Hochleistungsflüssigchromatografie mit Massenspektrometrie (HPLC-MS), sofern die alternative Methode gleichwertige Leistungsmerkmale (Wiederfindungsrate, Präzision unter Wiederholbarkeits- und Vergleichbarkeitsbedingungen) aufweist.

G.
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN LASALOCID-NATRIUM

Monocarboxylsäure-Polyether-Natriumsalz, gebildet durch Streptomyces lasaliensis

Der Gehalt an Lasalocid-Natrium ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17299 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Screening und Bestimmung von zugelassenen Kokzidiostatika in Konzentrationen von Zusatzstoffen und deren Verschleppungen im Bereich von 1 % und 3 % sowie von nicht registrierten Kokzidiostatika und von einem Antibiotikum in Konzentrationen unterhalb von Zusatzstoffen in Mischfuttermitteln mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Nachweis (LC-MS/MS)” oder
—: durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung eines spektrofluorometrischen (Fluoreszenz-)Detektors, wie im Folgenden unter den Nummern 1 bis 8 beschrieben.

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Lasalocid-Natrium in Futtermitteln und Vormischungen. Die Nachweisgrenze beträgt 5 mg/kg, die Bestimmungsgrenze 10 mg/kg.

2.
Prinzip

Lasalocid-Natrium wird aus der Probe mit angesäuertem Methanol extrahiert und mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatografie (RP-HPLC) unter Verwendung eines spektrofluorometrischen (Fluoreszenz-)Detektors bestimmt.

3.
Reagenzien

3.1.: Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄)

3.2.: Orthophosphorsäure, w (Massenanteil) = 85 %

3.3.: Orthophosphorsäurelösung, c = 20 %
23,5 ml Orthophosphorsäure (Nummer 3.2) werden mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.4.: 6-Methyl-2-Heptylamin (1,5-Dimethylhexylamin), w (Massenanteil) = 99 %.

3.5.: Methanol, HPLC-Qualität.

3.6.: Salzsäure, Dichte = 1,19 g/ml.

3.7.: Phosphatpufferlösung, c = 0,01 mol/l
In 500 ml Wasser (Nummer 3.11) werden 1,36 g KH₂PO₄ (Nummer 3.1) gelöst, und es werden 3,5 ml Orthophosphorsäure (Nummer 3.2) sowie 10,0 ml 6-Methyl-2-Heptylamin (Nummer 3.4) hinzugefügt. Den pH-Wert mit Orthophosphorsäurelösung (Nummer 3.3) auf pH 4,0 einstellen und mit Wasser (Nummer 3.11) auf 1000 ml auffüllen.

3.8.: Angesäuertes Methanol
In einen 1000-ml-Messkolben werden 5,0 ml Salzsäure (Nummer 3.6) gegeben, und es wird mit Methanol (Nummer 3.5) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.9.: Mobile Phase für die HPLC: Phosphatpuffer-Methanollösung 5 + 95 (V+V)
Von der Phosphatpufferlösung (Nummer 3.7) werden 5 ml mit 95 ml Methanol (Nummer 3.5) vermischt.

3.10.: Lasalocid-Natrium-Standardsubstanz, garantiert rein, C₃₄H₅₃O₈Na (Monocarboxylsäure-Polyether-Natriumsalz, gebildet durch Streptomyces lasaliensis), E 763

3.10.1.: Lasalocid-Natrium-Standard-Stammlösung, 500 μg/ml
Von Lasalocid-Natrium (Nummer 3.10) werden 50 mg auf 0,1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen und in angesäuertem Methanol (Nummer 3.8) gelöst. Es wird mit demselben Lösungsmittel zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.10.2.: Lasalocid-Natrium-Standardlösung, 50 μg/ml
Von der Standard-Stammlösung (Nummer 3.10.1) werden 10,0 ml in einen 100-ml-Messkolben pipettiert; es wird mit angesäuertem Methanol (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.10.3.: Kalibrierlösungen
Von der Lasalocid-Natrium-Standardlösung (Nummer 3.10.2) werden 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 bzw. 10,0 ml in jeweils einen 50-ml-Messkolben überführt. Es wird mit angesäuertem Methanol (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt und durchmischt. Diese Kalibrierlösungen enthalten jeweils 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 bzw. 10,0 μg Lasalocid-Natrium je ml. Die Lösungen müssen vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.11.: Wasser, HPLC-Qualität.

4.
Geräte

4.1.: Ultraschallbad (oder Schüttel-Wasserbad) mit Temperatursteuerung.

4.2.: Membranfilter, 0,45 μm Porengröße.

4.3.: HPLC-Einrichtung mit Injektionssystem für Einspritzvolumina von 20 μl

4.3.1.: HPLC-Trennsäule, 125 mm × 4 mm, mit Umkehrphase C₁₈, 5 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule.

4.3.2.: Spektrofluorometer mit variabler Einstellung für Anregungs- und Emissionswellenlängen.

5.
Verfahren

5.1.
Allgemeines

5.1.1.
Blindprobe

Für die Durchführung des Wiederfindungstests (Nummer 5.1.2) ist zur Prüfung, dass weder Lasalocid-Natrium noch Störsubstanzen vorhanden sind, eine Blindprobe zu untersuchen. Die Blindprobe muss ähnlich zusammengesetzt sein wie die zu untersuchende Probe, und Lasalocid-Natrium oder Störsubstanzen dürfen nicht nachweisbar sein.

5.1.2.
Wiederfindungstest

Die Wiederfindungsrate wird ermittelt, indem eine Blindprobe untersucht wird, die mit Lasalocid-Natrium angereichert wurde. Die zugesetzte Menge sollte in etwa der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen. Zur Anreicherung auf einen Gehalt von 100 mg/kg werden 10,0 ml der Standard-Stammlösung (Nummer 3.10.1) in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben überführt. Die Lösung wird auf ca. 0,5 ml eingeengt. Dann werden 50 g der Blindprobe zugegeben. Es wird gründlich gemischt, 10 min stehen gelassen und erneut mehrmals gemischt, bevor mit der Extraktion (Nummer 5.2) fortgefahren wird. Ist eine der zu untersuchenden Probe ähnliche Blindprobe nicht verfügbar (siehe 5.1.1), so kann ein Wiederfindungstest mithilfe des Standard-Additionsverfahrens durchgeführt werden. In diesem Fall wird die zu untersuchende Probe mit einer Lasalocid-Natrium-Menge angereichert, die in etwa der bereits in der Probe vorhandenen Menge entspricht. Diese Probe wird zusammen mit der nicht angereicherten Probe untersucht und die Wiederfindungsrate kann durch Subtraktion ermittelt werden.

5.2.
Extraktion

5.2.1.
Futtermittel

Von der Probe werden 5 bis 10 g auf 0,01 g genau in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben mit Stopfen eingewogen und 100,0 ml angesäuertes Methanol (Nummer 3.8) mit einer Pipette hinzugefügt. Der Stopfen wird lose aufgesetzt und der Inhalt zum Dispergieren geschwenkt. Der Kolben wird 20 min in ein Ultraschallbad (Nummer 4.1) mit einer Temperatur von ca. 40 °C gestellt, dann entnommen und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der Kolben wird etwa 1 h stehen gelassen, bis die Schwebstoffe sich abgesetzt haben. Dann wird ein aliquoter Teil über einen 0,45-μm-Membranfilter (Nummer 4.2) in ein geeignetes Gefäß filtriert. Anschließend wird die HPLC-Bestimmung (Nummer 5.3) durchgeführt.

5.2.2.
Vormischungen

Rund 2 g der nicht gemahlenen Vormischung werden auf 0,001 g genau in einen 250-ml-Messkolben gegeben. Es werden 100,0 ml angesäuertes Methanol (Nummer 3.8) hinzugefügt; der Inhalt wird zum Dispergieren geschwenkt. Der Kolben wird mit Inhalt 20 min lang in ein Ultraschallbad (Nummer 4.1) mit einer Temperatur von ca. 40 °C gestellt, dann entnommen und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Es wird mit angesäuertem Methanol (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt und sorgfältig gemischt. Der Kolben wird etwa 1 h stehen gelassen, bis die Schwebstoffe sich abgesetzt haben. Dann wird ein aliquoter Teil durch einen 0,45-μm-Membranfilter (Nummer 4.2) filtriert. Ein aliquoter Teil des klaren Filtrats wird mit angesäuertem Methanol (Nummer 3.8) verdünnt, um eine Lösung mit einer Konzentration von etwa 4 μg/ml Lasalocid-Natrium zu erhalten. Anschließend wird die HPLC-Bestimmung (Nummer 5.3) durchgeführt.

5.3.
HPLC-Bestimmung

5.3.1.
Parameter

Die folgenden Angaben sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen:

HPLC-Trennsäule (Nummer 4.3.1):	125 mm × 4 mm, Umkehrphase C₁₈, 5 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule
Mobile Phase (Nummer 3.9):	Mischung aus Phosphatpufferlösung (Nummer 3.7) und Methanol (Nummer 3.5), 5 + 95 (V + V).
Durchflussrate:	1,2 ml/min
Detektionswellenlänge:	Anregung: 310 nm
	Emission: 419 nm
Einspritzvolumen:	20 μl

Die Stabilität des chromatografischen Systems wird überprüft, indem die Kalibrierlösung (Nummer 3.10.3), die 4,0 μg/ml enthält, mehrmals eingespritzt wird, bis konstante Peakhöhen (-flächen) und Retentionszeiten erreicht sind.

5.3.2.
Erstellung der Kalibrationskurve

Jede Kalibrierlösung (Nummer 3.10.3) wird mehrmals eingespritzt, und die mittleren Peakhöhen (-flächen) werden für die einzelnen Konzentrationen gemessen. Es wird eine Kalibrationskurve erstellt, indem die mittleren Peakhöhen (-flächen) auf der Ordinate und die dazugehörigen Konzentrationen in μg/ml auf der Abszisse aufgetragen werden.

5.3.3.
Bestimmung der Probenlösung

Die nach Nummer 5.2.1 bzw. 5.2.2 gewonnenen Probenextrakte werden mehrmals eingespritzt, wobei dasselbe Volumen wie für die Einspritzung der Kalibrierlösungen verwendet wird. Die mittlere Peakhöhe (-fläche) der Lasalocid-Natrium-Peaks wird ermittelt.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Aus der mittleren Peakhöhe (-fläche) der Probenlösung (Nummer 5.3.3) wird anhand der Kalibrationskurve die Konzentration an Lasalocid-Natrium (μg/ml) bestimmt.

6.1.
Futtermittel

Der Gehalt an Lasalocid-Natrium w (in mg/kg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet: wc × V1mmgkg wobei:

c=: c = Lasalocid-Natrium-Konzentration der Probenlösung (Nummer 5.2.1) in μg/ml,
V₁=: Volumen des Probenextrakts gemäß Nummer 5.2.1 (d. h. 100 ml),
m=: Probeneinwaage in g.

6.2.
Vormischungen

Der Gehalt an Lasalocid-Natrium w (in mg/kg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet: wc × V2. × fmmgkg wobei:

c=: c = Lasalocid-Natrium-Konzentration der Probenlösung (Nummer 5.2.2) in μg/ml,
V₂=: Volumen des Probenextrakts gemäß Nummer 5.2.2 in ml (d. h. 250 ml),
f=: Verdünnungsfaktor gemäß Nummer 5.2.2,
m=: Probeneinwaage in g.

7.
Überprüfung der Ergebnisse

7.1.
Identität

Nachweis- und Bestimmungsverfahren, denen die Fluoreszenzdetektion zugrunde liegt, sind im Vergleich zur UV-Detektion weniger interferenzanfällig. Die Identität des Analyten kann durch Co-Chromatografie bestätigt werden.

7.1.1.
Co-Chromatografie

Ein Probenextrakt (Nummer 5.2.1 oder 5.2.2) wird mit einer entsprechenden Menge Kalibrierlösung (Nummer 3.10.3) angereichert. Die zugesetzte Lasalocid-Natrium-Menge muss in etwa dem Lasalocid-Natrium-Gehalt des Probenextrakts entsprechen. Unter Berücksichtigung der zugesetzten Lasalocid-Natrium-Menge und der Verdünnung des Extrakts darf nur die Höhe des Lasalocid-Natrium-Peaks vergrößert sein. Die Peakbreite in halber Höhe darf höchstens ± 10 % von der ursprünglichen Peakbreite abweichen, die sich bei dem nicht angereicherten Probenextrakt ergibt.

7.2.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—: 15 % relativ zum höheren Wert bei Lasalocid-Natrium-Gehalten zwischen 30 und 100 mg/kg,
—: 15 mg/kg bei Lasalocid-Natrium-Gehalten zwischen 100 und 200 mg/kg,
—: 7,5 % relativ zum höheren Wert bei Lasalocid-Natrium-Gehalten von mehr als 200 mg/kg.

7.3.
Wiederfindungsrate

Bei einer angereicherten (Blind-)Probe muss die Wiederfindungsrate bei Futtermitteln mindestens 80 % betragen. Bei angereicherten Vormischungsproben muss die Wiederfindungsrate mindestens 90 % betragen.

8.
Ergebnisse eines Ringversuchs

In einem Ringversuch wurden 2 Vormischungen (Proben 1 und 2) und 5 Futtermittel (Proben 3 bis 7) in 12 Laboratorien untersucht. Jede Probe wurde doppelt analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst.

L=: Anzahl der Laboratorien

n=: Anzahl der Einzelwerte

s_r=: Standardabweichung der Wiederholbarkeit

s_R=: Standardabweichung der Vergleichbarkeit

VK_r=: Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit, %

VK_R=: Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit, %

	Probe 1 Vormischung Hühnerfutter	Probe 2 Vormischung Truthahnfutter	Probe 3 Truthahnpellets	Probe 4 Hühnerkrümelfutter	Probe 5 Truthahnfutter	Probe 6 Geflügelfutter A	Probe 7 Geflügelfutter B
L	12	12	12	12	12	12	12
n	23	23	23	23	23	23	23
Mittelwert [mg/kg]	5050	16200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
s_r [mg/kg]	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
VK_r [%]	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4,00	5,37
s_R [mg/kg]	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
VK_R [%]	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,70
Sollgehalt [mg/kg]	5000^(***)	16000^(***)	80^(***)	105^(***)	120^(***)	50^(****)	35^(****)

H.
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN AMPROLIUM-HYDROCHLORID

1-[(4-Amino-2-propyl-5-pyrimidinyl)methyl]-2-methyl-pyridiniumchlorid-monohydrochlorid

1.
Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Amproliumgehalts von Futtermitteln. Die Nachweisgrenze beträgt 1 mg/kg, die Bestimmungsgrenze 5 mg/kg.

2.
Prinzip

Die Probe wird mit einem Methanol-Wasser-Gemisch extrahiert. Nach Verdünnung mit der mobilen Phase und Membranfiltration wird der Amproliumgehalt mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) über ein Kationenaustauschermaterial unter Verwendung eines UV-Detektors bestimmt.

3.
Reagenzien

3.1.: Methanol

3.2.: Acetonitril, HPLC-Qualität.

3.3.: Wasser, HPLC-Qualität.

3.4.: Natriumdihydrogenphosphatlösung, c = 0,1 mol/l
Von dem Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat werden 13,80 g in einem 1000-ml-Messkolben in Wasser (Nummer 3.3) gelöst. Es wird mit Wasser (Nummer 3.3) zur Marke aufgefüllt und gemischt.

3.5.: Natriumperchloratlösung, c = 1,6 mol/l
Von dem Natriumperchloratmonohydrat werden 224,74 g in einem 1000-ml-Messkolben in Wasser (Nummer 3.3) gelöst. Es wird mit Wasser (Nummer 3.3) zur Marke aufgefüllt und gemischt.

3.6.: Mobile Phase für die HPLC (siehe Bemerkung 9.1)
Mischung aus Acetonitril (Nummer 3.2), Natriumdihydrogenphosphat-Lösung (Nummer 3.4) und Natriumperchlorat-Lösung (Nummer 3.5), 450 + 450 + 100 (v+v+v). Vor der Verwendung wird die Lösung durch einen 0,22-μm-Membranfilter (Nummer 4.3) filtriert und entgast (z. B. mindestens 15 min im Ultraschallbad (Nummer 4.4)).

3.7.: Standardsubstanz: Amprolium, rein, 1-[(4-Amino-2-propyl-5-pyrimidinyl)methyl]-2-methyl-pyridiniumchlorid, E 750 (siehe 9.2)

3.7.1.: Amprolium-Standard-Stammlösung, 500 μg/ml
Von Amprolium (Nummer 3.7) werden 50 mg auf 0,1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen, in 80 ml Methanol (Nummer 3.1) gelöst und 10 min in ein Ultraschallbad (Nummer 4.4) gestellt. Nach der Ultraschallbehandlung wird die Lösung auf Raumtemperatur gebracht; es wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt und gemischt. Bei einer Temperatur von ≤ 4 °C ist diese Lösung 1 Monat lang haltbar.

3.7.2.: Amprolium-Standard-Zwischenlösung, 50 μg/ml
Von der Standard-Stammlösung (Nummer 3.7.1) werden 5,0 ml in einen 50-ml-Messkolben pipettiert; es wird mit der Extraktionslösung (Nummer 3.8) zur Marke aufgefüllt und gemischt. Bei einer Temperatur von ≤ 4 °C ist diese Lösung 1 Monat lang haltbar.

3.7.3.: Kalibrierlösungen
Von der Amprolium-Standardlösung (Nummer 3.7.2) werden 0,5, 1,0 bzw. 2,0 ml jeweils in einen 50-ml-Messkolben überführt. Mit der mobilen Phase (Nummer 3.6) wird zur Marke aufgefüllt und durchmischt. Diese Lösungen enthalten jeweils 0,5, 1,0 bzw. 2,0 μg Amprolium je ml. Die Lösungen müssen vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

3.8.: Extraktionslösung
Methanol (Nummer 3.1)-Wasser-Mischung 2 + 1 (V+V).

4.
Geräte

4.1.: HPLC-Einrichtung mit Injektionssystem für Einspritzvolumina von 100 μl

4.1.1.: HPLC-Trennsäule für die Kationenaustauschchromatografie, 125 × 4 mm, z. B. Nucleosil 10 SA, 5 oder 10 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule.

4.1.2.: UV-Detektor mit variabler Wellenlängeneinstellung oder Diodenarray-Detektor.

4.2.: Membranfilter, PTFE-Material, 0,45 μm Porengröße.

4.3.: Membranfilter, 0,22 μm Porengröße.

4.4.: Ultraschallbad.

4.5.: Mechanischer Schüttler oder Magnetrührer.

5.
Verfahren

5.1.
Allgemeines

5.1.1.
Blindprobe

Für die Durchführung des Wiederfindungstests (Nummer 5.1.2) muss zur Prüfung, dass weder Amprolium noch Störsubstanzen vorhanden sind, eine Blindprobe untersucht werden. Die Blindprobe muss ähnlich zusammengesetzt sein wie die zu untersuchende Probe, und Amprolium oder Störsubstanzen dürfen nicht nachweisbar sein.

5.1.2.
Wiederfindungstest

Die Wiederfindungsrate wird ermittelt, indem eine Blindprobe untersucht wird, die mit Amprolium angereichert wurde. Die zugesetzte Menge an Amprolium sollte der in der Probe vorhandenen Menge entsprechen. Zur Anreicherung auf einen Gehalt von 100 mg/kg werden 10,0 ml der Standard-Stammlösung (Nummer 3.7.1) in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben überführt und auf ca. 0,5 ml eingeengt. Dann werden 50 g der Blindprobe zugegeben. Es wird gründlich gemischt, 10 min stehen gelassen und nochmals mehrfach gemischt, bevor mit der Extraktion (Nummer 5.2) fortgefahren wird. Ist eine der zu untersuchenden Probe ähnliche Blindprobe nicht verfügbar (siehe 5.1.1), so kann ein Wiederfindungstest mithilfe des Standard-Additionsverfahrens durchgeführt werden. In diesem Fall wird die zu untersuchende Probe mit einer Amproliummenge angereichert, die der bereits in der Probe vorhandenen Menge entspricht. Diese Probe wird zusammen mit der nicht angereicherten Probe untersucht, und die Wiederfindungsrate kann durch Subtraktion ermittelt werden.

5.2.
Extraktion

5.2.1.
Vormischungen (Amproliumgehalt < 1 %) und Futtermittel

Je nach Amproliumgehalt werden 5 bis 40 g der Probe auf 0,01 g genau in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben eingewogen und mit 200 ml Extraktionslösung (Nummer 3.8) versetzt. Der Kolben wird für 15 min in ein Ultraschallbad (Nummer 4.4) gestellt und anschließend 1 h auf dem Schüttelgerät geschüttelt oder auf dem Magnetrührer gerührt (Nummer 4.5). Ein aliquoter Teil des Extrakts wird mit der mobilen Phase (Nummer 3.6) auf einen Amproliumgehalt von 0,5 bis 2 μg/ml verdünnt und gemischt (siehe Bemerkung 9.3). Von dieser verdünnten Lösung werden 5 bis 10 ml durch einen Membranfilter (Nummer 4.2) filtriert. Anschließend wird die HPLC-Bestimmung (Nummer 5.3) durchgeführt.

5.2.2.
Vormischungen (Amproliumgehalt ≥ 1 %)

Je nach Amproliumgehalt werden 1 bis 4 g der Vormischung auf 0,001 g genau in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben eingewogen und mit 200 ml Extraktionslösung (Nummer 3.8) versetzt. Der Kolben wird für 15 min in ein Ultraschallbad (Nummer 4.4) gestellt und anschließend 1 h auf dem Schüttelgerät geschüttelt oder auf dem Magnetrührer gerührt (Nummer 4.5). Ein aliquoter Teil des Extrakts wird mit der mobilen Phase (Nummer 3.6) auf einen Amproliumgehalt von 0,5 bis 2 μg/ml verdünnt und gemischt. Von dieser verdünnten Lösung werden 5 bis 10 ml durch einen Membranfilter (Nummer 4.2) filtriert. Anschließend wird die HPLC-Bestimmung (Nummer 5.3) durchgeführt.

5.3.
HPLC-Bestimmung

5.3.1.
Parameter

Die folgenden Angaben sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen:

HPLC-Trennsäule (Nummer 4.1.1):	125 mm × 4 mm, Kationenaustausch Nucleosil 10 SA, 5 oder 10 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule
Mobile Phase (Nummer 3.6):	Mischung aus Acetonitril (Nummer 3.2), Natriumdihydrogenphosphat-Lösung (Nummer 3.4) und Natriumperchloratlösung (Nummer 3.5) 450 + 450 + 100 (v + v + v).
Durchflussrate:	0,7 bis 1 ml/min
Detektionswellenlänge:	264 nm
Einspritzvolumen:	100 μl

Die Stabilität des chromatografischen Systems wird überprüft, indem die Kalibrierlösung (Nummer 3.7.3), die 1,0 μg/ml enthält, mehrmals eingespritzt wird, bis konstante Peakhöhen (-flächen) und Retentionszeiten erreicht sind.

5.3.2.
Erstellung der Kalibrationskurve

Jede Kalibrierlösung (Nummer 3.7.3) wird mehrmals eingespritzt, und die mittleren Peakhöhen (-flächen) werden für die einzelnen Konzentrationen gemessen. Es wird eine Kalibrierkurve erstellt, indem die mittleren Peakhöhen (-flächen) auf der Ordinate und die dazugehörigen Konzentrationen in μg/ml auf der Abszisse aufgetragen werden.

5.3.3.
Bestimmung der Probenlösung

Der Probenextrakt (Nummer 5.2) wird mehrmals eingespritzt, wobei dasselbe Volumen wie für die Einspritzung der Kalibrierlösungen verwendet wird. Die mittlere Peakhöhe (-fläche) der Amproliumpeaks wird ermittelt.

6.
Berechnung der Ergebnisse

Aus der mittleren Höhe (Fläche) der Amproliumpeaks der Probenlösung wird anhand der Kalibrationskurve (Nummer 5.3.2) die Konzentration der Probenlösung in μg/ml bestimmt. Der Amproliumgehalt w (in mg/kg) der Probe wird nach folgender Formel berechnet: wV × c × fmmgkg wobei:

V=: Volumen der Extraktionslösung (Nummer 3.8) in ml gemäß Nummer 5.2 (d. h. 200 ml),
c=: Amproliumkonzentration der Probenlösung (Nummer 5.2) in μg/ml,
f=: Verdünnungsfaktor gemäß Nummer 5.2,
m=: Probeneinwaage in g.

7.
Überprüfung der Ergebnisse

7.1.
Identität

Die Identität des Analyten kann durch Co-Chromatografie oder mithilfe eines Diodenarray-Detektors bestätigt werden, wobei die Spektren der Probenlösung (Nummer 5.2) und der Kalibrierlösung (Nummer 3.7.3), die 2,0 μg/ml enthält, verglichen werden.

7.1.1.
Co-Chromatografie

Eine Probenlösung (Nummer 5.2) wird mit einer geeigneten Menge Kalibrierlösung (Nummer 3.7.3) angereichert. Die zugesetzte Amproliummenge muss dem Amproliumgehalt des Probenextrakts entsprechen. Unter Berücksichtigung der zugesetzten Menge und der Verdünnung des Extrakts darf nur die Höhe des Amproliumpeaks vergrößert sein. Die Peakbreite in halber Höhe darf höchstens ± 10 % von der des Peaks der nicht angereicherten Probenlösung abweichen.

7.1.2.
Diodenarray-Detektion

Die Ergebnisse werden gemäß den nachstehenden Kriterien beurteilt:

a): Die Wellenlängen bei maximaler Absorption des Proben- und des Standardspektrums an der Peakspitze des Chromatogramms müssen innerhalb eines Bereichs übereinstimmen, der durch das Auflösungsvermögen des Detektionssystems bestimmt wird. Für die Diodenarray-Detektion beträgt dieser Bereich in der Regel ± 2 nm.
b): Zwischen 210 und 320 nm dürfen sich das Proben- und das Standardspektrum an den Peakspitzen des Chromatogramms in den Bereichen zwischen 10 und 100 % relativer Absorption nicht unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichung zwischen den beiden Spektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 % der Absorption des Standardanalyten beträgt.
c): Zwischen 210 und 320 nm dürfen sich die Spektren des Probenextrakts im Anstieg, an der Spitze und im Abstieg des Probenpeaks in den Bereichen zwischen 10 und 100 % relativer Absorption nicht unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn die gleichen Maxima vorliegen und die Abweichung zwischen den Spektren an keinem Beobachtungspunkt mehr als 15 % der Absorption des Spektrums am Peakmaximum beträgt.

Wird eines dieser Kriterien nicht erfüllt, so gilt das Vorhandensein des Analyten als nicht bestätigt.

7.2.
Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

—: 15 % des höheren Werts bei einem Amproliumgehalt zwischen 25 und 500 mg/kg,
—: 75 mg/kg bei einem Amproliumgehalt zwischen 500 und 1000 mg/kg,
—: 7,5 % des höheren Werts bei einem Amproliumgehalt von über 1000 mg/kg.

7.3.
Wiederfindungsrate

Bei einer angereicherten (Blind-)Probe muss die Wiederfindungsrate mindestens 90 % betragen.

8.
Ergebnisse eines Ringversuchs

Bei einem Ringversuch wurden 3 Geflügelfuttermittel (Proben 1 bis 3), 1 Mineralfuttermittel (Probe 4) und 1 Vormischung (Probe 5) untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst.

L =: Anzahl der Laboratorien

n =: Anzahl der Einzelwerte

s_r =: Standardabweichung der Wiederholbarkeit

VK_r =: Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit

s_R =: Standardabweichung der Vergleichbarkeit

VK_R =: Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit

	Probe 1 (Blindprobe)	Probe 2	Probe 3	Probe 4	Probe 5
L	14	14	14	14	15
n	56	56	56	56	60
Mittelwert [mg/kg]	—	45,5	188	5129	25140
s_r [mg/kg]	—	2,26	3,57	178	550
VK_r [%]	—	4,95	1,90	3,46	2,20
s_R [mg/kg]	—	2,95	11,8	266	760
VK_R [%]	—	6,47	6,27	5,19	3,00
Sollgehalt [mg/kg]	—	50	200	5000	25000

9.
Bemerkungen

9.1.: Enthält die Probe Thiamin, so erscheint der Thiaminpeak in der Chromatografie kurz vor dem Amproliumpeak. Bei Anwendung dieser Methode müssen Amprolium und Thiamin getrennt werden. Sind Amprolium und Thiamin nicht durch die bei dieser Methode verwendete Säule (Nummer 4.1.1) getrennt, sollten bis zu 50 % des Acetonitrilanteils der mobilen Phase (Nummer 3.6) durch Methanol ersetzt werden.

9.2.: Gemäß dem britischen Arzneibuch zeigt das Spektrum einer Amproliumlösung (c = 0,02 mol/l) in Salzsäure (c = 0,1 mol/l) Maxima bei 246 nm und 262 nm. Die Absorption beträgt 0,84 bei 246 nm bzw. 0,80 bei 262 nm.

9.3.: Der Extrakt muss immer mit der mobilen Phase verdünnt werden, da sich sonst die Retentionszeit des Amproliumpeaks durch Veränderungen der Ionenstärke beträchtlich verschieben kann.

I.
BESTIMMUNG DES NARASINGEHALTS

Der Narasingehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17299 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Screening und Bestimmung von zugelassenen Kokzidiostatika in Konzentrationen von Zusatzstoffen und deren Verschleppungen im Bereich von 1 % und 3 % sowie von nicht registrierten Kokzidiostatika und von einem Antibiotikum in Konzentrationen unterhalb von Zusatzstoffen in Mischfuttermitteln mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Nachweis (LC-MS/MS)” oder
—: mit der Methode gemäß der Norm EN ISO 14183 „Futtermittel — Bestimmung der Gehalte an Monensin, Narasin und Salinomycin — Flüssigkeitschromatographisches Verfahren mittels Nachsäulenderivatisierung” .

J.
BESTIMMUNG DES NICARBAZINGEHALTS

Der Nicarbazingehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17299 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Screening und Bestimmung von zugelassenen Kokzidiostatika in Konzentrationen von Zusatzstoffen und deren Verschleppungen im Bereich von 1 % und 3 % sowie von nicht registrierten Kokzidiostatika und von einem Antibiotikum in Konzentrationen unterhalb von Zusatzstoffen in Mischfuttermitteln mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Nachweis (LC-MS/MS)” oder
—: mit der Methode gemäß der Norm EN 15782 „Futtermittel — Bestimmung von Nicarbazin — Hochleistungsflüssigchromatographisches Verfahren” .

K.
BESTIMMUNG DES DECOQUINAQTGEHALTS

Der Decoquinatgehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17299 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Screening und Bestimmung von zugelassenen Kokzidiostatika in Konzentrationen von Zusatzstoffen und deren Verschleppungen im Bereich von 1 % und 3 % sowie von nicht registrierten Kokzidiostatika und von einem Antibiotikum in Konzentrationen unterhalb von Zusatzstoffen in Mischfuttermitteln mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Nachweis (LC-MS/MS)” oder
—: mit der Methode gemäß der Norm EN 16162 „Futtermittel — Bestimmung von Decoquinat mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) und Fluoreszenzdetektion” .

L.
BESTIMMUNG DES MONENSINGEHALTS

Der Monensingehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17299 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Screening und Bestimmung von zugelassenen Kokzidiostatika in Konzentrationen von Zusatzstoffen und deren Verschleppungen im Bereich von 1 % und 3 % sowie von nicht registrierten Kokzidiostatika und von einem Antibiotikum in Konzentrationen unterhalb von Zusatzstoffen in Mischfuttermitteln mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Nachweis (LC-MS/MS)” oder
—: mit der Methode gemäß der Norm EN ISO 14183 „Futtermittel — Bestimmung der Gehalte an Monensin, Narasin und Salinomycin — Flüssigkeitschromatographisches Verfahren mittels Nachsäulenderivatisierung” .

M.
BESTIMMUNG DES SALINOMYCINGEHALTS

Der Salinomycingehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17299 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Screening und Bestimmung von zugelassenen Kokzidiostatika in Konzentrationen von Zusatzstoffen und deren Verschleppungen im Bereich von 1 % und 3 % sowie von nicht registrierten Kokzidiostatika und von einem Antibiotikum in Konzentrationen unterhalb von Zusatzstoffen in Mischfuttermitteln mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Nachweis (LC-MS/MS)” oder
—: mit der Methode gemäß der Norm EN ISO 14183 „Futtermittel — Bestimmung der Gehalte an Monensin, Narasin und Salinomycin — Flüssigkeitschromatographisches Verfahren mittels Nachsäulenderivatisierung” .

N.
BESTIMMUNG DES SEMDURAMYCINGEHALTS

Der Semduramycingehalt ist mit folgenden Verfahren zu bestimmen:

—: mit der Analysemethode gemäß der Norm EN 17299 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Screening und Bestimmung von zugelassenen Kokzidiostatika in Konzentrationen von Zusatzstoffen und deren Verschleppungen im Bereich von 1 % und 3 % sowie von nicht registrierten Kokzidiostatika und von einem Antibiotikum in Konzentrationen unterhalb von Zusatzstoffen in Mischfuttermitteln mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie-Nachweis (LC-MS/MS)” oder
—: mit der Methode gemäß der Norm EN 16158 „Futtermittel — Bestimmung des Semduramicingehalts — Flüssigkeitschromatographisches Verfahren mit verzweigter analytischer Vorgehensweise” .

O.
EUROPÄISCHE NORMEN (EN)

Für die Anwendung von Artikel 34 Absatz 2 Buchstabe a der Verordnung (EU) 2017/625 sind die folgenden europäischen Normen maßgeblich:

EN ISO 30024 „Futtermittel — Bestimmung der Phytaseaktivität”

EN 17050 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung von Iod in Futtermitteln mittels ICP-MS”

EN 17550 „Futtermittel — Bestimmung von Carotinoiden in Mischfuttermitteln und Vormischungen für Tiere mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit UV-Detektion (HPLC-UV)”

EN 15784 Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Nachweis und Zählung von Bacillus spp. als Futtermittelzusatzstoff

EN 15785 Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Keimzählung von Bifidobacterium spp

EN 15786 Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Nachweis und Zählung von Pediococcus spp. als Futtermittelzusatzstoff

EN 15787 Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Nachweis und Zählung von Lactobacillus spp. als Futtermittelzusatzstoff

EN 15788 Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Nachweis und Zählung von Enterococcus spp. (E. faecium) als Futtermittelzusatzstoff

EN 15789 Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Nachweis und Zählung von Saccharomyces cerevisiae als Futtermittelzusatzstoff

EN 15510 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung von Calcium, Natrium, Phosphor, Magnesium, Kalium, Eisen, Zink, Kupfer, Mangan, Cobalt, Molybdän und Blei mittels ICP-AES” (zur Analyse der Futtermittelzusatzstoffe Cobalt oder Molybdän)

EN 15621 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung von Calcium, Natrium, Phosphor, Magnesium, Kalium, Schwefel, Eisen, Zink, Kupfer, Mangan und Cobalt nach Druckaufschluss mittels ICP-AES” (zur Analyse des Futtermittelzusatzstoffs Cobalt)

EN 16159 „Futtermittel — Bestimmung von Selen mit Atomabsorptionsspektrometrie-Hydridtechnik (HD-AAS) nach Mikrowellen-Druckaufschluss (Aufschluss mit 65 % Salpetersäure und 30 % Wasserstoffperoxid)” (zur Analyse des Futtermittelzusatzstoffs Selen)

EN 17053 „Futtermittel — Probenahme- und Untersuchungsverfahren — Bestimmung von Spurenelementen, Schwermetallen und anderen Elementen in Futtermitteln mittels ICP-MS (Multimethode)” (zur Analyse der Futtermittelzusatzstoffe Cobalt, Molybdän und Selen)

Fußnote(n):

(1)

Die Analysemethode gemäß EN 17547 ist als Alternativmethode bei amtlichen Kontrollen zur Bestimmung der Vitamine A und E anstelle der in Teil A dieses Anhangs beschriebenen Methode zur Bestimmung von Vitamin A und der in Teil B dieses Anhangs beschriebenen Methode zur Bestimmung von Vitamin E angegeben.

(2)

Durchgeführt von der Fachgruppe Futtermittel des Verbands deutscher landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(3)

Die Analysemethode gemäß EN 17547 wird als Alternativmethode bei amtlichen Kontrollen zur Bestimmung der Vitamine A und E anstelle der in Teil A dieses Anhangs beschriebenen Methode zur Bestimmung von Vitamin A und der in Teil B dieses Anhangs beschriebenen Methode zur Bestimmung von Vitamin E angegeben.

(4)

Durchgeführt von der Fachgruppe Futtermittel des Verbands deutscher landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(5)

Diese Methode wurde im Rahmen eines Ringversuchs für verschiedene Futtermittelmatrizen validiert. Weitere Informationen sind hier abrufbar: https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/feed-additives/authorisation.

(6)

Andere Aufschlussmethoden können verwendet werden, sofern erwiesen ist, dass sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen (z. B. Mikrowellen-Druckaufschluss).

(7)

Grünfutter (frisch oder getrocknet) kann größere Mengen pflanzlicher Kieselsäure enthalten, welche Spurenelemente binden kann und daher entfernt werden muss. Bei Proben dieser Futtermittel muss also nach folgendem geänderten Verfahren vorgegangen werden: Das Verfahren 5.1.1.1 wird bis zur Filtration durchgeführt. Das den unlöslichen Rückstand enthaltende Filterpapier wird 2-mal mit kochendem Wasser ausgewaschen, in eine Quarz- oder Platinschale gegeben

und im Muffelofen (Nummer 4.1) bei weniger als 550 °C bis zur vollständigen Elimination aller Kohlepartikel verascht. Nach dem Abkühlen werden einige Tropfen Wasser und danach 10-15 ml Fluorwasserstoffsäure (Nummer 3.4) zugegeben und bei ca. 150 °C zur Trockne eingedampft. Verbleibt im Rückstand noch Kieselsäure, so wird diese erneut in einigen ml Fluorwasserstoffsäure (Nummer 3.4) gelöst und anschließend zur Trockne eingedampft. Dann werden 5 Tropfen Schwefelsäure (Nummer 3.5) zugesetzt und so lange erhitzt, bis keine weißen Dämpfe mehr auftreten. Nach Zugabe von 5 ml 6 mol/l Salzsäure (Nummer 3.2) und etwa 30 ml Wasser wird erhitzt und die Lösung in den 250-ml-Messkolben filtriert. Letzterer wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt (HCl-Konzentration etwa 0,5 mol/l). Anschließend wird wie ab 5.1.2 beschrieben weiterverfahren.

(8)

The Analyst 108, 1983, S. 1252-1256.

(9)

Das Verfahren kann auch für die Bestimmung des Diclazurilgehalts in Einzelfuttermitteln angewendet werden.

(10)

Eine längere Haltbarkeit (von bis zu einem Jahr) kann möglich sein, muss jedoch von dem einzelnen Labor bestätigt werden.

(*)

Erste Studie aus dem Jahr 1994: Journal of AOAC International, Band 77, Nr. 6, 1994, S. 1359-1361; Zweite Studie aus dem Jahr 2015: Technischer Bericht der JRC Re-validation of a method for the determination of diclazuril by collaborative study (2016).

(**)

Analyst, 1995, 120, S. 2175-2180.

(***)

Gehalt nach Angabe des Herstellers.

(****)

Im Laboratorium zubereitetes Futter.

ANHANG III ANHANG V

Tipp: Verwenden Sie die Pfeiltasten der Tastatur zur Navigation zwischen Normen.

ANHANG IV VO (EG) 2009/152

ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG VON FUTTERMITTELN AUF IHREN GEHALT AN ZUGELASSENEN ZUSATZSTOFFEN

A. BESTIMMUNG DES VITAMIN-A-GEHALTS

1.Zweck und Anwendungsbereich

2.Prinzip

3.Reagenzien

4.Geräte

5.Verfahren

5.1.Vorbereitung der Probe

5.2.Verseifung

5.3.Extraktion

5.3.1.Extraktion mithilfe eines Scheidetrichters (Nummer 4.2.3)

5.3.2.Extraktion mithilfe eines Extraktionsapparats (Nummer 4.8)

5.4.Vorbereitung der Probenlösung für die HPLC

5.5.Bestimmung durch HPLC

5.6.Kalibrierung

5.6.1.Herstellen der Gebrauchsstandardlösungen

5.6.2.Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrationskurve

5.6.3.UV-Kontrolle der Standardlösungen

5.6.3.1.Vitamin-A-Acetat-Stammlösung

5.6.3.2.Vitamin-A-Palmitat-Stammlösung

5.6.3.3.Vitamin-A-Gebrauchsstandardlösung

6.Berechnung der Ergebnisse

7.Bemerkungen

8.Wiederholbarkeit

9.Ergebnisse eines Ringversuchs(2)

Abbildung 1

B.BESTIMMUNG DES VITAMIN-E-GEHALTS

1.Zweck und Anwendungsbereich

2.Prinzip

3.Reagenzien

4.Geräte

5.Verfahren

5.1.Vorbereitung der Probe

5.2.Verseifung

5.3.Extraktion

5.3.1.Extraktion mithilfe eines Scheidetrichters (Nummer 4.2.3)

5.3.2.Extraktion mithilfe eines Extraktionsapparats (Nummer 4.8)

5.4.Vorbereitung der Probenlösung für die HPLC

5.5.Bestimmung durch HPLC

HPLC-Parameter

5.6.Kalibrierung (DL-α-Tocopherol-Acetat oder DL-α-Tocopherol)

5.6.1.DL-α-Tocopherol-Acetat-Standard

5.6.1.1.Herstellen der Gebrauchsstandardlösung

5.6.1.2.Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrationskurve

5.6.1.3.UV-Kontrolle der DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammlösung (Nummer 3.10.1)

5.6.2.DL-α-Tocopherol-Standard

5.6.2.1.Herstellen der Gebrauchsstandardlösung

5.6.2.2.Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrationskurve

5.6.2.3.UV-Kontrolle der DL-α-Tocopherol-Stammlösung (Nummer 3.11.1)

6.Berechnung der Ergebnisse

7.Bemerkungen

8.Wiederholbarkeit

9.Ergebnisse eines Ringversuchs(4)

Abbildung 2

C.BESTIMMUNG DES GEHALTS AN DEN SPURENELEMENTEN EISEN, KUPFER, MANGAN UND ZINK

1.Zweck und Anwendungsbereich

2.Prinzip

3.Reagenzien

Vorbemerkungen

4.Geräte

5.Verfahren(6)

5.1.Proben mit organischen Bestandteilen

5.1.1.Veraschung und Herstellung der Analysenlösung(7)

5.1.2.Spektralfotometrische Bestimmung

5.1.2.1.Herstellen der Kalibrierlösungen

5.1.2.2.Herstellen der Analysenlösung

5.1.2.3.Blindversuch

5.1.2.4.Messung der Atomabsorption

5.2.Mineralfutter

6.Berechnung der Ergebnisse

7.Wiederholbarkeit

8.Bemerkung

D.BESTIMMUNG DES HALOFUGINONGEHALTS

DL-trans-7-Brom-6-chlor-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-4(3H)-chinazolinon-hydrobromid

1.Zweck und Anwendungsbereich

2.Prinzip

3.Reagenzien

4.Geräte

5.Verfahren

A.

BESTIMMUNG DES VITAMIN-A-GEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

2.
Prinzip

3.
Reagenzien

4.
Geräte

5.
Verfahren

5.1.
Vorbereitung der Probe

5.2.
Verseifung

5.3.
Extraktion

5.3.1.
Extraktion mithilfe eines Scheidetrichters (Nummer 4.2.3)

5.3.2.
Extraktion mithilfe eines Extraktionsapparats (Nummer 4.8)

5.4.
Vorbereitung der Probenlösung für die HPLC

5.5.
Bestimmung durch HPLC

5.6.
Kalibrierung

5.6.1.
Herstellen der Gebrauchsstandardlösungen

5.6.2.
Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrationskurve

5.6.3.
UV-Kontrolle der Standardlösungen

5.6.3.1.
Vitamin-A-Acetat-Stammlösung

5.6.3.2.
Vitamin-A-Palmitat-Stammlösung

5.6.3.3.
Vitamin-A-Gebrauchsstandardlösung

6.
Berechnung der Ergebnisse

7.
Bemerkungen

8.
Wiederholbarkeit

9.
Ergebnisse eines Ringversuchs⁽²⁾

B.
BESTIMMUNG DES VITAMIN-E-GEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

2.
Prinzip

3.
Reagenzien

4.
Geräte

5.
Verfahren

5.1.
Vorbereitung der Probe

5.2.
Verseifung

5.3.
Extraktion

5.3.1.
Extraktion mithilfe eines Scheidetrichters (Nummer 4.2.3)

5.3.2.
Extraktion mithilfe eines Extraktionsapparats (Nummer 4.8)

5.4.
Vorbereitung der Probenlösung für die HPLC

5.5.
Bestimmung durch HPLC

5.6.
Kalibrierung (DL-α-Tocopherol-Acetat oder DL-α-Tocopherol)

5.6.1.
DL-α-Tocopherol-Acetat-Standard

5.6.1.1.
Herstellen der Gebrauchsstandardlösung

5.6.1.2.
Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrationskurve

5.6.1.3.
UV-Kontrolle der DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammlösung (Nummer 3.10.1)

5.6.2.
DL-α-Tocopherol-Standard

5.6.2.1.
Herstellen der Gebrauchsstandardlösung

5.6.2.2.
Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrationskurve

5.6.2.3.
UV-Kontrolle der DL-α-Tocopherol-Stammlösung (Nummer 3.11.1)

6.
Berechnung der Ergebnisse

7.
Bemerkungen

8.
Wiederholbarkeit

9.
Ergebnisse eines Ringversuchs⁽⁴⁾

C.
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN DEN SPURENELEMENTEN EISEN, KUPFER, MANGAN UND ZINK

1.
Zweck und Anwendungsbereich

2.
Prinzip

3.
Reagenzien

4.
Geräte

5.
Verfahren⁽⁶⁾

5.1.
Proben mit organischen Bestandteilen

5.1.1.
Veraschung und Herstellung der Analysenlösung⁽⁷⁾

5.1.2.
Spektralfotometrische Bestimmung

5.1.2.1.
Herstellen der Kalibrierlösungen

5.1.2.2.
Herstellen der Analysenlösung

5.1.2.3.
Blindversuch

5.1.2.4.
Messung der Atomabsorption

5.2.
Mineralfutter

6.
Berechnung der Ergebnisse

7.
Wiederholbarkeit

8.
Bemerkung

D.
BESTIMMUNG DES HALOFUGINONGEHALTS

1.
Zweck und Anwendungsbereich

2.
Prinzip

3.
Reagenzien

4.
Geräte

5.
Verfahren

5.1.
Allgemeines

5.2.
Extraktion

5.3.
Clean-up

5.3.1.
Vorbereitung der Amberlitesäule

5.3.2.
Clean-up der Probe

5.4.
HPLC-Bestimmung

5.4.1.
Parameter