1.

METHODE

1.1.

EINLEITUNG

Der Begriff Hautreizung bezeichnet das Auslösen einer reversiblen Hautschädigung nach Applikation einer Prüfsubstanz für die Dauer von bis zu 4 Stunden (Definition des Globalen Harmonisierten Systems (GHS) zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien der Vereinten Nationen (UN))(1). Die vorliegende Prüfmethode entspricht einem in vitro-Verfahren, das es je nach Informationsanforderungen gestattet, als vollwertiger Ersatztest (Stand-alone-Test) im Rahmen einer Teststrategie und nach einem evidenzbasierten Bewertungsansatz (Weight-of-Evidence approach) das Hautreizungspotenzial von Substanzen zu bestimmen (2). Hautreizungen wurden bisher meist anhand von Versuchstieren bewertet (siehe Prüfmethode B.4) (3). Um dem Tierschutzaspekt Rechnung zu tragen, sieht Methode B.4 vor, dass Hautverätzungen/-reizungen auch im Wege einer sequenziellen Teststrategie bestimmt werden können, bei der validierte in vitro- und ex vivo-Methoden angewandt werden, die den Tieren Schmerzen und Leiden ersparen. Drei validierte in vitro-Prüfmethoden bzw. Prüfrichtlinien — B.40, B.40bis und TG 435 (4, 5, 6) — sind für den Hautverätzungen betreffenden Teil der sequenziellen Teststrategie der Methode B.4 sinnvoll. Die vorliegende Prüfmethode beruht auf Modellen rekonstruierter menschlicher Epidermis, die in ihrer allgemeinen Ausgestaltung (Verwendung von menschlichen Keratinozyten als zelluläres Ausgangsmaterial, repräsentativem Gewebe und Zytoarchitektur) die biochemischen und physiologischen Eigenschaften der menschlichen Oberhaut, d. h. der Epidermis, weitgehend nachvollziehen. Das im Rahmen dieser Prüfmethode beschriebene Verfahren gestattet die Identifizierung der Gefahren von Reizstoffen gemäß Kategorie 2 des UN-GHS-Systems. Die Prüfmethode umfasst auch eine Reihe von Leistungsnormen für die Bewertung ähnlicher und modifizierter Methoden für Tests auf Basis rekonstruierter menschlicher Epidermis (7). Für zwei in vitro-Prüfmethoden (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17), die als EpiSkin™ und EpiDerm™ im Handel erhältlich sind und Modelle rekonstruierter menschlicher Epidermis verwenden, wurden Prävalidierungs-, Optimierungs- und Validierungsstudien abgeschlossen. Die angeführten Referenzen beruhten auf R38-Kennzeichnung. Bestimmte Aspekte der Umrechnung zum Zwecke des GHS werden unter Referenz 25 angesprochen. Methoden, die unter Leistungsgesichtspunkten mit der Methode EpiSkin™ (validierte Referenzmethode 1) vergleichbar sind, werden als vollwertige Ersatztests für den in-vivo-Test am Kaninchen zwecks Einstufung von Substanzen mit Hautreizungspotenzial in Kategorie 2 des GHS-Systems empfohlen. Methoden, die unter Leistungsgesichtspunkten mit der Methode EpiDerm™ (validierte Referenzmethode 2) vergleichbar sind, werden lediglich für Reihenuntersuchungen (Screening) oder im Rahmen einer sequenziellen Teststrategie mit evidenzbasiertem Bewertungsansatz zur Einstufung von Substanzen mit Hautreizungspotenzial in Kategorie 2 des GHS-Systems empfohlen. Bevor ein vorgeschlagener Hautreizungstest an Modellen von in vitro rekonstruierter menschlicher Epidermis für regulatorische Zwecke verwendet werden kann, sollten nach den in der vorliegenden Prüfmethode vorgegebenen Leistungsnormen (siehe Anhang) Verlässlichkeit, Relevanz (Genauigkeit) und Grenzen des Tests für den vorgeschlagenen Verwendungszweck bestimmt werden, um sicherzustellen, dass er mit der validierten Referenzmethode 1 vergleichbar ist. Zwei andere Methoden für Tests an in vitro rekonstruierter menschlicher Epidermis — der modifizierte EpiDerm™-Test (modifizierte Referenzmethode 2) und der SkinEthic RHE™-Test (Me-Too-Methode 1) — wurden entsprechend den Anforderungen für die vorliegende Prüfmethode validiert und erbringen ähnliche Ergebnisse wie die validierte Referenzmethode 1 (18).

1.2.

DEFINITIONEN

Für die vorliegende Prüfmethode gelten die folgenden Definitionen: Genauigkeit: Der Grad an Übereinstimmung zwischen Testergebnissen und akzeptierten Referenzwerten. Die Genauigkeit ist ein Maß der Leistung der Prüfmethode und ein Aspekt der Relevanz. Der Begriff wird oft im Sinne von „Übereinstimmung” verwendet und bezeichnet den Anteil der korrekten Ergebnisse einer Prüfmethode. Chargenkontrollsubstanz: Die beim Gewebe eine mittlere Zellviabilität hervorrufende Referenzsubstanz. Zellviabilität: Parameter zur Messung der Gesamtaktivität einer Zellpopulation, z. B. Fähigkeit zellulärer mitochondrialer Dehydrogenasen, den Vitalfarbstoff MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid, Thiazolyl-Blau) zu reduzieren, der je nach gemessenem Endpunkt und angewandtem Testkonzept der Gesamtzahl und/oder der Vitalität lebender Zellen entspricht. ET₅₀: Die Expositionszeit, die erforderlich ist, um die Zellviabilität bei Anwendung der Markersubstanz in vorgegebener fester Konzentration um 50 % zu reduzieren; siehe auch IC₅₀. Falsch-negativ-Rate: Der Anteil aller positiven Substanzen, die von einer Prüfmethode fälschlicherweise als negativ identifiziert werden. Die Falsch-negativ-Rate ist ein Leistungsindikator der Prüfmethode. Falsch-positiv-Rate: Der Anteil aller negativen (nicht wirkenden) Substanzen, die fälschlicherweise als positiv identifiziert werden. Die Falsch-positiv-Rate ist ein Leistungsindikator der Prüfmethode. Unendliche Dosis: Die Menge der auf die Haut aufgetragenen Prüfsubstanz, die über die zur vollständigen und gleichmäßigen Bedeckung der Hautoberfläche erforderliche Menge hinausgeht. GHS (Globales Harmonisiertes System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien): Ein System zur Klassifizierung von Substanzen und Gemischen nach standardisierten Typen und Stufen physikalischer, gesundheitlicher und ökologischer Gefahren und zur entsprechenden Kennzeichnung durch Piktogramme, Signalwörter, Gefahrenhinweise, Sicherheitshinweise und Sicherheitsdatenbögen, um zum Schutz des Menschen (einschließlich Arbeitgeber, Arbeiter, Spediteure, Verbraucher und Notfall-Einsatzkräfte) und der Umwelt Informationen über die schädlichen Wirkungen der betreffenden Chemikalien zu verbreiten (1); in der EU umgesetzt durch die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008. IC₅₀: Die Konzentration, bei der eine Markersubstanz die Viabilität der Gewebe nach einer vorgegebenen Expositionszeit um 50 % (IC₅₀) reduziert; siehe auch ET₅₀. Leistungsnormen: Auf einer validierten Referenzmethode beruhende Normen, auf deren Grundlage die Vergleichbarkeit einer vorgeschlagenen, mechanistisch und funktionell ähnlichen Prüfmethode bewertet werden kann. Sie umfassen i) wesentliche Elemente der Prüfmethode; ii) ein Mindestverzeichnis von Referenzsubstanzen, ausgewählt aus den Substanzen, die zum Nachweis der akzeptablen Leistung der validierten Referenzmethode verwendet werden; und iii) je nach den für die validierte Referenzmethode erzielten Ergebnissen die vergleichbaren Genauigkeits- und Zuverlässigkeitswerte, die die vorgeschlagene Prüfmethode bei der Bewertung anhand des Mindestverzeichnisses von Referenzsubstanzen demonstrieren sollte. Zuverlässigkeit: Maß der Verlässlichkeit der Reproduzierbarkeit einer Prüfmethode innerhalb von und zwischen Laboratorien in einem bestimmten Zeitintervall bei einheitlichem Protokoll. Die Zuverlässigkeit wird durch Berechnung der Intra- und Interlabor-Reproduzierbarkeit bewertet. Empfindlichkeit: Der Anteil aller positiven/wirkenden Stoffe, die durch den Test korrekt eingestuft werden. Die Empfindlichkeit ist ein Maß der Genauigkeit einer Prüfmethode mit kategorialen Ergebnissen und ein wichtiger Aspekt bei der Bewertung ihrer Relevanz. Spezifität: Der Anteil aller negativen/wirkungslosen Stoffe, die durch den Test korrekt eingestuft werden. Die Spezifität ist ein Maß der Genauigkeit einer Prüfmethode mit kategorialen Ergebnissen und ein wichtiger Aspekt bei der Bewertung ihrer Relevanz. Hautreizung: Das Auslösen einer reversiblen Hautschädigung nach Applikation einer Prüfsubstanz für die Dauer von bis zu 4 Stunden. Eine Hautreizung ist eine lokal auftretende, nicht immunogene Reaktion, die kurz nach der Stimulation eintritt (24). Ihr Hauptmerkmal ist ihr umkehrbarer Prozess, der mit Entzündungsreaktionen und den bei Entzündungen gängigsten klinischen Reizsymptomen (Erythema, Ödeme, Juckreiz und Schmerzen) einhergeht.

1.3.

ANWENDUNGSBEREICH UND GRENZEN

Die unter diese Prüfmethode fallenden Tests an rekonstruierter menschlicher Epidermis sind dadurch begrenzt, dass Stoffe nur als Hautreizstoffe im Sinne von Kategorie 2 des UN-GHS-Systems eingestuft werden können. Da keine Einstufung in die wahlfreie Kategorie 3 des UN-GHS-Systems möglich ist, bleiben alle restlichen Stoffe unklassifiziert (d. h. ohne Kategorieneinstufung). Je nach Regelungsbedarf und bei etwaiger künftiger Einbeziehung neuer Endpunkte, bei Verbesserungen oder bei Entwicklung neuer „Me-Too” -Tests muss die vorliegende Prüfmethode möglicherweise überprüft werden. Die vorliegende Prüfmethode gestattet die Gefahrenidentifizierung bei reizenden Monosubstanzen (19), liefert jedoch keine zweckdienlichen Informationen zur Hautverätzung. Gase und Aerosole können nicht getestet werden, und Gemische waren bisher noch nicht Gegenstand einer Validierungsstudie.

1.4.

TESTPRINZIP

Die Prüfsubstanz wird topisch aufgetragen auf ein dreidimensionales Modell rekonstituierter menschlicher Epidermis, bestehend aus normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten, die zu einem mehrschichtigen, stark differenzierten Modell menschlicher Epidermis kultiviert wurden. Letztere besteht aus angeordneten Basal-, Stachel- und Körnerzellschichten und einer mehrlagigen Hornschicht (stratum corneum), die zwischen den Zellen lamellare Fettschichten aufweist, welche nach in-vivo-ähnlichen Mustern angeordnet sind. Das Prinzip der Testung an Modellen rekonstruierter menschlicher Epidermis beruht auf der Prämisse, dass Reizsubstanzen die Hornschicht diffusionsbedingt durchdringen können und die Zellen in den darunterliegenden Schichten schädigen. Die Zellviabilität wird durch Dehydrogenase-Konversion des Vitalfarbstoffs MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid, Thiazolyl-Blau; EINECS-Nr. 206-069-5, CAS-Nr. 298-93-1)], zu einem blauen Formazan-Salz gemessen, das nach seiner Extaktion aus Geweben quantifiziert wird (20). Reizstoffe werden anhand ihrer Fähigkeit erkannt, die Zellviabilität unter vorgegebene Schwellenwerte zu senken (d. h. ≤ 50 % bei Reizstoffen der UN-GHS-Kategorie 2). Stoffe, die Zellviabilitäten über dem vorgegebenen Schwellenwert generieren, werden nicht klassifiziert (d. h. bei > 50 % keine Kategorieneinstufung). Modelle rekonstruierter menschlicher Epidermis eignen sich zur Untersuchung von Feststoffen, Flüssigkeiten, halbfesten Stoffe und Wachsen. Flüssigkeiten können wässrig oder nichtwässrig, Feststoffe wasserlöslich oder nicht wasserlöslich sein. Feststoffe sollten nach Möglichkeit als Feinpulver getestet werden. Da 58 sorgfältig ausgesuchte Substanzen, die ein breites Spektrum chemischer Klassen repräsentieren, in die Validierung der Tests an Modellen rekonstruierter menschlicher Epidermis einbezogen wurden, wird davon ausgegangen, dass die Methoden allgemeingültig, d. h. für alle chemischen Klassen geeignet sind (16). Die Validierung betrifft 13 Reizsubstanzen der Kategorie 2 des GHS-Systems. Es wird darauf hingewiesen, dass nicht verätzende Säuren, Laugen, Salze und andere anorganische Stoffe nicht validiert wurden und dass einige bekannte Klassen organischer Reizsubstanzen wie Hydroperoxide, Phenole und Tenside nicht oder nur begrenzt inbegriffen waren.

1.5.

LEISTUNGSNACHWEIS

Bevor eine validierte Methode, die den Anforderungen der vorliegenden Prüfmethode genügt, routinemäßig angewandt werden kann, sollten Laboratorien anhand von zehn der in Tabelle 1 aufgeführten Substanzen die technische Leistungsfähigkeit der Methode demonstrieren. Im Rahmen der vorliegenden Prüfmethode gilt die wahlfreie Kategorie 3 des UN-GHS-Systems nicht als Kategorie. Für im Rahmen der Prüfmethode entwickelte neuartige analoge Prüfmethoden ( „Me-Too” -Tests), die den validierten Referenzmethoden strukturell und funktionell vergleichbar sind, oder für Änderungen validierter Methoden sollten zum Nachweis der Vergleichbarkeit der Zuverlässigkeit und Genauigkeit der neuen Prüfmethode, bevor diese für Regulierungszwecke eingesetzt wird, die im Anhang zur vorliegenden Prüfmethode beschriebenen Leistungsnormen zugrunde gelegt werden.

Tabelle 1

Leistungssubstanzen als Untergruppe der im Anhang aufgelisteten Referenzsubstanzen

Substanz	CAS-Nummer	In-vivo-Punktzahl	Physikalischer Zustand	GHS-Kategorie
Naphthalen-Essigsäure	86-87-3	0	fest	keine Kat.
Isopropanol	67-63-0	0,3	flüssig	keine Kat.
Methylstearat	112-61-8	1	fest	keine Kat.
Heptyl-Butyrat	5870-93-9	1,7	flüssig	wahlfrei Kat. 3
Hexyl-Salicylat	6259-76-3	2	flüssig	wahlfrei Kat. 3
Cyclamenaldehyd	103-95-7	2,3	flüssig	Kat. 2
1-Bromohexan	111-25-1	2,7	flüssig	Kat. 2
Butylmethacrylat	97-88-1	3	flüssig	Kat. 2
1-Methyl-3-Phenyl-1-Piperazin	5271-27-2	3,3	fest	Kat. 2
Heptanal	111-71-7	4	flüssig	Kat. 2

1.6.

BESCHREIBUNG DER METHODE

Es folgt eine Beschreibung der Elemente und Verfahrensschritte eines Hautreizungstests an Modellen rekonstruierter menschlicher Epidermis. Modelle rekonstruierter menschlicher Epidermis können kultiviert, präpariert oder im Handel erworben werden (z. B. EpiSkin™, EpiDerm™ und SkinEthic RHE™). Standard-Testprotokolle für EpiSkin™, EpiDerm™ und SkinEthic RHE™ sind über http://ecvam.jrc.ec.europa.eu erhältlich (21, 22, 23). Die Testungen sollten wie folgt durchgeführt werden:

1.6.1.

Elemente des Modells rekonstruierter menschlicher Epidermis

1.6.1.1.

Allgemeine Modellbedingungen

Die Epithelschicht sollte aus normalen menschlichen Keratinozyten gebildet werden. Unter der funktionsfähigen Hornschicht (stratum corneum) sollten mehrere Lagen lebensfähiger Epithelzellen (Basalzellschicht, Stachelzellschicht, Körnerzellschicht) vorhanden sein. Die Hornschicht sollte mehrlagig sein und das zur Erzeugung einer funktionsfähigen Barriere, die robust genug ist, um das schnelle Eindringen zytotoxischer Markersubstanzen wie Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Triton X-100 zu verhindern, essenzielle Lipidprofil aufweisen. Die Barrierefunktion kann entweder durch Bestimmung der Konzentration, in der eine Markersubstanz die Viabilität der Gewebe nach einer vorgegebenen Expositionsdauer um 50 % verringert (IC₅₀), oder durch Bestimmung der Expositionszeit bewertet werden, die erforderlich ist, um die Zellviabilität bei Anwendung der Markersubstanz in einer vorgegebenen festen Konzentration um 50 % zu reduzieren (ET₅₀). Das Modell muss rückhaltefähig genug sein, um zu verhindern, dass Material rund um die Hornschicht in lebensfähiges Gewebe eindringt, was zu einer mangelhaften Modellierung der Hautexposition führen würde. Das Hautmodell sollte nicht mit Bakterien, Viren, Mycoplasma oder Pilzen kontaminiert sein.

1.6.1.2.

Bedingungen für das Funktionsmodell

1.6.1.2.1.

Viabilität

Die Viabilität wird vorzugsweise anhand des MTT-Tests bestimmt (20). Die optische Dichte (OD) des aus dem mit der Negativkontrolle (NK) behandelten Gewebe extrahierten (solubilisierten) Farbstoffs sollte mindestens dem Zwanzigfachen der OD des Extraktionslösemittels allein entsprechen. Es ist protokollarisch festzuhalten, dass das mit der NK behandelte Gewebe während der Expositionszeit nachweislich in der Kultur stabil ist (d. h. es sollte vergleichbare Viabilitätsmesswerte aufweisen).

1.6.1.2.2.

Barrierefunktion

Die Hornschicht und ihre Fettzusammensetzung sollten in der Lage sein, das schnelle Eindringen zytotoxischer Markersubstanzen wie SDS oder Triton X-100, wie durch IC₅₀ oder ET₅₀ bestimmt, zu verhindern.

1.6.1.2.3.

Morphologie

Die histologische Untersuchung der rekonstruierten Haut/Epidermis sollte durch entsprechend qualifiziertes Personal erfolgen, das nachweisen muss, dass das Modell eine der menschlichen Haut/Epidermis ähnliche Struktur (einschließlich mehrlagiger Hornschicht) aufweist.

1.6.1.2.4.

Reproduzierbarkeit

Die Methode sollte unter gleichen Modellbedingungen, vorzugsweise anhand einer geeigneten Chargenkontroll-(Referenz-)substanz (siehe Anhang), im Zeitverlauf nachweislich reproduzierbar sein.

1.6.1.2.5.

Qualitätskontrollen (QK) des Modells

Jede Charge des verwendeten Epidermis-Modells sollte bestimmten Freigabekriterien genügen, von denen die Viabilitätskriterien (Absatz 1.6.1.2.1) und die Kriterien für die Barrierefunktion (Absatz 1.6.1.2.2) die wichtigsten sind. Der Hersteller des Hautmodells (oder — bei Verwendung eines hauseigenen Modells — der Prüfer) sollte eine Akzeptanzspanne (oberer und unterer Grenzwert) für IC₅₀ oder ET₅₀ festlegen. Das Labor sollte die Barriereeigenschaften der Gewebe nach deren Bezug überprüfen. Nur mit geeigneten Geweben erzielte Ergebnisse kommen für eine zuverlässige Vorhersage von Reizwirkungen in Frage. Beispiele für Akzeptanzspannen für die validierten Referenzmethoden:

Tabelle 2

Beispiele für Chargenfreigabekriterien im Rahmen der Qualitätskontrolle

	Untere Akzeptanzgrenze	Mittelwert	Obere Akzeptanzgrenze
Validierte Referenzmethode 1 (18-stündige Behandlung mit SDS)	IC50 = 1,0 mg/ml	IC50 = 2,32 mg/ml	IC50 = 3,0 mg/ml
Validierte Referenzmethode 2 (1 % Triton X-100)	ET50 = 4,8 Std.	ET50 = 6,7 Std.	ET50 = 8,7 Std.

1.6.1.3.

Applikation der Prüf- und Kontrollsubstanzen

Bei jeder Behandlung und für die Kontrollen sollte eine ausreichende Anzahl Gewebereplikate (mindestens drei je Test) verwendet werden. Bei flüssigen und festen Substanzen sollte eine ausreichende Menge Prüfsubstanz gleichmäßig auf die gesamte Hautoberfläche aufgetragen werden; unendliche Dosen (siehe 1.2 — Definitionen) sind zu vermeiden, d. h. es sollten mindestens 25 μL/cm² bzw. 25 mg/cm² verwendet werden. Bei festen Stoffen sollte die Epidermis-Oberfläche vor der Applikation mit deionisiertem oder destilliertem Wasser angefeuchtet werden, um guten Hautkontakt zu gewährleisten. Feststoffe sollten nach Möglichkeit als Feinpulver getestet werden. Am Ende der Expositionszeit sollte die Prüfsubstanz mit wässriger Pufferlösung oder 0,9 % NaCl von der Haut abgewaschen werden. Je nachdem, welches Modell rekonstruierter menschlicher Epidermis verwendet wurde, kann die Expositionszeit 15 bis 60 Minuten betragen und die Inkubationstemperatur zwischen 20 und 37 °C liegen. Für Einzelheiten siehe Standardvorgehensweise (Standard Operating Procedures) für die drei Methoden (21, 22, 23). Bei jeder Studie sollten parallel Negativkontrollen (NK) und Positivkontrollen (PK) verwendet werden, um nachweisen zu können, dass die Viabilität (NK), die Barrierefunktion und die resultierende Empfindlichkeit (PK) der Gewebe innerhalb einer vorgegebenen historischen Akzeptanzspanne liegen. Als PK-Substanz wird 5 % wässrige SDS empfohlen. Als NK-Substanzen empfehlen sich Wasser oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).

1.6.1.4.

Zellviabilitätsmessungen

Wichtigstes Element des Testprotokolls ist es, dass Viabilitätsmessungen nicht unmittelbar nach dem Kontakt mit den Prüfsubstanzen, sondern nach einer ausreichend langen Inkubationszeit der abgespülten Gewebe (nach der Behandlung) in frischem Medium erfolgen. Während dieser Zeit kann sich das Gewebe von milden Reizwirkungen erholen bzw. deutliche zytotoxische Effekte können sich herausbilden. Während der Phase der Testoptimierung (9, 10, 11, 12, 13) hat sich eine Inkubationszeit von 42 Stunden nach der Behandlung als optimal erwiesen und wurde daher bei der Validierung der Referenztestmethoden zugrunde gelegt. Der MTT-Konversionstest ist eine validierte quantitative Methode, die zur Messung der zellulären Aktivität angewandt werden sollte. Sie ist zur Anwendung in einem dreidimensionalen Gewebemodell geeignet. Die Hautprobe wird für drei Stunden in eine MTT-Lösung angemessener Konzentration (z. B. 0,3-1 mg/mL) gegeben. Das präzipitierte blaue Formazan-Produkt wird anschließend mit Hilfe eines Lösemittels (z. B. Isopropanol, Säure-Isopropanol) aus dem Gewebe extrahiert, und die Formazan-Konzentration wird durch Bestimmung der OD bei 570 nm mittels eines Bandpasses von maximal ±30 nm gemessen. Optische Eigenschaften der Prüfsubstanz oder ihre chemische Wirkung auf den MTT können mit dem Test interferieren und (weil die Prüfsubstanz die Farbbildung sowohl verhindern oder umkehren als auch hervorrufen kann) zu einer falschen Viabilitätsschätzung führen. Dies kann der Fall sein, wenn eine bestimmte Prüfsubstanz nicht komplett von der Haut abgewaschen wurde oder wenn sie in die Epidermis eindringt. Wirkt sich die Prüfsubstanz unmittelbar auf den MTT aus, ist sie natürlich gefärbt oder verfärbt sie sich während der Gewebebehandlung, so sollten zum Nachweis und zur Behebung einer etwaigen Interferenz der Prüfsubstanz mit der Viabilitätsmesstechnik zusätzliche Kontrollen verwendet werden. Für eine genaue Beschreibung des Tests der direkten MTT-Reduktion siehe das Testprotokoll für die validierten Referenzmethoden (21, 22, 23). Eine infolge dieser Interferenzen eintretende unspezifische Färbung (non specific colour, NSC) sollte 30 % der NK (bei Behebung) nicht überschreiten. Beträgt die NSC > 30 %, so gilt die Prüfsubstanz als nicht mit dem Test vereinbar.

1.6.1.5.

Testakzeptanzkriterien

Bei jedem Test an gültigen Chargen (siehe Absatz 1.6.1.2.5) sollten mit der Negativkontrolle behandelte Gewebe OD-Werte aufweisen, die für die Gewebequalität nach abgeschlossenen Beförderungs- und Annahmevorgängen und sämtlichen Schritten des Reizungsprotokolls aussagekräftig sind. Die OD-Werte der Kontrollen sollten nicht unter historisch etablierten niedrigeren Grenzwerten liegen. Gleichermaßen sollten mit der Positivkontrolle, d. h. 5 % wässrige SDS, behandelte Gewebe die verbleibende Empfindlichkeit der Gewebe und ihre Fähigkeit reflektieren, unter den Bedingungen jedes einzelnen Tests (z. B. Viabilität ≤ 40 % bei der validierten Referenzmethode 1 und ≤ 20 % bei der validierten Referenzmethode 2) auf eine Reizsubstanz zu reagieren. Es sollten entsprechende und geeignete Maße der Variabilität zwischen Gewebereplikaten festgelegt werden (Beispiel: soweit Standardabweichungen verwendet werden, sollten sie ≤ 18 % betragen).

2.

DATEN

2.1.

DATEN

Für jede Behandlung sollten Daten aus einzelnen Replikattestproben (z. B. OD-Werte und Daten über die berechnete prozentuale Zellviabilität für jede Prüfsubstanz, einschließlich Einstufung), gegebenenfalls auch Daten aus Wiederholungsversuchen, tabellarisch mitgeteilt werden. Darüber hinaus sollten für jeden Versuch der Mittelwert ± Standardabweichung und für jede geprüfte Substanz festgestellte Interaktionen mit dem MTT-Reagens und Testfarbstoffen übermittelt werden.

2.2.

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE

Die für die einzelnen Testproben erzielten OD-Werte können zur Berechnung der prozentualen Viabilität im Vergleich zur Negativkontrolle, die auf 100 % festgesetzt ist, herangezogen werden. Der Schwellenwert der prozentualen Viabilität, der zwischen Reizstoff und nicht klassifizierten Prüfsubstanzen unterscheidet, und das (die) statistische(n) Verfahren zur Auswertung der Ergebnisse und zur Identifizierung von Reizstoffen sollten genau definiert und protokolliert werden und nachweislich geeignet sein. Die Schwellenwerte für die Vorhersage der Reizung im Rahmen der validierten Referenzmethoden sind nachstehend angegeben: Die Prüfsubstanz gilt als hautreizend im Sinne von Kategorie 2 des UN-GHS-Systems,

i)

wenn die Gewebeviabilität nach der Exposition und der Inkubation nach der Behandlung weniger als oder gleich (≤) 50 % beträgt.

Die Prüfsubstanz fällt in keine Kategorie,

ii)

wenn die Gewebeviabilität nach der Exposition und der Inkubation nach der Behandlung mehr als (>) 50 % beträgt.

3.

BERICHTERSTATTUNG

3.1.

TESTBERICHT

Der Testbericht sollte folgende Informationen enthalten: Prüf- und Kontrollsubstanzen:

—

chemische Bezeichnung(en) wie IUPAC oder CAS-Bezeichnung und CAS-Nummer, soweit bekannt;

—

Reinheit und Zusammensetzung der Substanz (in Gewichtsprozent);

—

physikalisch-chemische Eigenschaften (z. B. physikalischer Zustand, Stabilität und Flüchtigkeit, pH-Wert, Wasserlöslichkeit, soweit bekannt), die für die Durchführung der Studie relevant sind;

—

Behandlung der Prüf-/Kontrollsubstanzen vor dem Test, sofern relevant (z. B. Erwärmen, Mahlen);

—

Lagerbedingungen.

Gründe für die Verwendung des betreffenden Hautmodells und Protokolls. Testbedingungen:

—

verwendetes Zellsystem;

—

Eichdaten für das Messgerät und den Bandpass zur Messung der Zellviabilität (z. B. Spektrofotometer);

—

umfassende Begleitdokumentation für das betreffende Hautmodell, einschließlich seiner Leistung; die Dokumentation sollte folgende Angaben umfassen, aber nicht darauf begrenzt sein:

i)

Viabilität,

ii)

Barrierefunktion,

iii)

Morphologie,

iv)

Reproduzierbarkeit und Prädiktivität,

v)

Qualitätskontrollen (QK) des Modells;

—

Angaben zum Testprotokoll;

—

verwendete Testdosen, Dauer der Exposition und der Inkubationszeit nach der Behandlung;

—

Beschreibung etwaiger Änderungen des Testprotokolls;

—

Verweis auf historische Modelldaten; diese Information sollten folgende Angaben umfassen, aber nicht darauf begrenzt sein:

i)

Akzeptanz der QK-Daten mit Verweis auf historische Chargendaten;

ii)

Akzeptanz der Positiv- und Negativkontrollwerte mit Verweis auf die Mittelwerte und Spannbreiten der Positiv- und Negativkontrollen.

—

Beschreibung der angewandten Auswertungskriterien, einschließlich Gründe für die Wahl des (der) Schwellenwerte(s) für das Vorhersagemodell.

Ergebnisse:

—

tabellarische Darstellung der Daten aus Einzelproben;

—

Beschreibung sonstiger beobachteter Wirkungen.

Diskussion der Ergebnisse. Schlussfolgerungen.

4.

REFERENZEN

1.

United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), zweite überarbeitete Ausgabe, UN New York und Genf, 2007. Abrufbar über: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html.

2.

REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Abrufbar über: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649.

3.

Testmethode B.4. AKUTE TOXIZITÄT; HAUTREIZUNG/-VERÄTZUNG.

4.

Testmethode B.40. IN VITRO-PRÜFUNG AUF HAUTVERÄTZENDE WIRKUNG: TER-TEST (TRANSCUTANEOUS ELECTRICAL RESISTANCE TEST).

5.

Testmethode B.40 BIS. IN VITRO-PRÜFUNG AUF HAUTVERÄTZENDE WIRKUNG: TEST MIT MENSCHLICHEM HAUTMODELL.

6.

OECD (2006). Prüfrichtlinie 435. OECD-Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Angenommen am 19. Juli 2006. Abrufbar über: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html.

7.

ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Abrufbar über Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

8.

Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, S. 57-93.

9.

Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, S. 765-770.

10.

Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, S. 107-114.

11.

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12.

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13.

Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30, S. 109-129.

14.

Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, S. 559-601.

15.

Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 pp. + annexes. Abrufbar Download Study Documents: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.

16.

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17.

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18.

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