1.

METHODE

Diese Methode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 201 (2006) (1).

1.1.

EINLEITUNG

Die Prüfmethoden werden regelmäßig unter Berücksichtigung des wissenschaftlichen Fortschritts überarbeitet und aktualisiert. Prüfmethode C.3 musste unter Einbeziehung weiterer Arten und unter Berücksichtigung der Anforderungen an die Risikobewertung und Klassifizierung chemischer Stoffe überarbeitet werden. Die Überarbeitung wurde auf der Grundlage umfassender praktischer Erfahrungen sowie des wissenschaftlichen Fortschritts im Zusammenhang mit Untersuchungen zur Algentoxizität und der weit reichenden Anwendung entsprechender Rechtsvorschriften seit Annahme der ursprünglichen Fassung vorgenommen.

1.2.

BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

Im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode werden die folgenden Begriffsbestimmungen zugrunde gelegt und folgende Abkürzungen verwendet: Biomasse: Trockengewicht lebenden Materials einer Population bezogen auf ein vorgegebenes Volumen (z. B. mg Algen/Liter Testlösung); gewöhnlich wird „Biomasse” definiert als Masse; in Verbindung mit dieser Prüfung wird der Begriff allerdings zur Bezeichnung einer Masse pro Volumen verwendet. Typischerweise werden Surrogate für die betreffende Biomasse (z. B. Zellgehalt oder Fluoreszenz) gemessen; entsprechend bezieht sich der Begriff „Biomasse” auch auf diese Surrogatparameter. Variationskoeffizient: ein dimensionsloses Maß für die Veränderlichkeit eines Parameters; definiert als Verhältnis der Standardabweichung vom Mittelwert; der Variationskoeffizient kann auch als Prozentwert ausgedrückt werden. Der mittlere Variationskoeffizient der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate sollte bei Wiederholungs-Kontrollkulturen wie folgt berechnet werden:

1.

Der Variationskoeffizient in Prozent (VK %) der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate ist aus den täglichen bzw. abschnittsbezogenen Wachstumsraten der entsprechenden Wiederholungen zu beziehen.

2.

Aufgrund des Mittelwertes aller in Punkt 1 berechneten Werte ist der mittlere Variationskoeffizient der täglichen/abschnittsbezogenen Wachstumsraten der Kulturen in den Wiederholungen zu bestimmen.

EC_x: Konzentration der Prüfsubstanz aufgelöst im Prüfmedium, bei der das Wachstum des Testorganismus binnen einer bestimmten Expositionsdauer (die ausdrücklich anzugeben ist, wenn die Expositionsdauer nicht mit der vollständigen oder gewöhnlichen Dauer der Prüfung übereinstimmt) um x % (z. B. 50 %) abnimmt; um eindeutig anzugeben, ob ein EC-Wert aus der Wachstumsrate (growth rate) oder aus dem Zellertrag (yield) abgeleitet wurde, werden die Kurzbezeichnungen E_rC und E_yC verwendet. Nährmedium: gesamtes synthetisches Kulturmedium, in dem die zu prüfenden Algen wachsen, wenn sie der Prüfsubstanz ausgesetzt werden; die Prüfsubstanz wird im Allgemeinen im Prüfmedium aufgelöst. Wachstumsrate (durchschnittliche spezifische Wachstumsrate): logarithmische Zunahme der Biomasse während der Expositionsdauer. Niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (LOEC): niedrigste geprüfte Konzentration, bei der beobachtet wurde, dass die Substanz binnen einer bestimmten Expositionsdauer gegenüber der Kontrollprobe eine statistisch signifikante Wachstumsreduzierung bewirkt (bei p < 0,05); allerdings müssen sämtliche Testkonzentrationen über der LOEC schädliche Folgen haben, die mindestens den bei der LOEC beobachteten schädlichen Folgen gleichwertig sind. Wenn diese beiden Bedingungen nicht erfüllt werden können, ist umfassend darzulegen, warum die LOEC (und entsprechend die NOEC) gewählt wurde. Höchste geprüfte Konzentration ohne beobachtete schädliche Wirkung (NOEC): Testkonzentration unmittelbar unterhalb der LOEC. Reaktionsvariable: Variable für die geschätzte Toxizität, abgeleitet aus beliebigen gemessenen Parametern zur Beschreibung der Biomasse durch verschiedene Berechnungsmethoden; bei dieser Methode sind Wachstumsrate und Zellertrag Reaktionsvariablen, die aus der direkten Messung der Biomasse oder einer Messung eines der genannten Surrogate abgeleitet werden. Spezifische Wachstumsrate: Reaktionsvariable, die sich aus dem Quotienten der Differenz der natürlichen Logarithmen eines beobachteten Parameters (bei dieser Prüfmethode die Biomasse) und dem betreffenden Zeitraum ergibt. Zellertrag: Wert einer Messvariable am Ende der Expositionsdauer abzüglich des Wertes der Messvariablen zu Beginn der Expositionsdauer als Maß für die Zunahme der Biomasse während der Prüfung.

1.3.

ANWENDBARKEIT DER PRÜFMETHODE

Diese Prüfmethode ist am einfachsten bei wasserlöslichen Substanzen anzuwenden, die unter den Prüfbedingungen voraussichtlich im Wasser gelöst bleiben. Zum Prüfen von flüchtigen, stark adsorbierenden, farbigen und schlecht in Wasser löslichen Substanzen sowie von Substanzen, die sich auf die Verfügbarkeit von Nährstoffen oder Mineralien im Prüfmedium auswirken können, sind am beschriebenen Verfahren unter Umständen gewisse Änderungen vorzunehmen (z. B. die Herstellung eines geschlossenen Systems oder eine besondere Vorbereitung der Prüfgefäße). Hinweise zu verschiedenen Änderungen sind den Quellen (2), (3) und (4) zu entnehmen.

1.4.

PRINZIP DER PRÜFMETHODE

Mit dieser Prüfung sollen die Auswirkungen einer Substanz auf das Wachstum von Süßwassermikroalgen und/oder Cyanobakterien bestimmt werden. Exponentiell wachsende Testorganismen werden über einen Zeitraum von im Allgemeinen 72 Stunden in Batch-Kulturen der Prüfsubstanz ausgesetzt. Trotz der verhältnismäßig kurzen Testdauer können die Auswirkungen über mehrere Generationen beurteilt werden. Die Systemreaktion besteht in der Verringerung des Wachstums einer Reihe von Algenkulturen (Versuchseinheiten), die einer Prüfsubstanz in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt wurden. Diese Reaktion wird dann in Abhängigkeit von der Expositionskonzentration gegenüber dem durchschnittlichen Wachstum in zur Wiederholung verwendeten Kontrollkulturen bewertet, die der betreffenden Substanz nicht ausgesetzt waren. Um die Systemreaktion auf toxische Auswirkungen (optimale Empfindlichkeit) umfassend beschreiben zu können, wird ein unbegrenztes exponentielles Wachstum der Kulturen bei hinreichender Ernährung und kontinuierlicher Beleuchtung über einen ausreichenden Zeitraum ermöglicht, damit anschließend die Verringerung der spezifischen Wachstumsrate gemessen werden kann. Wachstum und Wachstumshemmung werden durch zeitabhängige Messung der Biomasse der Algen bestimmt. Die Biomasse der Algen wird als Trockengewicht pro Volumen ausgedrückt (z. B. in mg Algen/Liter Testlösung). Das Trockengewicht ist jedoch schwer zu messen; daher werden Surrogatparameter verwendet. Häufigster Surrogatparameter ist der Zellgehalt. Weitere Surrogatparameter sind das Zellvolumen, die Fluoreszenz, die optische Dichte usw. Ein Faktor für die Umrechnung zwischen dem gemessenen Surrogatparameter und der Biomasse sollte bekannt sein. Der Endpunkt des Tests ist die Wachstumshemmung, ausgedrückt als logarithmische Zunahme der Biomasse (durchschnittliche spezifische Wachstumsrate) während der Expositionsdauer. Aus den in einer Reihe von Testlösungen erfassten durchschnittlichen spezifischen Wachstumsraten wird die Konzentration bestimmt, bei der sich eine spezifizierte Hemmung der Wachstumsrate von x % (z. B. 50 %) ergibt; diese Konzentration wird als E_rC_x bezeichnet (z. B. E_rC₅₀). Bei der Anwendung dieser Methode im Rahmen des Gemeinschaftsrechts sollte die Ergebnisberechnung aus den im nachfolgenden Abschnitt 2.2 dargelegten Gründen auf einer durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate basieren. Bei dieser Prüfmethode wird als weitere Reaktionsvariable der Zellertrag verwendet; diese Variable kann erforderlich sein, damit in manchen Ländern bestimmte maßgebliche Rechtsvorschriften erfüllt werden. Der Zellertrag wird definiert als Biomasse am Ende der Expositionsdauer abzüglich der Biomasse zu Beginn der Expositionsdauer. Aus dem in einer Reihe von Testlösungen erfassten Zellertrag wird die Konzentration berechnet, bei der sich eine spezifizierte Hemmung des Zellertrags (z. B. um 50 %) ergibt; diese Konzentration wird als E_yC_x angegeben (z. B. E_yC₅₀). Außerdem können die niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (LOEC) und die höchste geprüfte Konzentration ohne beobachtete schädliche Wirkung (NOEC) statistisch bestimmt werden.

1.5.

INFORMATIONEN ZUR PRÜFSUBSTANZ

Informationen zur Prüfsubstanz, die bei der Bestimmung der Prüfbedingungen hilfreich sein könnten, sind z. B. die Strukturformel, die Reinheit, die Lichtbeständigkeit, die Beständigkeit unter den Prüfbedingungen, das Lichtabsorptionsverhalten, pKa und die Ergebnisse von Transformationsstudien (u. a. die Ergebnisse von Studien zur biologischen Abbaubarkeit in Wasser). Die Wasserlöslichkeit, der Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient (P_ow) und der Dampfdruck der Prüfsubstanz sollten bekannt sein, eine validierte Methode zur Quantifizierung der Substanz in den Testlösungen mit bekannten Wiederfindungsraten und mit bekannter Nachweisgrenze sollte verfügbar sein.

1.6.

REFERENZSUBSTANZ

Um das Prüfverfahren zu testen, können Referenzsubstanzen wie z. B. das im internationalen Ringtest (4) verwendete 3,5-Dichlorphenol geprüft werden. Für Grünalgen kann auch Kaliumdichromat als Referenzsubstanz verwendet werden. Nach Möglichkeit sollten Referenzsubstanzen mindestens zweimal jährlich getestet werden.

1.7.

VALIDITÄT DES TESTS

Damit ein Test als gültig gewertet werden kann, sollten die folgenden Kriterien erfüllt sein:

—

Die Biomasse der Kontrollkulturen sollte binnen der 72-stündigen-Testdauer exponentiell um einen Faktor von mindestens 16 gewachsen sein. Dieses Wachstum entspricht einer spezifischen Wachstumsrate von 0,92 d^–1. Bei den am häufigsten verwendeten Arten ist die Wachstumsrate im Allgemeinen erheblich größer (siehe Anlage 1). Dieses Kriterium wird unter Umständen nicht erfüllt, wenn Arten verwendet werden, die langsamer wachsen als die in Anlage 1 genannten Arten. In diesem Fall sollte die Testdauer so verlängert werden, dass ein mindestens 16faches Wachstum der Kontrollkulturen gewährleistet ist; dabei muss das Wachstum während der gesamten Testdauer exponentiell erfolgen. Die Testdauer kann bis auf eine Mindestdauer von 48 Stunden verkürzt werden, damit während des Tests ein unbegrenztes exponentielles Wachstum aufrechterhalten wird; Voraussetzung ist jedoch, dass ein Multiplikationsfaktor von mindestens 16 erreicht wird.

—

Der mittlere Variationskoeffizient der abschnittsbezogenen spezifischen Wachstumsraten (Tage 0-1, 1-2 und 2-3 bei 72-stündigen Tests) der Kontrollkulturen (siehe Abschnitt 1.2 Absatz „Variationskoeffizient” ) darf maximal 35 % betragen. Zur Berechnung der abschnittsbezogenen spezifischen Wachstumsrate sind die Hinweise in Abschnitt 2.2.1 Absatz 2 zu beachten. Dieses Kriterium gilt für den mittleren Variationskoeffizienten, der für zur Wiederholung verwendete Kontrollkulturen berechnet wurde.

—

Der Variationskoeffizient der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsraten während der gesamten Testdauer darf bei den zur Wiederholung verwendeten Kontrollkulturen in Tests mit Pseudokirchneriella subcapitata und Desmodesmus subspicatus höchstens 7 % betragen. Bei weniger häufig in Tests verwendeten Arten sollte der Wert höchstens 10 % betragen.

1.8.

BESCHREIBUNG DER METHODE

1.8.1.

Apparatur

Testgefäße und sonstige Apparaturen, die mit den Testlösungen in Berührung kommen, sollten vollständig aus Glas oder einem sonstigen chemisch inerten Material bestehen. Die Komponenten sollten gründlich gespült werden, um sicherzustellen, dass keine organischen oder anorganischen Verunreinigungen das Algenwachstum oder die Zusammensetzung der Testlösungen beeinträchtigen können. Als Prüfgefäße kommen im Allgemeinen Glaskolben mit Abmessungen in Betracht, die während des Tests ein hinreichendes Kulturvolumen und einen hinreichenden CO₂-Transfer aus der Umgebungsluft gewährleisten (siehe Abschnitt 1.8.9 Absatz 2). Das Flüssigkeitsvolumen muss für analytische Bestimmungen hinreichend sein (siehe Abschnitt 1.8.11 Absatz 5). Außerdem werden unter Umständen die folgenden Geräte benötigt:

—

Kulturapparatur: Empfohlen werden ein Schrank oder eine Kammer, in dem bzw. in der die gewählte Inkubationstemperatur mit einer Toleranz von ±2 °C aufrechterhalten werden kann.

—

Lichtmessgeräte: Bei den Tests ist die Methode zur Messung der Lichtintensität zu protokollieren; insbesondere ist der für den Messwert maßgebliche Messkopftyp (Sensor) anzugeben. Die Messungen sollten vorzugsweise mit einem kugelförmigen (4 π)-Messkopf (der unmittelbar reagiert und Licht aus allen Winkeln über und unter der Messebene reflektiert) oder mit einem (2 π)-Messkopf gemessen werden (der auf Licht aus beliebigen Winkeln oberhalb der Geräteebene reagiert).

—

Apparatur zur Bestimmung der Biomasse der Algen: Der Zellgehalt als am häufigsten verwendeter Surrogatparameter für die Biomasse von Algen kann mit einem elektronischen Teilchenzähler, mit einem Mikroskop mit Zählkammer und mit einem Durchflusszytometer ermittelt werden. Weitere Surrogate für Biomassen können mit einem Durchflusszytometer, einem Fluorimeter, einem Spektrophotometer oder einem Farbmessgerät gemessen werden. Ein Umrechnungsfaktor, mit dem der Zellgehalt zum Trockengewicht in Beziehung gesetzt wird, kann Berechnungen erleichtern. Um mit einem Spektrophotometer verwertbare Messungen bei geringen Biomassekonzentrationen durchführen zu können, müssen unter Umständen Küvetten mit einem Strahlengang von mindestens 4 cm verwendet werden.

1.8.2.

Testorganismen

Für die Tests können mehrere Arten frei treibender Mikroalgen und Cyanobakterien verwendet werden. Die in Anlage 1 genannten Stämme haben sich für das in dieser Prüfmethode beschriebene Testverfahren als geeignet erwiesen. Wenn sonstige Arten verwendet werden, sollte der betreffende Stamm und/oder Ursprung angegeben werden. Außerdem ist sicherzustellen, dass das exponentielle Wachstum der ausgewählten Testalgen während der gesamten Testdauer unter den jeweiligen Bedingungen aufrechterhalten werden kann.

1.8.3.

Nährmedium

Als Nährmedien werden wahlweise das OECD-Medium und das AAP-Medium empfohlen. Die Zusammensetzungen dieser Medien sind Anlage 2 zu entnehmen. Beide Medien haben unterschiedliche pH-Ausgangswerte und unterschiedliche Pufferkapazitäten (zur Regulierung des pH-Anstiegs). Daher können die Testergebnisse je nach verwendetem Medium unterschiedlich ausfallen; dies gilt insbesondere für die Prüfung ionisierender Substanzen. Für bestimmte Zwecke muss unter Umständen das Nährmedium modifiziert werden (z. B. für die Prüfung von Metallen und Chelatbildnern oder für Prüfungen bei unterschiedlichen pH-Werten). Die Verwendung modifizierter Nährmedien ist im Einzelnen zu erläutern und zu begründen (3)(4).

1.8.4.

Biomasse-Ausgangskonzentration

Die Ausgangsbiomasse der Prüfkulturen muss bei allen Prüfkulturen identisch und so gering sein, dass während der Inkubationsdauer ein exponentielles Wachstum erzielt werden kann, ohne eine Erschöpfung des Nährmediums befürchten zu müssen. Die Ausgangsbiomasse sollte höchstens 0,5 mg/l Trockengewicht betragen. Folgende Ausgangs-Zellkonzentrationen werden empfohlen:

Pseudokirchneriella subcapitata:	5 × 103-104	Zellen/ml
Desmodesmus subspicatus	2-5 × 103	Zellen/ml
Navicula pelliculosa	104	Zellen/ml
Anabaena flos-aquae	104	Zellen/ml
Synechococcus leopoliensis	5 × 104-105	Zellen/ml

1.8.5.

Konzentrationen der Prüfsubstanz

Der Konzentrationsbereich, in dem wahrscheinlich Auswirkungen auftreten, kann aufgrund von Tests zur Bestimmung des Konzentrationsbereichs ermittelt werden. Für den definitiven Test sollten mindestens fünf Konzentrationen in einer geometrischen Reihe mit einem Faktor von höchstens 3,2 ausgewählt werden. Bei Prüfsubstanzen mit einer flacheren Konzentrations-Reaktionskurve kann ein höherer Faktor gerechtfertigt sein. Die Konzentrationsreihen sollten vorzugsweise einen Bereich abdecken, in dem das Algenwachstum um 5-75 % gehemmt wird.

1.8.6.

Wiederholungen und Kontrollen

Das Prüfprotokoll sollte für jede Testkonzentration drei Wiederholungen vorsehen. Wenn die NOEC nicht bestimmt werden muss, kann das Prüfprotokoll dahingehend geändert werden, dass die Anzahl der Konzentrationen erhöht und die Anzahl der Wiederholungen verringert wird. Es müssen mindestens drei Kontrollwiederholungen durchgeführt werden, im Idealfall die doppelte Anzahl der Wiederholungen für jede Testkonzentration. Für analytische Bestimmungen der Prüfsubstanzkonzentrationen kann eine eigene Reihe von Testlösungen hergestellt werden (siehe Abschnitt 1.8.11 Absätze 4 und 6). Wenn zur Auflösung der Prüfsubstanz ein Lösungsmittel verwendet wird, sind in das Prüfprotokoll weitere Kontrollen mit dem Lösungsmittel in der Konzentration einzubeziehen, die auch in den Prüfkulturen verwendet wird.

1.8.7.

Herstellung der Impfkultur

Um eine Anpassung der Testalgen an die Testbedingungen zu ermöglichen und um sicherzustellen, dass sich die Algen in der Phase des exponentiellen Wachstums befinden, wenn sie zur Impfung der Testlösungen verwendet werden, wird 2-4 Tage vor Testbeginn im Prüfmedium eine Impfkultur hergestellt. Die Algenbiomasse sollte so angepasst werden, dass ein exponentielles Wachstum der Impfkultur bis zum Testbeginn erfolgen kann. Die Impfkultur ist unter den gleichen Bedingungen wie die Prüfkulturen zu inkubieren. Die Zunahme der Biomasse der Impfkultur ist zu messen, um sicherzustellen, dass das Wachstum unter den gegebenen Kulturbedingungen für den jeweiligen Teststamm im normalen Bereich liegt. In Anlage 3 wird ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung einer Algenkultur beschrieben. Um gleichzeitige Zellteilungen während des Tests zu vermeiden, kann unter Umständen ein zweiter Schritt zur Vermehrung der Impfkultur erforderlich sein.

1.8.8.

Herstellung der Testlösungen

Alle Testlösungen müssen das Nährmedium und die Ausgangsbiomasse der Testalgen in denselben Konzentrationen enthalten. Die Testlösungen in den ausgewählten Konzentrationen werden gewöhnlich durch Mischen einer Stammlösung der Prüfsubstanz mit dem Nährmedium und der Impfkultur hergestellt. Stammlösungen werden im Allgemeinen durch Auflösung der betreffenden Substanz im Prüfmedium hergestellt. Wenn Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit zum Prüfmedium hinzugegeben werden sollen, können Lösungsmittel (z. B. Aceton, t-Butyl-Alkohol und Dimethylformamid) als Träger verwendet werden (2)(3). Die Lösungsmittelkonzentration sollte höchstens 100 µl/l betragen, und für alle Kulturen der Testreihen (einschließlich der Kontrollkulturen) sollte die gleiche Konzentration verwendet werden.

1.8.9.

Inkubation

Die Testgefäße sind mit luftdurchlässigen Stopfen zu versehen. Anschließend werden die Gefäße geschüttelt und in die Kulturapparatur gebracht. Während des Tests müssen die Algen suspendiert bleiben, und der CO₂-Transfer muss erleichtert werden. Dazu sollten die Gefäße ständig geschüttelt oder umgerührt werden. Die Temperatur der Kulturen sollte bei einer Toleranz von ±2 °C ständig auf 21 bis 24 °C geregelt werden. Bei anderen als den in Anlage 1 genannten Arten (z. B. bei tropischen Arten) sind unter Umständen höhere Temperaturen angemessen, wenn die Validitätskriterien erfüllt sind. Es wird empfohlen, die Kolben zufällig verteilt und täglich neu in den Inkubator einzusetzen. Der pH-Wert des Kontrollmediums darf während des Tests höchstens um 1,5 Einheiten ansteigen. Bei Metallen und Verbindungen, die bei pH-Werten etwa im Bereich der im Test verwendeten pH-Werte teilweise ionisieren, muss die pH-Verschiebung möglicherweise begrenzt werden, um reproduzierbare und gut definierte Ergebnisse zu erhalten. Eine Verschiebung des pH-Werts um < 0,5 ist technisch möglich und kann hervorgerufen werden, um einen angemessenen CO₂-Transfer aus der Umgebungsluft in die Testlösung zu erzielen (z. B. durch stärkeres Schütteln). Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verringerung des CO₂-Bedarfs durch Verringerung der Ausgangsbiomasse oder in einer Verkürzung der Testdauer. Die Oberfläche, auf der die Kulturen inkubiert werden, sollte kontinuierlich und gleichförmig fluoreszierend beleuchtet werden (z. B. mit den Lichtfarben kaltweiß ( „cool-white” ) oder Tageslicht ( „daylight” ). Algen- und Cyanobakterienstämme stellen unterschiedliche Anforderungen an die Lichtverhältnisse. Die Lichtintensität sollte entsprechend den verwendeten Testorganismen gewählt werden. Bei den empfohlenen Grünalgenarten ist die Lichtintensität auf der Höhe der Testlösungen im Bereich 60-120 µE · m^–2 · s^–1 zu wählen (bei Messung im photosynthetisch wirksamen Spektralbereich von 400-700 nm mit einem geeigneten Rezeptor). Einige Arten, insbesondere Anabaena flos-aquae, wachsen bei geringeren Lichtintensitäten und können durch größere Lichtintensitäten beschädigt werden. Bei diesen Arten sollte die durchschnittliche Lichtintensität im Bereich 40-60 µE · m^–2 · s^–1 liegen. (Bei in Lux kalibrierten Lichtmessgeräten entspricht der Bereich 4440-8880 lx für die Lichtfarbe „cool-white” etwa der empfohlenen Lichtintensität von 60-120 µE · m^–2 · s^–1) Die Lichtintensität darf um höchstens ±15 % von der durchschnittlichen Lichtintensität über dem Inkubationsbereich abweichen.

1.8.10.

Testdauer

Im Allgemeinen dauert der Test 72 Stunden. Allerdings sind auch kürzere oder längere Testzeiten möglich, sofern alle in Abschnitt 1.7 genannten Validitätskriterien eingehalten werden.

1.8.11.

Messungen und analytische Bestimmungen

Die Algenbiomasse in den einzelnen Kolben wird während der Testdauer mindestens einmal täglich überprüft. Wenn die Messungen an kleinen Volumina vorgenommen werden, die aus der Testlösung pipettiert wurden, sollten die betreffenden Volumina nicht ersetzt werden. Die Biomasse wird durch manuelle Zählung der Zellen unter dem Mikroskop oder mit einem elektronischen Teilchenzähler (Einstellung auf Zellgehalt und/oder Biovolumen) ermittelt. Alternative Verfahren wie z. B. die Messung mit einem Durchflusszytometer, in vitro und/oder in vivo durchgeführte Chlrorophyll-Fluoreszenzmessungen (6)(7), oder Messungen der optischen Dichte kommen in Betracht, wenn in dem für den jeweiligen Test maßgeblichen Biomassebereich eine befriedigende Korrelation mit der Biomasse nachgewiesen werden kann. Der pH-Wert der Lösungen wird am Anfang und am Ende des Tests gemessen. Wenn ein Analyseverfahren zur Bestimmung der Prüfsubstanz im maßgeblichen Konzentrationsbereich verfügbar ist, sollten die Testlösungen analysiert werden, um die Ausgangskonzentrationen und die Aufrechterhaltung der Expositionskonzentrationen während der Tests zu prüfen bzw. sicherzustellen. Die Analyse der Prüfsubstanzkonzentration am Anfang und am Ende des Tests bei einer niedrigen und einer hohen Testkonzentration sowie bei einer Konzentration im zu erwartenden EC₅₀-Bereich kann hinreichend sein, wenn anzunehmen ist, dass die Expositionskonzentrationen während des Tests um weniger als 20 % von den Nennwerten abweichen. Wenn die Konzentrationen eher nicht im Bereich von 80-120 % der Nennkonzentrationen bleiben werden, wird die Analyse sämtlicher Testkonzentrationen am Anfang und am Ende der Tests empfohlen. Bei flüchtigen, instabilen oder stark adsorbierenden Prüfsubstanzen werden während der Expositionsdauer weitere Probenahmen zur Durchführung von Analysen in Abständen von jeweils 24 Stunden empfohlen, um den Verlust der Prüfsubstanz besser bestimmen zu können. Bei diesen Substanzen werden zusätzliche Wiederholungen benötigt. In jedem Fall müssen die Prüfsubstanzkonzentrationen für alle Testkonzentrationen bei den Wiederholungen jeweils nur in einem Gefäß (bzw. in dem Gesamtinhalt aller Gefäße einer Wiederholung) bestimmt werden. Ausdrücklich für die Analyse von Expositionskonzentrationen während der Testdauer hergestellte Prüfmedien sollten auf die gleiche Weise behandelt werden, wie die für die Tests verwendeten Medien, d. h. die Medien sollten mit Algen geimpft und unter identischen Bedingungen inkubiert werden. Wenn eine Analyse der gelösten Prüfsubstanz erforderlich ist, müssen die Algen unter Umständen vom Medium getrennt werden. Die Trennung sollte vorzugsweise durch Zentrifugierung mit niedriger Beschleunigungskraft erfolgen, die eben noch hinreichend für die Ausfällung der Algen ist. Wenn nachgewiesen wird, dass die Konzentration der Prüfsubstanz während der gesamten Testdauer in befriedigender Weise im Bereich von ±20 % der Nennkonzentration oder der gemessenen Ausgangskonzentration aufrechterhalten werden konnte, können die Ergebnisse auch ausgehend von den Nennwerten bzw. von den gemessenen Ausgangswerten analysiert werden. Wenn die Abweichung von der Nennkonzentration oder von der gemessenen Ausgangskonzentration mehr als ±20 % beträgt, sollte bei der Analyse der Ergebnisse von der geometrischen mittleren Konzentration während der Expositionsdauer oder von Modellen ausgegangen werden, welche den Rückgang der Prüfsubstanzkonzentration beschreiben (3)(8). Der Test zur Hemmung des Algenwachstum ist ein dynamischeres Prüfsystem als die meisten sonstigen aquatischen Toxizitätstests mit kürzerer Testdauer. Entsprechend sind die tatsächlichen Expositionskonzentrationen unter Umständen schwer zu bestimmen; dies gilt besonders für adsorbierende Substanzen, die bei niedrigen Konzentrationen getestet werden. In diesen Fällen bedeutet das Verschwinden der Substanz aus der Lösung infolge der Adsorption in die zunehmende Algenbiomasse nicht, dass das Testsystem die Substanz „verliert” . Bei der Analyse des Testergebnisses sollte geprüft werden, ob ein Rückgang der Prüfsubstanzkonzentration im Laufe des Tests mit einer Abnahme der Wachstumshemmung einhergeht. Wenn dies der Fall ist, kann der Einsatz eines geeigneten Modells zur Beschreibung des Rückgangs der Prüfsubstanzkonzentration (8) in Betracht gezogen werden. Ansonsten ist es unter Umständen nicht angemessen, bei der Analyse der Ergebnisse von den Ausgangskonzentrationen (Nennkonzentrationen oder gemessenen Konzentrationen) auszugehen.

1.8.12.

Sonstige Beobachtungen

Durch Beobachtung unter dem Mikroskop sollte sichergestellt werden, dass die Impfkultur normal und gesund wirkt; außerdem können unter dem Mikroskop am Ende des Tests gegebenenfalls Auffälligkeiten an den Algen festgestellt werden (die z. B. auf die Einwirkung der Prüfsubstanz zurückzuführen sein könnten).

1.8.13.

Limit-Test

Unter gewissen Umständen, z. B. wenn ein vorläufiger Test darauf hindeutet, dass die Prüfsubstanz bei Konzentrationen bis zu 100 mg · l^–1 bzw. bis zur Löslichkeitsgrenze im Prüfmedium (maßgeblich ist die jeweils niedrigere Konzentration) keine toxische Wirkung hat, kann ein Limit-Test durchgeführt werden, in dem die Reaktionen einer Kontrollgruppe und einer Behandlungsgruppe (100 mg · l^–1 bzw. eine mit der Löslichkeitsgrenze identische Konzentration) verglichen werden. Es wird nachdrücklich empfohlen, diese Tests durch Analysen der Expositionskonzentration zu verifizieren. Alle oben beschriebenen Testbedingungen und Validitätskriterien gelten für Limit-Tests; allerdings sollten mindestens sechs Wiederholungen mit behandelten Proben durchgeführt werden. Die Reaktionsvariablen der Kontrollgruppe und der Behandlungsgruppe können mit einem statistischen Test zum Vergleich der Mittelwerte analysiert werden (z. B. mit einem Student-Test). Wenn die Varianzen der beiden Gruppen nicht übereinstimmen, sollte ein für nicht identische Varianzen angepasster t-Test (Student-Test) durchgeführt werden.

1.8.14.

Änderung für stark kolorierte Substanzen

Die Bestrahlung (Lichtintensität) sollte im obersten Ende des bei dieser Testmethode vorgeschriebenen Bereichs liegen: 120µE m^–2 s^–1 oder höher. Der Strahlengang sollte durch eine Verringerung des Volumens der Testlösungen (im Bereich von 5-25 ml) verkürzt werden. Es sollte (z. B. durch mäßiges Schütteln) für ausreichende Bewegung gesorgt werden, um zu gewährleisten, dass die Algen häufig einer hohen Bestrahlung an der Oberfläche der Kultur exponiert sind.

2.

DATEN

2.1.

GRAFISCHE DARSTELLUNG DER WACHSTUMSKURVEN

Die in den Prüfgefäßen enthaltene Biomasse kann in Einheiten des für die Messung verwendeten Surrogatparameters ausgedrückt werden (z. B. als Zellgehalt oder Fluoreszenz). Die geschätzte Biomassekonzentration der Prüfkulturen und der Kontrollkulturen ist zusammen mit den mindestens zu jeder vollen Stunde zu erfassenden Konzentrationen des Prüfmaterials und den Messzeitpunkten in Tabellen zusammenzustellen und für die Erstellung von Wachstumskurven zu verwenden. In diesem ersten Stadium können sowohl die logarithmischen Skalen als auch die linearen Skalen hilfreich sein; während der Testdauer sind jedoch die logarithmischen Skalen vorgeschrieben, die im Allgemeinen eine bessere Darstellung von Abweichungen der Wachstumsstrukturen ermöglichen. Bei exponentiellem Wachstum ergibt sich bezogen auf eine logarithmische Skala eine Gerade; die Steigung der Gerade gibt Aufschluss über die jeweilige Wachstumsrate. Anhand der Darstellungen ist sicherzustellen, dass die Kontrollkulturen während der gesamten Testdauer tatsächlich mit der erwarteten Geschwindigkeit exponentiell wachsen. Alle Datenpunkte sowie die Darstellungen sind kritisch zu überprüfen, und Ausgangsdaten und Verfahren sind auf mögliche Fehler zu kontrollieren. Insbesondere sind alle Datenpunkte zu prüfen, die aufgrund eines systematischen Fehlers abzuweichen scheinen. Wenn Verfahrensfehler zweifelsfrei festgestellt und/oder als sehr wahrscheinlich betrachtet werden können, wird der betreffende Datenpunkt als Ausreißer gekennzeichnet und nicht in die anschließende statistische Analyse einbezogen. (Eine Algenkonzentration von null in einem der beiden bzw. der drei für die Wiederholungen verwendeten Gefäße kann darauf hindeuten, dass das Gefäß nicht ordnungsgemäß geimpft oder nicht angemessen gereinigt wurde.) Die Gründe für den Ausschluss eines als Ausreißer eingestuften Datenpunkts sind im Prüfbericht genau anzugeben. Als Begründungen werden ausschließlich (selten) Verfahrensfehler, nicht aber einfach ungenaue Messungen anerkannt. Statistische Verfahren zur Bestimmung von Ausreißern sind bei dieser Art von Problemen von begrenztem Nutzen und können die Beurteilung durch Fachleute nicht ersetzen. Ausreißer (die als solche gekennzeichnet wurden) sollten vorzugsweise in den Datenpunkten verbleiben, die später in grafischen oder tabellarischen Darstellungen verwendet werden.

2.2.

REAKTIONSVARIABLEN

Mit der Prüfung sollen die Auswirkungen der Prüfsubstanz auf das Algenwachstum bestimmt werden. Diese Prüfmethode beschreibt zwei Reaktionsvariablen, da in den Mitgliedsländern unterschiedliche Präferenzen und rechtliche Anforderungen bestehen. Damit die Testergebnisse in allen Mitgliedsländern anerkannt werden können, sollten die Auswirkungen mit Hilfe der beiden im Folgenden beschriebenen Reaktionsvariablen a) und b) beurteilt werden.

a)

Durchschnittliche spezifische Wachstumsrate: Diese Reaktionsvariable wird ausgehend von der täglichen logarithmischen Zunahme der Biomasse während der Testdauer berechnet.

b)

Zellertrag: Diese Reaktionsvariable ergibt sich aus der Biomasse am Ende des Tests abzüglich der Biomasse bei Beginn des Tests.

Bei der Anwendung dieser Methode im Rahmen des Gemeinschaftsrechts sollte die Ergebnisberechnung aus den nachfolgend dargelegten Gründen auf einer durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate basieren. Es wird darauf hingewiesen, dass die mit diesen beiden Reaktionsvariablen berechneten Toxizitätswerte nicht vergleichbar sind; der entsprechende Unterschied muss bei der Verwendung der Testergebnisse berücksichtigt werden. Die mit der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate (E_rC_x) berechneten Werte für EC_x werden im Allgemeinen höher sein als die anhand des Zellertrags (E_yC_x) ermittelten Werte, wenn die für diese Testmethode vorgesehenen Bedingungen eingehalten werden; dies ist auf die unterschiedliche mathematische Grundlage der beiden Berechnungsverfahren zurückzuführen. Die auftretenden Unterschiede sollten jedoch nicht als Anzeichen für eine unterschiedliche Empfindlichkeit der beiden Reaktionsvariablen betrachtet werden; beide Werte sind einfach mathematisch verschieden. beide Werte sind einfach mathematisch verschieden. Das Konzept der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate beruht auf dem im Allgemeinen exponentiellen Verlauf des Algenwachstums bei nicht begrenzten Kulturen, bei denen die Toxizität aufgrund der Auswirkungen auf die Wachstumsrate geschätzt wird, ohne jedoch von der absoluten Höhe der jeweiligen Wachstumsrate der Kontrollprobe, von der Steigung der Konzentrations-Reaktionskurve oder von der Testdauer abhängig zu sein. Auf der Reaktionsvariable Zellertrag beruhende Ergebnisse hingegen hängen von allen übrigen genannten Variablen ab. E_yC_x ist von der spezifischen Wachstumsrate der in den einzelnen Tests verwendeten Algenarten sowie von der maximalen spezifischen Wachstumsrate abhängig, die je nach Art sowie sogar zwischen den einzelnen Algenstämmen unterschiedlich sein kann. Diese Reaktionsvariable sollte nicht verwendet werden, um die Empfindlichkeit von Algenarten oder auch nur verschiedener Algenstämme gegenüber Giftstoffen zu vergleichen. Die Verwendung der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate zur Schätzung der Toxizität wird in der Wissenschaft bevorzugt; bei dieser Prüfmethode werden jedoch auch Toxizitätsschätzungen aufgrund des Zellertrags berücksichtigt, um den derzeitigen rechtlichen Anforderungen einiger Länder Rechnung zu tragen.

2.2.1.

Durchschnittliche Wachstumsrate

Die durchschnittliche spezifische Wachstumsrate in einem bestimmten Zeitraum wird mit Hilfe der folgenden Formel als logarithmische Zunahme der Biomasse für die Gefäße mit den verschiedenen Kontrollproben und mit den behandelten Proben berechnet: μi-j = ln Xj – ln Xitj – ti(day^–1) wobei

µ_i-j:

durchschnittliche spezifische Wachstumsrate zwischen Zeitpunkt i und Zeitpunkt j;

X_i:

Biomasse zum Zeitpunkt i;

X_j:

Biomasse zum Zeitpunkt j.

Für jede Behandlungsgruppe und für jede Kontrollgruppe sind die mittlere Wachstumsrate sowie die Varianzschätzungen zu berechnen. Die durchschnittliche spezifische Wachstumsrate wird über die gesamte Testdauer (im Allgemeinen Tage 0-3) berechnet; dabei ist eher als ein gemessener Ausgangswert die geimpfte Nennbiomasse als Ausgangswert anzunehmen, da mit diesem Wert gewöhnlich eine höhere Genauigkeit erzielt wird. Wenn die zur Messung der Biomasse verwendete Ausrüstung eine hinreichend genaue Bestimmung der Biomasse mit dem geringen Inokulum zulässt (z. B. ein Durchflusszytometer), kann die gemessene Konzentration der Ausgangsbiomasse angenommen werden. Außerdem ist während der gesamten Testdauer (Tage 0-1, 1-2 und 2-3) die abschnittsbezogene Wachstumsrate als tägliche spezifische Wachstumsrate zu ermitteln und zu prüfen, ob das Wachstum der Kontrollgruppe konstant bleibt (siehe Gültigkeitskriterien, Abschnitt 1.7). Eine spezifische Wachstumsrate, die an einem bestimmten Tag signifikant niedriger ist als die durchschnittliche spezifische Gesamtwachstumsrate, kann Anzeichen für eine „Lag” -Phase sein. Bei den Kontrollkulturen kann eine „Lag” -Phase minimiert und praktisch ausgeschlossen werden, wenn die Vorkultur in geeigneter Weise vermehrt wird; bei den behandelten Kulturen hingegen kann eine „Lag” -Phase Anzeichen für eine Erholung nach anfänglicher toxischer Belastung oder Anzeichen für eine geringere Belastung infolge eines Verlustes der Prüfsubstanz (u. a. durch Sorption in die Algenbiomasse) nach der anfänglichen Behandlung sein. Entsprechend kann die abschnittsbezogene Wachstumsrate bewertet werden, um die Auswirkungen der Prüfsubstanz während der Expositionsdauer zu beurteilen. Erhebliche Unterschiede zwischen der abschnittsbezogenen Wachstumsrate und der durchschnittlichen Wachstumsrate deuten auf Abweichungen vom konstanten exponentiellen Wachstum hin und erfordern eine genaue Überprüfung der Wachstumskurven. Die prozentuale Hemmung der Wachstumsrate der einzelnen Wiederholungen mit behandelten Proben ist mit folgender Formel zu berechnen:%Ir = μC – μTμC × 100 wobei

%I_r:

Hemmung der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate in Prozent;

µ_C:

mittlere durchschnittliche spezifische Wachstumsrate (µ) der Kontrollgruppe;

µ_T:

durchschnittliche spezifische Wachstumsrate der Wiederholung mit einer behandelten Probe.

Wenn die Testlösungen mit Lösungsmitteln hergestellt werden, sollten eher die Kontrolllösungen mit dem Lösungsmittel als die Kontrolllösungen ohne das Lösungsmittel zur Berechnung der prozentualen Hemmung verwendet werden.

2.2.2.

Zellertrag

Der Zellertrag wird für alle Gefäße mit Kontrolllösungen und behandelten Lösungen als Biomasse bei Ende des Tests abzüglich der Biomasse am Anfang des Tests berechnet. Für die Testkonzentrationen und für die Kontrolllösungen ist jeweils ein mittlerer Zellertrag zu berechnen; die Varianzen sind jeweils zu schätzen. Die prozentuale Hemmung des Zellertrags (%I_y) kann für die Wiederholungen mit behandelten Proben wie folgt berechnet werden:%Iy = YC – YTYC × 100 wobei

% I_y:

prozentuale Hemmung des Zellertrags;

Y_C:

mittlerer Zellertrag der Kontrollgruppe;

Y_T:

Zellertrag der Wiederholung mit einer behandelten Probe.

2.3.

GRAFISCHE DARSTELLUNG DER KONZENTRATIONS-REAKTIONSKURVE

Die prozentuale Hemmung ist bezogen auf den Logarithmus der Prüfsubstanzkonzentration grafisch darzustellen und sorgfältig zu überprüfen; dabei sind alle Datenpunkte zu verwerfen, die in der ersten Phase als Ausreißer identifiziert wurden. Die Datenpunkte sind nach visueller oder rechnergestützter Interpolation zu einer gleichmäßigen Kurve zu verbinden, um einen ersten Eindruck von der Beziehung zwischen den verschiedenen Konzentrationen und Reaktionen zu erhalten. Anschließend ist mit einer differenzierteren Methode (vorzugsweise mit einer rechnergestützten statistischen Methode) fortzufahren. Abhängig von der beabsichtigten Verwendung der Daten, der Qualität (Genauigkeit) und dem Umfang der Daten sowie von der Verfügbarkeit von Werkzeugen zur Analyse der Daten kann (gelegentlich durchaus berechtigt) entschieden werden, die Datenanalyse in diesem Stadium zu beenden und einfach die wesentlichen Werte für EC₅₀ und EC₁₀ (und/oder EC₂₀) aus der nach visueller Interpolation erstellten Kurve abzulesen (siehe auch folgender Abschnitt zu stimulierenden Auswirkungen). Die folgenden Gründe können dafür sprechen, von der Verwendung einer statistischen Methode abzusehen:

—

Die Daten sind nicht geeignet, durch rechnergestützte Methoden zuverlässigere Ergebnisse zu ermitteln als durch die Beurteilung von Fachleuten. In diesen Fällen werden mit manchen Computer-Programmen unter Umständen keinerlei zuverlässige Ergebnisse erzielt (Wiederholungen stimmen nicht überein usw.).

—

Stimulierende Wachstumsreaktionen können mit verfügbaren Computer-Programmen nicht in angemessener Weise verarbeitet werden (siehe folgender Abschnitt).

2.4.

STATISTISCHE VERFAHREN

Ziel ist die Ermittlung einer quantitativen Konzentrations-Reaktionsbeziehung durch Regressionsanalyse. Im Anschluss an eine linearisierte Transformation der Reaktionsdaten (z. B. in Einheiten nach dem Probit-, Logit- oder Weibull-Modell) (9) kann eine gewichtete lineare Regression vorgenommen werden; nicht-lineare Regressionsverfahren, mit denen die unvermeidlichen Unregelmäßigkeiten der Daten und Abweichungen von gleichförmigen Verteilungen besser verarbeitet werden können, werden jedoch bevorzugt. Gegen null bzw. gegen die vollständige Hemmung können diese Unregelmäßigkeiten durch die Transformation vergrößert werden und die Analyse beeinträchtigen (9). Es wird darauf hingewiesen, dass Standard-Analysmethoden mit Probit-, Logit- oder Weibull-Transformationen für quantitative Daten (z. B. Mortalität oder Überlebensraten) vorgesehen sind und zur Verwendung in Verbindung mit Wachstums- oder Biomassedaten entsprechend modifiziert werden müssen. Spezifische Verfahren zur Bestimmung von EC_x-Werten aus kontinuierlichen Daten sind den Quellen (10)(11) and (12) zu entnehmen. In Anlage 4 wird der Einsatz nicht-linearer Regressionsanalysen näher erläutert. Für jede zu analysierende Reaktionsvariable sind aufgrund der Konzentrations-Reaktionsbeziehung Punktschätzungen für die EC_x-Werte zu ermitteln. Nach Möglichkeit sollten für jede Schätzung die 95%-Konfidenzintervalle bestimmt werden. Die Qualität der Übereinstimmung der Reaktionsdaten mit dem Regressionsmodell sollte grafisch oder statistisch bewertet werden. Die Regressionsanalyse sollte mit den Reaktionen der einzelnen Wiederholungen (und nicht mit den Mittelwerten der Behandlungsgruppe) durchgeführt werden. Wenn eine nicht-lineare Kurvenanpassung jedoch schwierig oder wegen zu großer Streuung der Daten nicht möglich ist, kann die Regression auch bezogen auf die Mittelwerte der Gruppe vorgenommen werden, um so auf einfache Weise die Auswirkungen erwarteter Ausreißer zu reduzieren. Wenn von dieser Möglichkeit Gebrauch gemacht wird, sollte dies im Prüfbericht als Abweichung vom normalen Verfahren vermerkt und darauf hingewiesen werden, dass mit Kurvenanpassungen der einzelnen Wiederholungen kein befriedigendes Ergebnis erzielt wurde. Schätzwerte für EC₅₀ und für die Konfidenzintervalle können auch durch lineare Interpolation mit einem Bootstrapping-Algorithmus (13) erzielt werden, wenn die verfügbaren Regressionsmodelle/-methoden für die betreffenden Daten nicht geeignet sind. Um die LOEC und entsprechend die NOEC zu schätzen sowie um die Auswirkungen der Prüfsubstanzen auf die Wachstumsrate zu ermitteln, müssen die Mittelwerte der behandelten Proben mit Varianzanalyseverfahren (ANOVA) verglichen werden. Der Mittelwert der einzelnen Konzentrationen ist dann mit einer geeigneten Methode zur Durchführung von Mehrfachvergleichen bzw. zur Durchführung von Trendtests mit dem Mittelwert der Kontrollgruppe zu vergleichen. Dunnett- und Williams-Tests können hilfreich sein (14)(15)(16)(17)(18). Die ANOVA-Annahme der Varianzhomogenität muss einer Überprüfung unterzogen werden. Die entsprechende Bewertung kann anhand einer grafischen Darstellung oder aufgrund eines formalen Tests vorgenommen werden (18). Geeignet sind Levene- und Bartlett-Tests. Wenn die Annahme der Varianzhomogenität nicht erfüllt ist, kann gelegentlich eine Korrektur durch logarithmische Datentransformation erfolgen. Bei außerordentlicher Varianzheterogenität, die durch Transformation nicht korrigiert werden kann, sollten Analysen durch Methoden wie z. B. Jonckheere-Trendtests (Stepdown) erwogen werden. Weitere Hinweise zur Bestimmung von NOEC-Werten sind Quelle (12) zu entnehmen. Aufgrund neuer Forschungsergebnisse wird empfohlen, das Konzept der NOEC aufzugeben und durch Punktschätzungen von EC_x-Werten zu ersetzen, die durch Regression ermittelt wurden. Für diesen Algentest wurde noch kein geeigneter Wert für x definiert. Ein Bereich von 10 bis 20 % scheint geeignet (abhängig von der auswählten Reaktionsvariable); vorzugsweise sollten sowohl EC₁₀ als auch EC₂₀ protokolliert werden.

2.5.

WACHSTUMSSTIMULATION

Gelegentlich wird bei niedrigen Konzentrationen eine Wachstumsstimulation (negative Hemmung) beobachtet. Diese Wachstumsstimulation kann entweder auf eine Hormesis ( „toxische Stimulation” ) oder darauf zurückzuführen sein, dass im verwendeten Minimalmedium mit dem zu prüfenden Material zusätzliche stimulierende Wachstumsfaktoren zum Tragen kommen. Die Zugabe anorganischer Nährstoffe sollte keinerlei unmittelbare Auswirkungen haben, weil das Prüfmedium während der gesamten Testdauer ohnehin überschüssige Nährstoffe enthalten sollte. Eine Stimulation mit niedriger Dosierung kann bei Berechnungen von EC₅₀ gewöhnlich übergangen werden, wenn die Stimulation nicht ungewöhnlich stark ist. Bei ungewöhnlich starker Stimulation oder wenn ein EC_x-Wert für einen niedrigen x-Wert berechnet werden soll, sind möglicherweise jedoch besondere Verfahrensweisen erforderlich. Die Löschung von Stimulationsreaktionen aus der Datenanalyse sollte nach Möglichkeit vermieden werden, und wenn die verfügbare Software zur Kurvenanpassung nicht in der Lage ist, geringere Stimulationen zu verarbeiten, kann eine lineare Interpolation mit einem Bootstrapping-Algorithmus vorgenommen werden. Bei ungewöhnlich starker Stimulation kann der Einsatz eines Hormesis-Modells erwogen werden (19).

2.6.

NICHT TOXISCHE WACHSTUMSHEMMUNG

Licht absorbierende Testmaterialien können zu einer Verringerung der Wachstumsrate führen, weil die Abdunklung den Anteil des verfügbaren Lichts verringert. Diese physikalischen Auswirkungen sollten durch geeignete Modifikation der Testbedingungen von toxischen Auswirkungen unterschieden und getrennt protokolliert werden. Entsprechende Hinweise sind den Quellen (2) und (3) zu entnehmen.

3.

ABSCHLUSSBERICHT

3.1.

PRÜFBERICHT

Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten: Prüfsubstanz:

—

physikalische Beschaffenheit und maßgebliche physikalisch-chemische Merkmale einschließlich der Wasserlöslichkeitsgrenze;

—

chemische Kenndaten einschließlich der Reinheit.

Im Test verwendete Art:

—

Stamm, Lieferant oder Herkunft und Kulturbedingungen.

Prüfbedingungen:

—

Datum des Testbeginns und Dauer des Tests;

—

Beschreibung des Prüfprotokolls: Prüfgefäße, Kulturvolumina, Biomassedichte am Beginn des Tests;

—

Zusammensetzung des Mediums;

—

Testkonzentrationen und Wiederholungen (z. B. Anzahl der Wiederholungen, Anzahl der Testkonzentrationen und verwendete geometrische Progression);

—

Beschreibung der Herstellung der Testlösungen, einschließlich Verwendung von Lösungsmitteln usw.;

—

Kulturapparatur;

—

Lichtintensität und Qualität (Herkunft, Homogenität);

—

Temperatur;

—

getestete Konzentrationen: nominale Testkonzentrationen sowie alle Ergebnisse der Analysen zur Bestimmung der Konzentration der Prüfsubstanz in den Prüfgefäßen; außerdem sollten die mit der Methode erzielte Wiederfindungsrate und die Quantifizierungsgrenze der Testmatrix angegeben werden;

—

sämtliche Abweichungen von dieser Prüfmethode;

—

Methode zur Bestimmung der Biomasse und Anzeichen für eine Korrelation zwischen dem gemessenen Parameter und dem Trockengewicht;

Ergebnisse:

—

pH-Werte am Beginn und am Ende des Tests bei allen Behandlungen;

—

Biomasse der einzelnen Kolben an allen Messpunkten und Methode zur Messung der Biomasse;

—

Wachstumskurven (grafische Darstellung der Biomasse in einem bestimmten Zeitraum);

—

berechnete Reaktionsvariablen für alle behandelten Wiederholungen mit Mittelwerten und dem Variationskoeffizienten für Wiederholungen;

—

grafische Darstellung der Beziehung zwischen Konzentration und Wirkung;

—

Schätzungen der Toxizität für die Reaktionsvariablen (z. B. EC₅₀, EC₁₀, EC₂₀) sowie entsprechende Konfidenzintervalle; wenn berechnet, sind die LOEC und die NOEC sowie die zur jeweiligen Berechnung verwendeten statistischen Methoden anzugeben;

—

bei Durchführung von Varianzanalysen (ANOVA) der Umfang der nachzuweisenden Auswirkungen (z. B. geringster signifikanter Unterschied);

—

jegliche in behandelten Proben festgestellte Wachstumsstimulation;

—

alle sonstigen beobachteten Auswirkungen (z. B. morphologische Änderungen der Algen);

—

Diskussion der Ergebnisse einschließlich aller Auswirkungen auf das Testergebnis, die auf Abweichungen von dieser Prüfmethode zurückzuführen sind.

4.

LITERATUR

1.

OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test.

2.

ISO 1998: Water quality — Guidance for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442.

3.

OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23.

4.

ISO 1998: Water quality — Sampling — Part 16: General Guidance for Biotesting. ISO 5667-16.

5.

ISO 1993: Water quality — Algal growth inhibition test. ISO 8692.

6.

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7.

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8.

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9.

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10.

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, S. 157-167.

11.

Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11, S. 1485-1494.

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13.

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15.

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Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

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