Leitlinien zur Präparation von Gewebeschnitten zur Geschlechtsbestimmung und zur Beurteilung des Stadiums der Gonadenentwicklung

In diesem Abschnitt werden die Verfahren vor der Untersuchung der histologischen Schnitte beschrieben. Alternativ können auch andere Verfahren verwendet werden, mit denen eine Geschlechtsbestimmung vorgenommen und das Stadium der Gonadenentwicklung festgestellt werden kann. Mit einigen wenigen Ausnahmen sind diese Verfahren bei Japanischen Reiskärpflingen (JMD = Japanische Medaka) und Zebrabärblingen (ZF = Zebrafish) ähnlich.

Tötung, Sektion und Gewebefixierung

Ziele:

1.

Gewährleistung einer schmerzlosen Tötung der Fische;

2.

Ermittlung der benötigten Körpergewichte und Durchführung der erforderlichen Messungen;

3.

Beurteilung sekundärer Geschlechtsmerkmale;

4.

Herstellung von Gewebesektionen für VTG-Analysen;

5.

Fixierung der Gonaden;

Verfahren:

1.

Die Fische sind unmittelbar vor der Sektion zu töten. Wenn nicht mehrere Prosektoren verfügbar sind, dürfen daher nicht mehrere Fische gleichzeitig getötet werden.

2.

Mit dem kleinen Kescher wird ein Fisch aus der Versuchskammer entnommen und in einem Transportbehältnis in den Sektionsbereich gebracht.

3.

Der Fisch wird in die Tötungslösung gesetzt. Wenn die Atmung zum Stillstand gekommen ist und der Fisch auf äußere Reize nicht mehr reagiert, wird der Fisch aus der Lösung genommen.

4.

Danach wird die Feuchtmasse des Fischs ermittelt.

5.

Für die Präparation der Gewebe zur VTG-Analyse kann der Fisch auf eine Korkplatte auf dem Tisch eines Präpariermikroskops gelegt werden.

a.

Bei Zebrabärblingen wird der Kopf unmittelbar hinter der Brustflosse und der Schwanz unmittelbar hinter der Rückenflosse abgeschnitten.

b.

Bei Japanischen Reiskärpflingen wird der Bauch mit einem sorgfältigen Schnitt entlang der Bauchmittellinie vom Schultergürtel bis zu einem Punkt unmittelbar kranial zum After aufgetrennt. Mit der kleinen Pinzette und mit einer kleinen Schere wird vorsichtig die Leber entnommen.

6.

Proben für die VTG-Analyse werden in Eppendorf-Röhrchen gegeben und umgehend in flüssigem Stickstoff gefroren.

7.

Der Fischkörper wird einschließlich der Gonaden in eine gekennzeichnete Gewebe-Kassette gelegt, die anschließend in eine Fixierlösung (Davidson oder Bouin) gestellt wird. Von der Fixierlösung wird mindestens das zehnfache Volumen des ungefähren Gewebevolumens benötigt. Das Behältnis mit der Fixierlösung wird fünf Sekunden lang vorsichtig geschüttelt, um Luftblasen vollständig aus der Kassette zu entfernen.

8.

a.

Alle Gewebe verbleiben über Nacht in der Davidson-Fixierlösung; am folgenden Tag werden sie in einzelne Behältnisse mit 10 %igem neutral gepuffertem Formalin gegeben. Die Behältnisse mit den Kassetten werden fünf Sekunden lang vorsichtig geschüttelt, um eine angemessene Durchdringung der Kassette mit dem Formalin sicherzustellen.

b.

Die Gewebe werden 24 h in der Bouin-Fixierlösung belassen; anschließend werden sie in 70 %iges Ethanol gelegt.

Präparation der Gewebe

Ziele:

1.

Dehydrieren der Gewebe, damit eine angemessene Durchdringung mit Paraffin ermöglicht wird;

2.

Imprägnieren der Gewebe mit Paraffin, um die Gewebe unversehrt zu konservieren und eine feste Oberfläche für die Mikrotomie zu schaffen;

Verfahren:

3.

Die gekennzeichneten Kassetten werden aus der Formalin-/Ethanol-Lösung genommen und in die Einbettungskörbe gesetzt. Diese werden in den Gewebeeinbetter gestellt.

4.

Danach wird das Einbettungsprogramm ausgewählt.

5.

Nach Abschluss des Einbettungsvorgangs können die Körbe im Aufbewahrungsbereich abgelegt werden.

Einbettung

Ziel:

Ordnungsgemäße Ausrichtung der Proben in verfestigtem Paraffin zur anschließenden Mikrotomie.

Verfahren:

1.

Die Körbe mit den Kassetten werden aus dem Gewebeeinbetter genommen und in die mit Paraffin gefüllte Frontkammer der Heizkonsole der Einbettungsstation oder separat in einen Paraffin-Erwärmer gestellt.

2.

Die erste einzubettende Kassette wird aus der Frontkammer der Heizkonsole des Paraffin-Erwärmers genommen. Der Deckel der Kassette wird geöffnet und entsorgt; die Kennzeichnung der Kassette wird mit den Daten des jeweiligen Tiers verglichen, um mögliche Diskrepanzen noch vor dem Einbetten festzustellen.

3.

Danach wird eine Einbettungsform mit geeigneter Größe ausgewählt.

4.

Die Form wird unter den Auslass der Gießkonsole gestellt und mit geschmolzenem Paraffin gefüllt.

5.

Danach wird die Probe aus der Kassette genommen und in die Form in das geschmolzene Paraffin gelegt. Dieser Vorgang wird für jede Paraffinform mit 4-8 Proben wiederholt. Die Fische werden so eingelegt, dass Fisch Nr. 1 im Winkel von 180° zu den Fischen 2-4/8 liegt.

6.

Anschließend wird weiteres Paraffin eingefüllt, bis die gesamte Probe abgedeckt ist.

7.

Die Form mit der Kassette wird auf die Abkühlplatte der Kryokonsole gestellt.

8.

Nach dem Aushärten des Paraffins wird der Block (d. h. das feste Paraffin mit den Geweben und mit der Kassette) aus der Form herausgenommen.

Mikrotomie

Ziel:

Herstellen und Aufziehen der Gewebeschnitte zur Beurteilung der Entwicklungsphasen.

Verfahren:

1.

Die Anfangsphase der Mikrotomie (Facing) gestaltet sich wie folgt:

a.

Der Paraffinblock wird in das Spannfutter des Mikrotoms gesetzt.

b.

Das Spannfutter wird durch Drehen des Mikrotomrads vorgeschoben, und aus der Paraffinfläche des Blocks werden dicke Schnitte abgetragen, bis das Messer zu den eingebetteten Geweben gelangt.

c.

Das Mikrotom wird auf eine Schnittstärke von 3-5 μm eingestellt. Anschließend wird das Futter vorgeschoben, und aus dem Block werden mehrere Schnitte hergestellt, um bei den Grobschnitten eventuell entstandene Verunreinigungen an der Schnittfläche des Gewebes zu entfernen.

d.

Danach kann der Block aus dem Spannfutter genommen und mit der Oberseite nach unten auf Eis gelegt werden, damit das Gewebe Feuchtigkeit aufnehmen kann.

2.

In der nächsten Phase der Mikrotomie werden die endgültigen Schnitte hergestellt und die Gewebeschnitte auf Objektträger aufgezogen. Diese Schritte werden wie folgt durchgeführt:

a.

Wenn der Block auf Eis gesetzt wurde, wird er heruntergenommen und wieder in das Futter des Mikrotoms gespannt.

b.

Nachdem das Mikrotom auf eine Schnittstärke von 3-5 μm eingestellt wurde, wird das Spannfutter durch Drehen des Mikrotomrads vorgeschoben. Von dem Block werden Schnitte abgetragen, bis ein Schnittband mit mindestens einem annehmbaren Schnitt einschließlich der Gonaden vorliegt. (Während des Schneidvorgangs kann der Block aus dem Spannfutter genommen und erneut auf Eis gesetzt werden, damit das Gewebe die Feuchtigkeit aufnehmen kann; anschließend wird der Block wieder in das Mikrotom gespannt.)

c.

Die Schnitte schwimmen im Wasserbad flach auf der Wasseroberfläche auf. Es wird versucht, mindestens einen Schnitt ohne Falten und ohne eingeschlossene Luftblasen zu erhalten.

d.

Unter den besten Schnitt wird ein Objektträger geschoben, um den Schnitt dann mit dem Objektträger aus dem Wasser zu heben. Dieser Schritt wird als „Aufziehen” des Schnitts bezeichnet.

e.

Für die Proben eines Fischs werden jeweils drei Schnitte angefertigt. Der zweite und der dritte Schnitt werden in Abständen von 50 μm vom ersten Schnitt angesetzt. Wenn die Fische nicht mit den Gonaden auf derselben Schnittebene eingebettet wurden, müssen mehrere Schnitte angefertigt werden, um sicherzustellen, dass von jedem Fisch mindestens sechs Schnitte mit den Gonaden verfügbar sind.

f.

Mit einem Folienstift wird auf dem Objektträger die Nummer des Blocks notiert, aus dem der Schnitt stammt.

g.

Danach wird der Objektträger in ein Färbegestell gesetzt.

h.

Nun wird der Block aus dem Spannfutter genommen und zur Lagerung mit der Oberseite nach unten gedreht.

Färben, Eindecken und Kennzeichnen der Objektträger

Ziele:

—

Färben der Schnitte zur histopathologischen Untersuchung;

—

Permanentversiegeln der aufgezogenen und gefärbten Gewebe;

—

Permanente Kennzeichnung der gefärbten Schnitte, um eine uneingeschränkte Rückverfolgbarkeit zu gewährleisten;

Verfahren:

1.

Färben

a.

Die Objektträger werden vor dem Färben über Nacht an der Luft getrocknet.

b.

Zur Färbung der Schnitte wird Hematoxylin-Eosin verwendet.

2.

Eindecken

a.

Die Deckel können von Hand oder automatisch aufgesetzt werden.

b.

Die Objektträger werden in Xylol oder TissueClear getaucht; anschließend wird das überschüssige Xylol/TissueClear vorsichtig abgeklopft.

c.

Zum Ende des Objektträgers hin werden auf die der gefrorenen Seite gegenüberliegende Seite oder auf das Deckglas etwa 0,1 ml Eindeckmedium gegeben.

d.

Das Deckglas wird in spitzem Winkel gekippt auf den Objektträger aufgesetzt.

3.

Kennzeichnung

a.

Die Objektträger müssen jeweils mit folgenden Informationen gekennzeichnet werden:

i.

Name des Labors

ii.

Arten

iii.

Proben-Nr. / Objektträger-Nr.

iv.

Chemikalie / Behandlungsgruppe

v.

Datum