FALSCH POSITIVE: BEWERTUNG VON NICHT DURCH REZEPTOREN VERMITTELTEN LUMINISZENZSIGNALEN

1.

Falsch positive Ergebnisse beim ER-Agonisten-Assay können auf eine nicht durch ER vermittelte Aktivierung des Luciferase-Gens, auf eine direkte Aktivierung des Genprodukts oder eine sonstige Fluoreszenz zurückzuführen sein. Diese Wirkungen äußern sich in einer unvollständigen oder ungewöhnlichen Dosis-Reaktions-Kurve. Wenn solche Effekte vermutet werden, sollte der Effekt eines ER-Antagonisten (z. B. 4-Hydroxytamoxifen (OHT) in einer nicht toxischen Konzentration) auf die Reaktion untersucht werden. Der reine Antagonist ICI 182780 ist für diesen Zweck möglicherweise nicht geeignet, da eine hinreichende Konzentration von ICI 182780 eine Reduzierung des VK-Werts bewirken kann und da dies die Datenanalyse beeinträchtigt.

2.

Um die Validität dieses Ansatzes sicherzustellen, sollten auf derselben Platte die folgenden Parameter geprüft werden:

—

Agonisten-Aktivität der unbekannten Chemikalie mit/ohne 10 μM OHT,

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VK (dreifach),

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OHT (dreifach),

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1 nM E2 (dreifach) als Agonisten-PK und

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1 nM E2 + OHT (dreifach).

Kriterien für die Auswertung von Daten

Hinweis: Alle Wells sollten mit dem Vehikel in der gleichen Konzentration behandelt werden.

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Wenn die Agonisten-Aktivität der unbekannten Chemikalie durch die Behandlung mit dem ER-Antagonisten NICHT beeinträchtigt wird, ist sie als „negativ” einzustufen.

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Wird die Agonisten-Aktivität der unbekannten Chemikalie vollständig gehemmt, sind die Entscheidungskriterien zu berücksichtigen.

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Ist die Agonisten-Aktivität bei der niedrigsten Konzentration größer oder gleich der Reaktion bei PC10 ist, wird die unbekannte Chemikalie mindestens in der Größenordnung der Reaktion bei PC10 gehemmt. Die Differenz der Reaktionen zwischen den nicht behandelten und den mit dem ER-Antagonisten behandelten Wells wird berechnet. Diese Differenz ist als tatsächliche Reaktion zu betrachten und sollte zur Berechnung der betreffenden Parameter verwendet werden, damit über die Einstufung entschieden werden kann.

Analyse der Messdaten

Der Leistungsstandard wird geprüft. Der VK zwischen unter gleichen Bedingungen behandelten Wells wird geprüft.

1.

Der Mittelwert der VK wird berechnet.

2.

Vom Wert der einzelnen nicht mit OHT behandelten Wells wird der Mittelwert der VK abgezogen.

3.

Der OHT-Mittelwert wird berechnet.

4.

Vom Wert der einzelnen mit OHT behandelten Wells wird der Mittelwert der VK abgezogen.

5.

Der Mittelwert der PK wird berechnet.

6.

Die relative transkriptionelle Aktivität aller übrigen Wells wird bezogen auf die PK berechnet.