1.

Zweck und Anwendungsbereich

a)

Die Methode ermöglicht die Bestimmung des Gehalts in Gewichtshundertteilen an Stärke und ihren Abbauprodukten einschließlich Glucose ( „Stärke” ).

b)

Als Gehalt an „Stärke” in Gewichtshundertteilen gilt der Wert E, wie er in Ziffer 6 der vorliegenden Methode errechnet wird.

2.

Prinzip

Die Probe wird mit Natriumhydroxid aufgeschlossen und die „Stärke” mit Amyloglucosidase in Glucose gespalten. Die Glucose wird enzymatisch bestimmt.

3.

Reagenzien

Es ist bidestilliertes Wasser zu verwenden.

3.1. Natriumhydroxid-Lösung, c = 0,5 mol/l.

3.2. Essigsäure (Eisessig), mindestens 96 % mas.

3.3. Enzymlösung: Unmittelbar vor Gebrauch ca. 10 mg Amyloglucosidase (EC 3.2.1.3) (6 U/mg) in 1 ml Wasser auflösen⁽¹⁾.

3.4. Triethanolaminpuffer: 14,0 g Triethanolaminhydrochlorid (Tris(2-hydroxyethyl)ammoniumchlorid) und 0,25 g Magnesiumsulfat (MgSO₄7H₂O) in 80 ml Wasser lösen, ca. 5 ml NaOH (c = 5 mol/l) zusetzen und pH mit NaOH (c = 1 mol/l) auf 7,6 einstellen und mit Wasser auf 100 ml auffüllen. Der Puffer ist bei + 4 °C mindestens 4 Wochen haltbar.

3.5. NADP (Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat-dinatriumsalz)-Lösung: 60 mg NADP in 6 ml Wasser lösen. Diese Lösung ist bei + 4 °C mindestens 4 Wochen haltbar.

3.6. ATP (Adenosin-5-triphosphat-dinatriumsalz)-Lösung: 300 mg ATP 3H₂O und 300 mg Natriumhydrogencarbonat (NaHCO₃) in 6 ml Wasser lösen. Diese Lösung ist bei + 4 °C mindestens 4 Wochen haltbar.

3.7. HK/G6P-DH (Hexokinase — EC 2.7.1.1)- und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase — (EC 1.1.1.49)-Suspension: 280 U HK und 140 U G6P-DH in 1 ml Ammoniumsulfatlösung (c = 3,2 mol/l) suspendieren. Diese Suspension ist bei + 4 °C mindestens ein Jahr haltbar.

4.

Geräte

4.1. Magnetrührer-Thermostat (60 °C).

4.2. Magnetrührer.

4.3. UV-Spektrophotometer mit Küvette von 1 cm Schichtdicke.

4.4. Pipetten für die enzymatische Analyse.

5.

Verfahren

5.1.

Aufschluß mit Natriumhydroxid und enzymatische Hydrolyse der Stärke und ihrer Abbauprodukte:

5.1.1. Je nach dem erwarteten Gehalt an „Stärke” ist eine der nachstehenden Einwaagen zu wählen (der „Stärkegehalt” darf 0,4 g je Einwaage nicht überschreiten):

Erwarteter „Stärkegehalt” des Erzeugnisses in g/100 g	Ungefähre Einwaage (p) in g	Inhalt des Meßkolbens in ml	Faktor (f) der Verdünnung zu einem Liter
> 70	0,35-0,4	500	2
20-70	max. 0,5	500	2
5-20	max. 1	250	4
< 5	max. 2	200	5

5.1.2. Probe auf 0,1 mg genau einwägen.

5.1.3. Mit 50 ml Natriumhydroxidlösung (c = 0,5 mol/l) (3.1) versetzen und 30 Minuten unter ständigem Rühren im Magnetrührer-Thermostaten (4.1) bei 60 °C belassen.

5.1.4. Mit wenig Essigsäure (3.2) pH auf 4,6 bis 4,8 einstellen.

5.1.5. In den Magnetrührer-Thermostaten (4.1) (60 °C) stellen, 1 ml Enzymlösung (3.3) zusetzen und 30 Minuten unter Rühren inkubieren.

5.1.6. Nach dem Abkühlen quantitativ in einen geeichten Meßkolben (5.1.1) überführen und mit Wasser bis zur Marke auffüllen.

5.1.7. Falls erforderlich, durch ein Faltenfilter filtrieren (Siehe Bemerkungen unter Ziffer 1).

5.2.

Bestimmung der Glucose:

5.2.1. Die Probelösung muß 100 bis 1000 mg Glucose je Liter enthalten, was einem ΔΕ₃₄₀ zwischen 0,1 und 1,0 entspricht. Die Extinktion (E₃₄₀) einer Verdünnung von einem Teil Probelösung mit 30 Teilen Wasser darf, gegen Luft gemessen, 0,4 nicht überschreiten.

5.2.2. Pufferlösung (3.4) auf Raumtemperatur (20 °C) bringen.

5.2.3. Die Temperatur der Reagenzien und der Probelösung muß im Zeitpunkt der Messung 20 °C bis 25 °C betragen.

5.2.4. Extinktion bei 340 nm gegen Luft messen (keine Küvette im Referenzstrahl).

5.2.5. Durchführung der Messung nach dem folgenden Pipettierschema:

In die Küvetten pipettieren	Leerwert (ml)	Probe (ml)
Puffer (3.4)	1,00	1,00
NADP (3.5)	0,10	0,10
ATP (3.6)	0,10	0,10
Probelösung (5.1.6 oder 5.1.7)	—	0,10
Wasser	2,00	1,90
Mischen. Nach ca. 3 Minuten Extinktion der Lösungen messen (E1). Auslösen der Reaktion durch Zugabe von:
HK/G6P-DH (3.7)	0,02	0,02
Mischen. Ende der Reaktion abwarten (ca. 15 Minuten) und Extinktion der Lösungen messen (E2). Falls die Reaktion nach 15 Minuten nicht zum Stillstand gekommen ist, Extinktionen weiter in 5-Minuten-Abständen messen, bis eine konstante Extinktionszunahme in 5 Minuten erreicht ist. Wurden bei E2 konstante Extinktionszunahmen festgestellt, sind die Extinktionen auf den Zeitpunkt der Zugabe der Enzymsuspension (3.7) zu extrapolieren (Siehe Bemerkungen unter Ziffer 2).

5.2.6. Für Reagentienleerwert und Probe berechnet man die Extinktionsdifferenz E₂ — E₁. Die Extinktionsdifferenz des Leerwerts ist von derjenigen der Probe abzuziehen (= ΔΕ): ΔΕ₃₄₀ = ΔΕ _Probe - ΔΕ _{Reagentienleerwert} Daraus ergibt sich der Gehalt Gl der Probelösung an Glucose: Glucosegehalt Gl in g/l Probelösung Gl = 3,22 × 180,166,3 × 1 × 0,1 × 1000 × ΔΕ340 = 0,921 × ΔΕ340 (3,22 = Volumen Meßlösung (ml); 1 = Schichtdicke der Küvette, hier 1 cm; 0,1 = Volumen der Probelösung (ml); Molare Masse der Glucose 180,16 g/mol)

5.2.7. Wenn die Messung bei 365 nm oder 334 nm durchgeführt wird, ist statt des Werts 6,3 in der Formel der Ziffer 5.2.6 der Wert 3,5 bzw. 6,18 zu verwenden.

6.

Berechnung des Gehalts an „Stärke” E bzw. an „Glucose” Z

a)

Gehalt an „Stärke” in g/100 g:

E = 100 × 0,9 × Glp × f

b)

Gehalt an „Glucose” in g/100 g:

Z = 100 × Glp × f

In diesen Formeln bedeuten:

Gl=

Glucosegehalt, in g/l (5.2.6);

f=

Verdünnungsfaktor (5.1.1);

p=

Einwaage in g;

0,9=

Umrechnungsfaktor von Glucose in Stärke.

Bemerkungen

1.

Falls die Lösung nicht filtrierbar ist, ergreift der Chemiker die erforderlichen Maßnahmen.

2.

Stellt man fest, daß die Enzyme inhibiert werden, so wird empfohlen, mittels Zugabe bekannter Mengen an nativer Stärke einen Faktor für den Grad der Störung zu ermitteln.