KAPILLARGASCHROMATOGRAFISCHE BESTIMMUNG DES WACHSGEHALTS

1.

GEGENSTAND

Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des Wachsgehalts von Olivenölen. Die Wachse werden nach der Zahl der Kohlenstoffatome getrennt. Das Verfahren kann insbesondere zur Unterscheidung zwischen abgepresstem und extrahiertem Olivenöl (Oliventresteröl) verwendet werden.

2.

PRINZIP

Das Fett wird mit einem geeigneten internen Standard versetzt und chromatografisch über eine Kieselgelsäule fraktioniert; die unter Versuchsbedingungen zuerst eluierte Fraktion (schwächerer Polarität als Triglyceride) wird gesammelt und sofort kapillargaschromatografisch analysiert.

3.

GERÄTE

3.1. Erlenmeyerkolben, 25 ml

3.2. Glassäule für Gaschromatografie, Innendurchmesser 15,0 mm, Länge 30—40 cm, mit Hahn

3.3. Gaschromatograf, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen, mit Direkteinspritzung, bestehend aus:

3.3.1. Säulenofen mit Temperaturprogrammierung

3.3.2. Kalteinspritzsystem zur Direktaufgabe der Probe auf die Säule

3.3.3. Flammenionisationsdetektor mit Verstärker

3.3.4. Integrator mit Schreiber, mit Verstärker (3.3.3) zu koppeln, Ansprechzeit max. 1 Sekunde, variabler Papiervorschub. (Es können auch Informatiksysteme verwendet werden, bei denen die GC-Daten mittels PC erfasst werden.)

3.3.5. Glaskapillarsäule oder Fused-silica-Säule, Länge 8—12 m, Innendurchmesser 0,25—0,32 mm, Innenwand belegt mit Trennflüssigkeit, gleichmäßige Schichtdicke zwischen 0,10 und 0,30 μm. (Geeignete Trennflüssigkeiten vom Typ SE 52 oder SE 54 sind im Handel erhältlich.)

3.4. Mikroliterspritze, 10 μl, zur Direkteinspritzung in die Säule, mit gehärteter Nadel

3.5. Elektrorührwerk

3.6. Rotationsverdampfer

3.7. Muffelofen

3.8. Analysenwaage mit einer Messgenauigkeit von + 0,1 mg

3.9. Übliche Laborgeräte.

4.

REAGENZIEN

4.1. Kieselgel mit einer Korngröße zwischen 60 und 200 μm Das Kieselgel wird im Muffelofen vier Stunden auf eine Temperatur von 500 °C erhitzt und nach dem Abkühlen mit 2 % Wasser, bezogen auf die betreffende Menge Kieselgel, versetzt. Durch gründliches Schütteln homogenisieren. Vor Gebrauch mindestens 12 Stunden im Dunkeln aufbewahren.

4.2. n-Hexan, zur Chromatografie

4.3. Ethylether, zur Chromatografie

4.4. n-Heptan, zur Chromatografie

4.5. Standardlösung aus Laurylarachidat 0,1 % (m/V) in Hexan (interner Standard) (Es kann auch Palmitylpalmitat oder Myristylstearat verwendet werden.)

4.5.1. Sudan 1 (1-Pheny-azo-2-naphthol)

4.6. Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, zur Gaschromatografie

4.7. Hilfsgase

—

Wasserstoff, rein, zur Gaschromatografie

—

Luft, rein, zur Gaschromatografie

5.

VERFAHREN

5.1.

Vorbereiten der Chromatografiesäule

15 g Kieselgel (4.1) werden in n-Hexan (4.2) suspendiert und in die Säule (3.2) aufgegeben. Nach der Spontansedimentation wird die Phase mit einem Elektrorührwerk (3.5) nachbehandelt, um eine möglichst homogene Chromatografieschicht zu erzielen, und zur Entfernung etwa enthaltener Verunreinigungen wird mit 30 ml n-Hexan gespült. Genau 500 mg der Probe werden mithilfe der Waage (3.8) in den 25-ml-Erlenmeyerkolben (3.1) eingewogen und entsprechend dem vermuteten Wachsgehalt mit der geeigneten Menge interner Standardlösung (4.5) versetzt. So werden z. B. bei Olivenöl 0,1 mg Laurylarachidat und bei Oliventresteröl 0,25 bis 0,5 mg zugesetzt. Die derart gewonnene Probe wird unter Verwendung von je zwei Teilen 2 ml n-Hexan (4.2) in die Chromatografiesäule überführt. Das Lösungsmittel bis zu einem Stand von 1 mm über der oberen Absorbensgrenzfläche ablaufen lassen und dann zur Entfernung der natürlich enthaltenen n-Alkane noch mit 70 ml n-Hexan spülen. Mit der chromatografischen Elution beginnen und 180 ml des n-Hexan/Ethylether-Gemischs, Verhältnis 99:1, bei einem Durchsatz von etwa 15 Tropfen/10 Sekunden auffangen. Die Elution der Probe ist bei einer Umgebungstemperatur von 22 ± 4 °C durchzuführen.

Anmerkungen:

—

Das n-Hexan/Ethylethergemisch (99:1) muss jeden Tag frisch zubereitet werden.

—

Für eine visuelle Kontrolle der Elution der Wachse können der gelösten Probe 100 μl Sudan (1 % im Elutionsmittel) zugesetzt werden. Die Retentionszeit des Farbstoffs liegt zwischen derjenigen der Wachse und derjenigen der Triglyceride. Wenn die Färbung das Ende der Säule erreicht, sind daher alle Wachse eluiert und die Elution kann beendet werden.

Die derart gewonnene Fraktion wird im Rotationsverdampfer (3.6) so lange getrocknet, bis das Lösungsmittel nahezu restlos verdampft ist, wobei die letzten 2 ml im schwachen Stickstoffstrom abgeblasen werden; der Trocknungsrückstand wird mit 2—4 ml n-Heptan versetzt.

5.2.

Gaschromatografische Analyse

5.2.1.

Vorarbeiten

Die Säule in den Gaschromatografen (3.3) einsetzen, wobei der Säulenanfang an das On-column-System und das Säulenende an den Detektor angeschlossen wird. Sodann ist der Gaschromatograf auf Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des Detektors und des Schreibers usw. zu überprüfen. Wird die Säule zum ersten Mal verwendet, wird empfohlen, sie einzufahren. Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromatografen einschalten und allmählich über einen Zeitraum von etwa 4 Stunden auf eine Temperatur von 350 °C aufheizen. Die Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten; sodann sind die Analysebedingungen einzustellen (Gasstrom, Zünden der Flamme, Anschluss an den elektronischen Schreiber (3.3.4), Temperatur des Säulenofens, des Detektors usw.). Anschließend das Signal mit einer Empfindlichkeit aufzeichnen, die mindestens doppelt so groß ist wie bei Durchführung der Analyse. Die Grundlinie muss linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift. Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluss der Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule hin.

5.2.2.

Wahl der Arbeitsbedingungen

Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:

—

Säulentemperatur:

	20 °C/Min.		5 °C/Min.		20 °C/Min.
Ausgangstemperatur 80 °C (1′)	→	240 °C	→	325 °C (6′)	→	340 °C (10′)

—

Detektortemperatur: 350 °C

—

Einspritzvolumen: 1 μl der n-Heptanlösung (2—4 ml)

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Trägergas: Helium oder Wasserstoff mit der für das gewählte Gas optimalen linearen Strömungsgeschwindigkeit (vgl. Anlage)

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Geräteempfindlichkeit, die den nachstehenden Bedingungen genügt:

Diese Bedingungen können je nach Beschaffenheit der Säule und des Gaschromatografen abgewandelt werden, damit eine Trennung aller Wachse und eine ausreichende Auflösung der Peaks (siehe Abbildung) erzielt werden. Die Retentionszeit des internen Standards C₃₂ muss 18 ± 3 Minuten betragen, und der größte Wachspeak muss mindestens 60 % des Vollausschlags erreichen. Die Parameter für die Peakintegration sind so zu wählen, dass für die in Betracht kommenden Peaks korrekte Werte erzielt werden.

Anmerkung:In Anbetracht der hohen Endtemperatur ist eine positive Drift von höchstens 10 % der Skala zulässig.

5.3.

Durchführung der Analyse

Mit der 10-μl-Spritze 1 μl Probelösung aufziehen und dabei den Kolben der Spritze so weit einziehen, dass die Nadel leer ist. Die Nadel in das Einspritzsystem einführen, nach 1—2 Sekunden schnell einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam herausziehen. Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle vorhandenen Wachse eluiert sind. Die Grundlinie muss stets den vorgeschriebenen Anforderungen genügen.

5.4.

Identifizierung der Peaks

Die Peaks werden anhand der Retentionszeiten durch Vergleich mit Wachsgemischen identifiziert, deren Retentionszeiten bekannt sind und die unter denselben Bedingungen analysiert wurden. Die Abbildung zeigt ein Chromatogramm der Wachsfraktion eines nativen Olivenöls.

5.5.

Quantitative Bestimmung

Die Peakflächen des internen Standards und der aliphatischen C₄₀- bis C₄₆-Ester werden mithilfe eines Integrators ermittelt. Der Wachsgehalt jedes einzelnen Esters in mg/kg Fett wird nach folgender Formel berechnet:Ester, mgkgAx ms1000As m Dabei ist:

A_x=

jeweilige Ester-Peakfläche, in mm²

A_s=

die Peakfläche des internen Standards, in mm²

m_s=

das Gewicht des zugegebenen internen Standards, in mg

m=

Masse der zur Bestimmung entnommenen Probe in g.

6.

DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

Die Summe der Gehalte an den einzelnen Wachsen von C₄₀ bis C₄₆ wird in mg/kg Fett (ppm) angegeben.

AnmerkungDie mengenmäßig zu bestimmenden Bestandteile sind an den Peaks der Ester mit gerader Kohlenstoffzahl von C₄₀ bis C₄₆ abzulesen, wie als Beispiel im nachstehenden Chromatogramm der Wachse von Olivenöl dargestellt. Wenn der C₄₆-Ester doppelt erscheint, ist zur Identifizierung die Wachsfraktion eines Oliventresteröls zu analysieren, bei dem der C₄₆-Peak deutlich überwiegt und daher leicht zu erkennen ist.

Die Ergebnisse werden mit einer Dezimalstelle angegeben.

Abbildung