BESTIMMUNG DER ZUSAMMENSETZUNG UND DES GEHALTS AN STERINEN UND TRITERPEN-DIALKOHOLEN MIT DER KAPILLAR - GASCHROMATOGRAPHIE

1.

UMFANG UND ANWENDUNGSBEREICH

Diese Methode beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Sterinzusammensetzung und des Steringehalts sowie des Gehalts an Triterpen-Dialkoholen von Olivenölen und Oliventresterölen.

2.

KURZBESCHREIBUNG

Das Öl wird mit α-Cholestanol als innerem Standard versetzt, mit ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift und das Unverseifbare mit Ethylether extrahiert. Die Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Fraktion wird dünnschichtchromatographisch über basische Kieselgelplatten vom Unverseifbaren abgetrennt. Die aus dem Kieselgel isolierten Fraktionen werden in Trimethylsilylether überführt und anschließend mit Hilfe der Kapillar-Gaschromatographie untersucht.

3.

GERÄTE UND HILFSMITTEL

Übliche Laboreinrichtung und insbesondere nachstehende Geräte:

3.1.

Kolben, 250 ml, mit Rückflusskühler und Schliffstopfen,

3.2.

Scheidetrichter, 500 ml,

3.3.

Kolben, 250 ml,

3.4.

komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glasplatten 20 × 20 cm,

3.5.

UV-Lampe, Wellenlänge 254 oder 366 nm,

3.6.

Mikroliterspritzen, 100 und 500 μl,

3.7.

Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15-40 μm), etwa 2 cm Durchmesser, 5 cm Höhe, geeignet für die Vakuumfiltration mit Schliffmuffe,

3.8.

Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe, für Glasfiltertiegel (Nummer 3.7),

3.9.

10-ml-Röhrchen mit konischem Boden und dicht schließendem Glasstopfen,

3.10.

Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen, mit Splitsystem, bestehend aus:

3.10.1.

einem thermostatisierbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte Temperatur mit einer Genauigkeit von ± 1 °C,

3.10.2.

einem temperaturregelbaren Injektor mit Verdampfer aus persilanisiertem Glas und Splitsystem,

3.10.3.

einem Flammenionisations-Detektor (FID),

3.10.4.

einem Datenerfassungssystem, geeignet zur Verwendung mit dem FID (Nummer 3.10.3), manuell integrierbar,

3.11.

Glaskapillarsäule oder Fused-silica-Säule, 20 bis 30 m Länge, 0,25 bis 0,32 mm Innendurchmesser, Innenwand belegt mit 5 % Diphenyl- / 95 % Dimethylpolysiloxan (SE-52 oder SE-54 stationäre Phase oder gleichwertig), gleichmäßige Schichtdicke zwischen 0,10 und 0,30 μm,

3.12.

Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 μl, mit gehärteter Nadel, geeignet für Split-Injektion,

3.13.

Calciumdichlorid-Exsikkator.

4.

REAGENZIEN

4.1.

Kaliumhydroxid (Titer mindestens 85 %),

4.2.

Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung etwa 2 N:

130 g Kaliumhydroxid (Nummer 4.1) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen lösen und mit Ethanol auf 1 Liter auffüllen (Nummer 4.10). Die Lösung ist in gut verschlossenen Braunglasflaschen maximal zwei Tage haltbar,

4.3.

Ethylether, analysenrein,

4.4.

Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung etwa 0,2 N:

13 g Kaliumhydroxid (Nummer 4.1) werden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und mit Ethanol auf 1 Liter aufgefüllt (Nummer 4.10),

4.5.

wasserfreies Natriumsulfat, analysenrein,

4.6.

kieselgelbeschichtete Glasplatten (20 x 20 cm) ohne Fluoreszenzindikator, Schichtdicke 0,25 mm (gebrauchsfertig im Handel erhältlich),

4.7.

Toluol für die Chromatographie,

4.8.

Aceton für die Chromatographie,

4.9.

n-Hexan für die Chromatographie,

4.10.

Ethylether für die Chromatographie,

4.11.

Ethanol, analyserein,

4.12.

Ethylacetat, analyserein,

4.13.

Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: Cholesterin oder Phytosterole, und Erythrodiol-Lösung 5 % in Ethylacetat (Nummer 4.11),

4.14.

2′, 7′-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid- Lösung (Nummer 4.2),

4.15.

wasserfreies Pyridin für die Chromatographie (Anmerkung 5).

4.16.

Hexamethyldisilazan, analyserein,

4.17.

Trimethylchlorosilan, analyserein,

4.18.

Probelösung von Sterin-Trimethylsilylethern,

unmittelbar vor Gebrauch ansetzen mit Sterinen und Erythrodiol aus Ölen, in denen sie enthalten sind,

4.19.

α-Cholestanol, Reinheit mehr als 99 % (Reinheit mit GC-Analyse überprüfen),

4.20.

α-Cholestanol-Lösung, interner Standard, 0,2 %ige Lösung (m/V) in Ethylacetat (Nummer 4.11).

4.21.

Phenolphthalein-Lösung, 10 g/l in Ethanol (Nummer 4.10).

4.22.

Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, für die Gaschromatographie,

4.23.

Hilfsgase: Wasserstoff, Helium, Stickstoff und Luft, rein, für die Gaschromatographie,

4.24.

n-Hexan (Nummer 4.9)/Ethylether (Nummer 4.10)-Gemisch 65:35 (V/V),

4.25.

Silanisierungsreagens, bestehend aus einem Gemisch aus Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9:3:1 (V/V/V).

5.

VERFAHREN

5.1. Herstellung des Unverseifbaren

5.1.1. Mit einer 500-μl-Mikroliterspritze (Nummer 3.6) so viel der α-Cholestanollösung (interner Standard) (Nummer 4.20) in einen 250-ml-Kolben (Nummer 3.1) geben, dass die Menge an Cholestanol etwa 10 % des Steringehalts der Probe entspricht. So werden z. B. für 5 g Olivenöl 500 μl der α-Cholestanollösung (Nummer 4.20) benötigt, für Oliventresteröl 1500 μl. Im leichten Stickstoffstrom im warmen Wasserbad bis zur Trocknung abdampfen. Nach dem Abkühlen des Kolbens in den gleichen Kolben 5±0,01 g der trockenen und filtrierten Probe einwiegen.

Anmerkung 1:

Bei tierischen oder pflanzlichen Ölen und Fetten, die größere Mengen an Cholesterin enthalten, kann ein Peak mit einer ähnlichen Retentionszeit wie Cholestanol auftreten. In diesem Fall ist die Sterinfraktion einmal mit und einmal ohne internen Standard zu analysieren.

5.1.2. Die Probe bei aufgesetztem Rückflusskühler mit 50 ml 2-N-ethanolischer Kaliumhydroxidlösung (Nummer 4.2) und Bims versetzen, erhitzen und unter schwachem Sieden verseifen (wobei sich die Lösung klärt). Die Probe weitere 20 Minuten am Sieden halten und dann durch den Rückflusskühler mit 50 ml destilliertem Wasser versetzen, den Rückflusskühler entfernen und den Kolben auf etwa 30 °C abkühlen.

5.1.3. Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter (Nummer 3.2) überführen, wobei mehrfach mit destilliertem Wasser (50 ml) nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether (Nummer 4.10) versetzen, etwa 60 Sekunden kräftig schütteln und den Druck durch Umdrehen des Scheidetrichters und Öffnen des Sperrhahns periodisch entlasten. Stehen lassen, bis die beiden Phasen vollständig getrennt sind (Anmerkung 2). Anschließend die Seifenlösung so vollständig wie möglich in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann die Wasser-Alkohol-Phase noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit 60-70 ml Ethylether extrahieren (Nummer 4.10).

Anmerkung 2: Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschflasche durch Zusatz kleiner Mengen Ethanol zerstört werden (Nummer 4.11).

5.1.4. Die drei Etherauszüge in einem Scheidetrichter mit 50 ml Wasser vereinigen. Weiter mit Wasser (50 ml) unter Zusatz eines Tropfens Phenolphthalein-Lösung (Nummer 4.21) waschen, bis das Waschwasser nicht mehr rosa gefärbt ist. Das Waschwasser ablassen und über wasserfreiem Natriumsulfat (Nummer 4.5) in einen zuvor gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit kleinen Mengen Ethylether nachspülen (Nummer 4.10).

5.1.5. Das Lösungsmittel durch Destillieren in einem Rotationsverdampfer bei 30 °C im Vakuum eindampfen. 5 ml Aceton hinzugeben und das flüchtige Lösungsmittel in einem leichten Luftzug vollständig entfernen. Den Rückstand bei 103 °C ± 2 °C im Trockenschrank 15 Minuten lang trocknen. Im Exsikkator abkühlen lassen und auf 0,1 mg genau wiegen.

5.2.

Trennung der Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Fraktion (Erythrodiol + Uvaol)

5.2.1. Herstellung der basischen Dünnschicht-Chromatographie-Platten Die Kieselgelplatten (Nummer 4.6) vollständig ca. 10 Sekunden lang in eine 0,2-N-ethanolische Alkalihydroxidlösung (Nummer 4.5) eintauchen, dann unter einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen, anschließend noch 1 Stunde bei 100 °C im Trockenschrank. Die Platten aus den Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator über Calciumchlorid (Nummer 3.13) bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behandelte Platten müssen innerhalb von 15 Tagen gebraucht werden.)

Anmerkung 3:

Bei Verwendung von alkalischen Kieselgelplatten zur Trennung der Sterinfraktion erübrigt sich die Behandlung der Unverseifbaren-Fraktion mit Aluminiumoxid. Auf diese Weise bleiben sämtliche sauren Verbindungen (Fettsäuren und andere) an der Startlinie. So erhält man eine saubere Trennung der Sterinzone von denen der aliphatischen Alkohole und Terpenalkohole.

5.2.2. Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem Hexan/Ethylether-Gemisch (Nummer 4.24) (Anmerkung 4) beschicken. Die Kammer mit einem geeigneten Deckel verschließen und mindestens eine halbe Stunde an einem kühlen Ort stehen lassen, damit sich ein Gleichgewicht zwischen Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und eine gleichmäßige Elution der Komponenten erzielt werden.

Anmerkung 4:

Das Gemisch ist jedes Mal frisch anzusetzen, damit die Wiederholbarkeit gewährleistet ist. Als alternatives Lösungsmittel kann n-Hexan/Ethylether 50:50 (V/V) verwandt werden.

5.2.3. Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (Nummer 5.1.5) in Ethylacetat mit einer 100-μl-Spritze 0,3 ml als dünnen, gleichmäßigen Strich 2 cm auf den unteren Rand (2 cm) der Dünnschichtplatte (Nummer 5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden 2-3 μl der Standardlösung (Nummer 4.13) aufgetragen, um die Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Zone nach der Entwicklung zu identifizieren.

5.2.4. Die Platte in die nach Nummer 5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer stellen. Die Temperatur der Umgebung sollte 15-20 °C (Anmerkung 5) betragen. Die Kammer mit dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis die Fließmittelfront bis 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen ist. Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungsmittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte eine geraume Zeit unter dem Abzug liegen lassen.

Anmerkung 5: Eine höhere Temperatur könnte die Separation verschlechtern.

5.2.5. Die Platte vorsichtig und gleichmäßig mit 2',7'-Dichlorfluoresceinlösung (Nummer 4.14) besprühen. Unter UV-Licht die Lage der Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Zone mit Hilfe der Flecke der Standardlösung (Nummer 4.13) bestimmen und mit einem schwarzen Stift den fluoreszierenden Bereich markieren (siehe Dünnschichtplatte Abbildung 3).

5.2.6. Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (Nummer 3.7) überführen. Mit 10 ml warmem Ethylacetat (Nummer 4.12) versetzen, mit Hilfe des Metallspatels gründlich vermischen und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der an dem Glasfiltertiegel angeschlossenen Vakuumflasche (Nummer 3.8) auffangen. Den Rückstand in der Flasche dreimal mit je 10 ml Ethylether (Nummer 4.3) waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen. Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4-5 ml eindampfen und den Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (Nummer 3.9) überführen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen Stickstoffstrom bis zur Trocknung eindampfen. Mit einigen Tropfen Aceton (Nummer 4.8) versetzen, wieder bis zur Trocknung eindampfen. Der Rückstand in dem Probengläschen muss aus den Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Fraktionen bestehen.

5.3. Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE)

5.3.1. Dem Probengläschen mit der Sterin- und Terpenfraktion werden je Milligramm Sterin und Triterpen-Dialkohole 50 μl Silanisierungsreagenz (Nummer 4.25) zugesetzt, unter Ausschluss von Feuchtigkeit (Anmerkung 7).

Anmerkung 6:

Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich. Daneben gibt es auch andere Silanisierungsreagenzien, z. B. N,O-bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trimethylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem Pyridin gemischt werden muss.

Pyridin kann durch die gleiche Menge Acetonitril ersetzt werden.

5.3.2. Das Probengläschen verschließen und gründlich (nicht zu stark) schütteln, bis sich die Verbindungen vollständig gelöst haben. Die Probe mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann einige Minuten zentrifugieren. Die klare Lösung kann gaschromatographisch untersucht werden.

Anmerkung 7:

Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal und bedeutet keine Anomalie. Die Bildung eines weißen Niederschlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der Zersetzung des Reagens. In diesem Fall soll der Test wiederholt werden (nur bei Verwendung von Hexamethyldisilazan/Trimethylchlorosilan).

5.4. Gaschromatographische Analyse

5.4.1. Vorbereiten, Einfahren der Kapillarsäule

5.4.1.1.

Die Säule (Nummer 3.11) in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlassteil an den Split-Injektor und das Auslassteil an den Detektor angeschlossen wird.

Überprüfung des Gaschromatographen (Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des Detektors, des Trennsystems, des Schreibers usw.).

5.4.1.2.

Wird die Säule zum ersten Mal verwendet, ist es ratsam, sie einzufahren: Einen schwachen Gasstrom durch die Säule selbst geben, den Gaschromatographen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von mindestens 20 °C über der Arbeitstemperatur (Anmerkung 8) aufheizen. Diese Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten, und dann sind die Analysenbedingungen einzustellen (Gasstrom, Split, Zünden der Flamme, Rechensystemanschluss, Einstellen der Ofentemperatur, Injektor, Detektor). Dann eine Empfindlichkeit wählen, die mindestens doppelt so groß ist wie bei der Durchführung der Analyse. Die Grundlinie muss linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift.

Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluss der Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule hin.

Anmerkung 8:

Die Einfahrtemperatur muss in jedem Fall 20 °C unter der für die stationäre Phase angegebenen Maximaltemperatur liegen.

5.4.2. Wahl der Arbeitsbedingungen

5.4.2.1.

Arbeitsbedingungen:

—

Säulentemperatur: 260 ± 5 °C;

—

Injektortemperatur: 280-300 °C;

—

Detektortemperatur: 280-300 °C;

—

Strömungsgeschwindigkeit: Helium 20–35 cm/s; Wasserstoff 30–50 cm/s;

—

Splitverhältnis: 1:50–1:100;

—

Geräteempfindlichkeit: das 4- bis 16fache der Mindestdämpfung;

—

Detektorempfindlichkeit: 1–2 mV f. s.;

—

Einspritzvolumen: 0,5-1 μl TMSE-Lösung.

Diese Bedingungen können entsprechend den Charakteristiken der Säule und des Gaschromatographen derart geändert werden, dass die damit aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen:

—

die Retentionszeit von ß-Sitosterin muss 20 ± 5 Minuten betragen;

—

der Campesterin-Peak muss bei Olivenöl (Durchschnittsgehalt 3 %) 20 ± 5 % des Skalenbereichs und bei Sojaöl (Durchschnittsgehalt 20 %) 80 ± 10 % des Skalenbereichs betragen;

—

alle enthaltenen Sterine müssen getrennt werden; die anderen Peaks müssen ebenfalls völlig aufgelöst sein, d. h. der Peakverlauf muss auf die Grundlinie zurückführen, bevor der nächste Peak beginnt; eine unvollständige Auflösung ist nur unter der Bedingung akzeptabel, dass der RRT-1,02-Peak (Sitostanol) mit Hilfe der Senkrechten quantitativ zu bestimmen ist.

5.4.3.

Durchführung der Analyse

5.4.3.1.

Mit der 10-μl-Mikroliterspritze 1 μl Hexan entnehmen, 0,5 μl Luft und anschließend 0,5–1 μl Probenlösung aufziehen; dabei den Kolben der Spritze so weit einziehen, dass die Nadel leer ist. Die Nadel in die Membran des Injektors einführen, nach 1–2 Sekunden schnell einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam herausziehen.

Es kann auch ein automatischer Injektor verwendet werden.

5.4.3.2.

Das Chromatogramm aufzeichnen, bis die TMSE der Triterpen-Dialkohole eluiert sind. Die Grundlinie muss stets den vorgeschriebenen Anforderungen (Nummer 5.4.1.2) genügen.

5.4.4.

Identifizierung der Peaks

Die einzelnen Peaks werden anhand der Retentionszeiten und durch Vergleich mit dem unter denselben Bedingungen analysierten Gemisch der Sterine und TMSE der Triterpen-Dialkohole bestimmt (siehe Anlage). Die Sterine und Triterpen-Dialkohole werden in folgender Reihenfolge eluiert: Cholesterin, Brassicasterin, Ergosterin, 24-Methylen-Cholesterin, Campesterin, Campestanol, Stigmasterin, Δ7-Campesterin, Δ5,23-Stigmastadienol, Clerosterin, ß-Sistosterin, Sitostanol, Δ5-Avenasterin, Δ5,24-Stigmastadienol, Δ7-Stigmastenol, Δ7-Avenasterin, Erythrodiol und Uvaol. In Tabelle 1 sind die Retentionszeiten relativ zu ß-Sitosterin für eine SE-52- und SE-54-Säule aufgeführt. Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die typischen Chromatogramme einiger Öle.

5.4.5. Quantitative Bestimmung

5.4.5.1.

Mit Hilfe des Rechensystems werden die Peak-Flächen von α-Cholestanol und der Sterine und Triterpen-Dialkohole berechnet. Dabei sind etwa auftretende Peaks von Verbindungen, die in Tabelle I nicht aufgeführt sind, nicht zu berücksichtigen (Ergosterin darf nicht berechnet werden). Der Responsefaktor von α-Cholestanol soll gleich 1 gesetzt werden.

5.4.5.2

Der Gehalt an den einzelnen Sterinen in mg/kg Fett wird nach folgender Formel berechnet:

Sterin xAx ms1000As m

Darin bedeuten:

A_x=

Peakfläche des Sterins x in Computer-Counts,

A_s=

Peakfläche von α-Cholestanol in Computer-Counts,

m_s=

zugesetzte Menge an α-Cholestanol in mg,

m=

Menge der für die Bestimmung entnommenen Probe in g.

6.

ERGEBNISSE

6.1.

Der Gehalt an den einzelnen Sterinen wird in mg/kg Öl angegeben, ihre Summe als „Gesamtsterine” .

Die Zusammensetzung der einzelnen Sterine sowie des Erythrodiols und des Uvaols wird mit einer Dezimalstelle angegeben.

Die Sterinzusammensetzung ist ohne Dezimalstelle anzugeben.

6.2.

Der prozentuale Anteil jedes einzelnen Sterins errechnet sich aus dem Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe der Peakflächen aller Sterine nach der Formel

SterinxAxA100

Dabei ist

A_x=

Peakfläche des Sterins x,

ΣA=

Summe der Peakfläche aller Sterine.

6.3.

Apparentes β-Sitosterin: Δ5-23-Stigmastadienol + Clerosterin + β-Sitosterin + Sitostanol + Δ5-Avenasterin + Δ5-24-Stigmastadienol.

6.4.

Der prozentuale Anteil der Erythrodiols und Uvaols errechnet sich nach der Formel:

Erythrodiol UvaolEr UvEr Uv ΣA 100

Darin bedeuten:

ΣA=

Gesamtfläche von Sterin in Computer-Counts;

Er=

Fläche des Erythrodiols in Computer-Counts;

Uv=

Fläche des Uvaols in Computer-Counts;