1.

Zweck und Anwendungsbereich

Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von pflanzlichem und tierischem Fremdfett wie Talg und Schmalz im Milchfett von Milch und Milcherzeugnissen durch gaschromatographische Triglyceridanalyse. Mit Hilfe bestimmter Triglyceridformeln werden pflanzliche und tierische Fette unabhängig von Fütterungs- oder Standortbedingungen im reinen Milchfett qualitativ und quantitativ bestimmt.

Anmerkung 1:

Anhand der nur in Milchfett vorkommenden Buttersäure (C 4) können zwar geringe Milchfettgehalte in Pflanzenfett quantitativ bestimmt werden, die qualitative und quantitative Bestimmung von Fremdfettbeimischungen von bis zu mindestens 20 % (Gewichtsprozent) ist jedoch kaum möglich aufgrund der groben C 4-Schwankungen zwischen 3,5 und 4,5 % (Gewichtsprozent).

Anmerkung 2:

Der quantitative Nachweis gelingt praktisch nur mit der Triglyceridanalyse, da der Sterolgehalt von Pflanzenfett je nach Herstellung und Behandlung variiert.

2.

Begriff

Fremdfett in Milchfett: Für die Zwecke dieser Arbeitsvorschrift ist unter Fremdfett sämtliches pflanzliche und tierische Fett, ausgenommen Milchfett, zu verstehen.

3.

Kurzbeschreibung

Nach Extraktion des Milchfetts wird eine Stammlösung angesetzt. Anhand dieser Lösung werden die Triglyceride (Gesamtzahl der Kohlenstoffatome) mit Hilfe eines Gaschromatographen mit gepackter Säule bestimmt. Durch Einsetzen der Gewichtsprozente der Fettmoleküle unterschiedlicher Größe (C24 — C54 — nur Geradzahlige) in die Triglyceridformel wird das Fremdfett entweder qualitativ oder quantitativ bestimmt.

Anmerkung:

Bei Beachtung dieser Bewertung kann die Gaschromatographie verwendet werden, wenn sichergestellt ist, daß vergleichbare Ergebnisse erzielt werden⁽¹⁾.

4.

Chemikalien

Es sind analysenreine Chemikalien zu verwenden.

4.1.

Trägergas: Stickstoff, Reinheit ≥ 99,996 %.

4.2.

Standard-Triglyceride⁽²⁾, gesättigt, sowie Cholesterol zur Standardisierung von Standard-Milchfett gemäß Nummer 6.5.4.

4.3.

Methanol, wasserfrei.

4.4.

n-Hexan.

4.5.

n-Heptan.

4.6.

Toluol.

4.7.

Dimethylchlorsilanlösung: 50 ml Dimethylchlorsilan werden in 283 ml Toluol gelöst.

4.8.

Wasserstoff und synthetische Luft als Hilfsgase.

4.9.

Stationäre Phase, 3 % (v/v-1) auf 125/150 μm (100/120 mesh) Gas ChromQ⁽³⁾.

4.10.

10 %ige Kakaobutterlösung.

5.

Geräte

Die übliche Laborausrüstung, insbesondere folgende:

5.1.

Hochtemperatur-Gaschromatograph, geeignet für Temperaturen von mindestens 400 bis 450 °C, mit Flammenionisationsdetektor (FID) und konstantem Masseflußdetektor für das Trägergas.

Hilfsgasstrom 30 ml/min für H und 270 ml/min für künstliche Luft.

Wegen des hohen Trägergasstroms sollte die Flamme besonders breit sein.

Anmerkung:

Wegen der hohen Temperaturen bei der Triglyceridanalyse müssen die FID-Einsätze häufig gereinigt werden.

Der Gaschromatograph muß mit hochtemperaturfesten Septa ausgerüstet sein, die häufig verwendet werden können und im allgemeinen nur sehr wenig bleeding aufweisen.

Anmerkung:

Geeignet sind Chromblau(tm)-Septa (Chrompack).

Die Septa sind regelmäßig zu wechseln, z. B. nach 100 Einspritzungen oder sobald die Auflösung nachläßt (vgl. Abbildung 4).

5.2.

Chromatographiesäule

U-förmige Glassäule (Innendurchmesser 2 mm, Länge 500 mm), die zur Inaktivierung der Glasoberfläche zunächst gemäß Nummer 6.1 mit Dimethylchlorsilan silanisiert wird.

Anmerkung:

Auch etwas längere gepackte Säulen (800-2000 mm) sind geeignet. Mit ihren kann eine etwas bessere Wiederholbarkeit der Ergebnisse erzielt werden. Andererseits zeigt die stationäre Phase nach dem Betrieb gelegentlich Bruchstellen, die wiederum schlechtere quantitative Ergebnisse zur Folge haben. Ferner verlöscht die FID-Flamme leicht wegen der extrem hohen Trägergasgeschwindigkeit von 75 bis 85 ml/min, wie sie hierfür erforderlich ist.

5.3.

Aufbau für das Befüllen der Säule (vgl. Abbildung 1)

5.3.1.

Kunststoffsäule mit Schraubkappen, versehen mit einer Markierung, bis zu der die Säule mit der stationäre Phase befüllt werden kann.

5.3.2.

Feines Sieb (Maschenweite ca. 100 μm) mit Schraubkappe, geeignet zum Verschließen der Glassäule gemäß Abbildung I.

5.3.3.

Inaktivierte, silanisierte Glaswolle.

5.3.4.

Vibrator zum gleichmäßigen Befüllen mit der stationären Phase.

5.4.

1-3 ml Extrelut-Säule⁽⁴⁾ mit Silicagel. Diese Säule kann alternativ auch zur Extraktion von Milchfett verwendet werden.

5.5.

Graphitdichtung 6,4 mm (1/4″) mit 6 mm Bohrung.

5.6.

Vorrichtungen für das Silanisieren der Glasfläche der Säule gemäß 6.1.

5.6.1

Woulff-Flasche.

5.6.2.

Wasserstrahlpumpe.

5.7.

Wasserbad, einstellbar auf 50 ± 2 °C.

5.8.

Trockenofen, einstellbar von 50 ± 2 °C bis 100 ± 2 °C.

5.9.

Mikromliterpipette.

5.10.

Graduierte 5-ml-Pipette zum Dosieren von 1,5 ml Methanol.

5.11.

50-ml-Rundkolben.

5.12.

Erlenmeyerkolben, 50 ml Nennvolumen.

5.13.

Trichter.

5.14.

Feinporiges Filter.

5.15.

Rotationsverdampfer.

5.16.

Ampullen, 1 ml Nennvolumen, mit Aluminiumdeckel verschließbar, innen mit Trennwand.

5.17.

Injektionsspritze; der Kolben der Spritze darf das Nadelende nicht berühren.

Anmerkung:

Mit solchen Spritzen läßt sich eine bessere Wiederholbarkeit der Ergebnisse erzielen.

Die Nadelspitze ist regelmäßig zu kontrollieren, damit das Septum nicht beschädigt wird.

6.

Verfahren

6.1.

Vorbereitung der Säule (Silanisierung).

Nach Anschließen der Woulff-Flasche gemäß Abbildung 2 an die Wasserstrahlpumpe wird Rohr 2 gemäß Nummer 4.7 in die Lösung getaucht. Die Säule wird durch Schließen des Absperrventils gefüllt. Anschließend werden die beiden Schläuche entfernt. Die Säule wird auf einen Ständer montiert und mittels einer Pipette mit Dimethyldichlorsilanlösung befüllt. Nach 20-30 Minuten wird die Woulff-Flasche durch eine Saugflasche ersetzt und die Säule durch Anschließen der Wasserstrahlpumpe entleert (vgl. Abbildung 3).

6.2.

Befüllen der Säule

Im Anschluß daran wird die Säule mit 75 ml Toluol und 50 ml Methanol gründlich gespült. Danach wird die befüllte Säule im Trockenofen bei 100 °C etwa 30 Minuten getrocknet. Die zu befüllende Glassäule wird am unteren Ende mit einem etwa 1 cm langen Stück silanisierter Glaswolle verstöpselt, die mit Hilfe eines Stahlstäbchens hineingedrückt wird. Anschließend wird das Ende der Säule mit dem Sieb gemäß Nummer 5.3.2 verschlossen. Die Säule wird unter Druck (3 bar, mit N₂) mit der stationären Phase befüllt. Zur Erzielung einer homogenen, gleichmäßigen und festen Packung ist während des Befüllens ein Vibrator in der Säule auf- und abzuführen. Nach dem Befüllen wird das andere Ende der Säule mit einem fest zusammengedrückten Stück silanisierter Glaswolle verstöpselt, wobei das überstehende Ende abgeschnitten und der Stöpsel mit einem Spatel einige Millimeter in die Säule hineingedrückt wird.

6.3.

Ansetzen der Proben

Für das Ansetzen der Proben ist eine der drei folgenden Methoden zu verwenden:

6.3.1.

Abscheidung des Milchfetts aus Butter

5 bis 10 g Butter werden in einem geeigneten Gefäß im Wasserbad gemäß Nummer 5.7 bei 50 °C aufgeschmolzen.

Ein 50-ml-Erlenmeyerkolben und ein Trichter mit eingesetztem Filter gemäß Nummer 5.14 werden im Trockenofen au 5O °C erwärmt. Die Fettschicht der aufgeschmolzenen Butter wird über die erwärmte Vorrichtung filtriert.

Dieses Milchfett ist nahezu phospholipidfrei.

6.3.2.

Extraktion der Fettfraktion nach Röse-Gottlieb

Die Extraktion wird entweder nach IDF-Norm 1C: 1987, 16C: 1987, 116A: 1987 oder 22B: 1987 durchgeführt.

Mit einem solchen Milchfett kann aufgrund des Phospholipidgehalts ein Cholesterolpeak erzielt werden, der um etwa 0,1 % erhöht ist.

Das mit Cholesterol auf 100 standardisierte Triglyceridspektrum wird daher nur vernachlässigbar beeinflußt.

6.3.3.

Extraktion von Milch mit Silicagelsäulen

0,7 ml einer auf 20 °C temperierten Milchprobe werden mittels einer Pipette einer 1- bis 3-ml-Extrelutsäule gemäß Nummer 5.4 aufgegeben; danach ist 5 Minuten lang zu warten, bis sich die Probe gleichmäßig über das Silicagel verteilt hat.

Zur Denaturierung des Protein-Lipid-Komplexes wird die Probe mittels einer Pipette mit 1,5 ml Methanol versetzt. Anschließend wird die Probe mit 20 ml n-Hexan extrahiert. Das n-Hexan wird langsam in kleinen Mengen aufgegeben, wobei das ablaufende Lösungsmittel in einem 50-ml-Rundkolben aufgefangen wird, der zuvor auf ein konstantes, bekanntes Gewicht getrocknet wurde.

Nach der Extraktion wird die Säule leerlaufen gelassen.

Die Lösungsmittel werden aus dem Eluat im Rotationsverdampfer auf dem Wasserbad bei einer Temperatur von 40-50 °C ausgetrieben.

Der Kolben wird getrocknet und der Fettrückstand gewogen.

Anmerkung:

Fettextraktionsvefahren gemäß Gerber, Weibull-Berntrop, Schmid-Bondzynski-Ratzlaff oder die Abscheidung des Milchfetts durch Fettdetergentien (HDI-Methode) eignen sich nicht zur Triglyceridanalyse, da es bei diesen Methoden zum Übertritt mehr oder weniger großer Mengen Teilglyceriden oder -phospholipiden in die Fettphase kommt.

6.4.

Ansetzen der Probelösung

Für die Gaschromatographie wird eine 5 %ige Lösung des gemäß 6.3 gewonnenen Fetts in n-Heptan vewendet. Zum Ansetzen dieser Probelösung werden entsprechende Mengen des gemäß 6.3.1 und 6.3.2 gewonnenen Probematerials gewogen und in entsprechenden Mengen n-Heptan gelöst. Beim Ansetzen der Probe gemäß 6.3.3 wird die zur Probe in dem Kolben zuzugebende n-Heptan-Menge auf der Grundlage der Einwage berechnet und der Rest darin gelöst. Etwa 1 ml Probelösung wird gemäß 5.16 in einen Glaskolben übergeführt.

6.5.

Chromatographische Triglyceridanalyse

Bei hohen Temperaturen von bis zu 350 °C für das Eluieren der langkettigen C52-56-Triglyceride kommt es leicht zu einem Anstieg der Basislinie, vor allem wenn die Säulen zuvor nicht in geeigneter Weise vorbehandelt wurden. Dieser Anstieg der Basislinie bei hohen Temperaturen kann entweder durch Verwendung von zwei Säulen oder durch Basisliniensubtraktion völlig vemieden werden. Beim Kompensationsbetrieb oder Einzelsäulenbetrieb sowie für die Glaseinsätze im Injektor und im Detektor sind die Graphitdichtungen gemäß 5.5 zu verwenden.

6.5.1.

Basislinienkorrektur

Zur Verhinderung des Anstiegs der Basislinie ist eine der vier folgenden Methoden zu verwenden:

6.5.1.1.

Mehrsäulenbetrieb

Zwei gepackte Säulen werden im Kompensationsbetrieb eingesetzt.

6.5.1.2.

Basislinienkorrektur durch den Gaschromatographen

Mit einem Gaschromatographiedurchlauf ohne Aufgabe einer Fettlösung und anschließender Subtraktion der aufgezeichneten Basislinie kann ein Basislinienanstieg vermieden werden.

6.5.1.3.

Basislinienkorrektur durch Software-Integration

Mit einem Durchlauf des Integrationssystems ohne Aufgabe einer Fettlösung und anschließender Subtraktion der aufgezeichneten Basislinie kann ein Basislinienanstieg vermieden werden.

6.5.1.4.

Basislinienkorrektur durch geeignete Vorbehandlung

Durch geeignete Vorbehandlung der Säule und etwa 20 Einspritzungen von Milchfettlösung ist der Basislinienanstieg bei hohen Temperaturen oftmals so gering, daß auf eine Basislinienkorrektur verzichtet werden kann.

6.5.2.

Einspritztechnik

Zur Vermeidung von Diskriminierungseffekten und Erzielung besserer quantitativer Ergebnisse mit den hochsiedenden Triglyceridkomponenten wird die „Heißeinspritztechnik” verwendet. Dabei wird die Fettlösung auf die Spritze aufgezogen und die kalte Injektionsnadel vor dem Einspritzen etwa 3 Sekunden im Einspritzblock vorerhitzt. Anschließend wird der Spritzeninhalt rasch eingespritzt.

Anmerkung:

Bei dieser Injektionstechnik verringert sich die Gefahr der Fraktionierung in der Spritze oder im Einspritzblock. Es wird keine „on column” -Direkteinspritzung im oberen, erweiterten Teil der Säule durchgeführt, da die sich hier ansammelnden Septumfragmente und Kontaminanten bei der verwendeten Technik durch regelmäßiges Auswechseln eines Injektoreinsatzes ohne Demontieren der Säule leicht entfernt werden können.

Ein Verbiegen der Nadelspritze durch Berühren des Becherglasbodens (auch wenn kaum mit dem bloßen Auge erkennbar) ist unter allem Umständen zu vermeiden, damit die Septum nicht beschädigt wird.

6.5.3.

Vorbehandlung einer gepackten Säule

Während der Schritte a) bis c) wird das obere Ende der Säule nicht an den Detektor angeschlossen, um eine Kontamination zu verhindern. Die gemäß 6.2 befüllten Säulen werden in folgender Weise vorbehandelt:

a)

15 Min. N₂-Strom 40 ml/Min. bei 50 °C,

b)

Erhitzung um 1 K/Min. auf 355 °C bei einem N₂-Strom von 10 ml/Min.,

c)

12 bis I5-stündiges Aufbewahren bei 355 °C,

d)

2 Einspritzungen von je μl Kakaobutterlösung gemäß 4.10 und entsprechendes Temperaturprogramm,

e)

20 Einspritzungen von je 0,5 μl Milchfettlösung verteilt über 2 bis 3 Tage gemäß 6.4.

Anmerkung:

Kakaobutter besteht nahezu ausschließlich aus hochsiedenden C50- bis C56-Triglyceriden. Das Einspritzen von Kakaobutter dient dem Zweck der speziellen Vorbehandlung in diesem langkettigen Bereich. Bei den hochsiedenden C50- bis C56-Triglyceriden können teilweise Response-Faktoren von bis zu 1.2 auftreten. Normalerweise ist bei wiederholtem Einspritzen einer Milchfettlösung eine Verringerung der anfänglich hohen Response-Faktoren für C50- bis C54-Triglyceride zu erwarten. Bei Triglyceriden mit geringer Acyl-C-Zahl liegt der Faktor bei 1.

Es werden jeweils drei Paar der gemäß 6.2 vorbehandelten Säulen vorbereitet. Die vorbehandelten Säulen werden jeweils routinemäßig mit einer Milchfettanalyse kontrolliert. Das Paar mit den besten quantitativen Ergebnissen (Response-Faktor gegen 1) wird für die nachfolgenden Zwecke weiterverwendet. Säulen mit Response-Faktoren > 1.20 werden nicht verwendet.

6.5.4.

Eichung

Zur Eichung sollten die Response-Faktoren der betreffenden Triglyceride sowie des Cholesterols in der Milch (mit standardisiertem Fettgehalt) unter Verwendung standardisierter Triglyceride (zumindest die gesättigten Triglyceride C24, C30, C36, C42, C48 und C54 sowie Cholesterol, besser noch zusätzlich C50 und C52) bestimmt werden. Dazwischenliegende Response-Faktoren können durch mathematische Interpolation gefunden werden. Bei Verwendung von standardisierten Fett müssen jeden Tag zwei bis drei Eichungen durchgeführt werden. Bei nahezu identischen Ergebnissen dürften bei der Triglyceridanalyse der Proben gut wiederholbare quantitative Ergebnisse erzielt werden. Das standardisierte Milchfett ist bei einer Lagertemperatur von höchstens - 18 °C mehrere Monate lang haltbar und kann daher als Standard verwendet werden.

6.5.5.

Temperaturprogramm, Trägergas und andere Bedingungen für die Triglyceridanalyse

Temperaturprogramm: Anfangstemperatur der Säule: eine Minute lang 210 °C, anschließend mit einer Aufheizrate von 6 °C/Min. auf 350 °C erhitzen und 5 Minuten lang auf der Endtemperatur halten. Detektor- und Injektortemperatur jeweils 370 °C

Anmerkung:

Detektor-, Injektor- und Ofentemperatur (Anfangstemperatur) sollten (auch über Nacht, an Wochenenden sowie während der Ferien) konstant gehalten werden.

Trägergas: Stickstoff, Durchsatz 40 ml/Min.

Anmerkung:

Bei Verwendung von 80-cm-Säulen muß der N2-Durchsatz mindestens 75 ml/Min. betragen. Der Trägergasstrom muß so exakt eingestellt werden, daß unabhängig von der Säulenlänge C54 bei 341 °C eluiert wird.

Dauer der Analyse: 29,3 Min. Einspritzvolumen: 0,5 μl.

Anmerkung:

Die Spritze ist nach jedem Einspritzen mehrfach mit reinem Heptan zu spülen.

FID-Bedingungen gemäß 5.1.

Anmerkung:

Der Flammenionisationsdetektor ist zu Beginn jedes Arbeitstags zu glühen.

7.

Integration, Auswertung und Kontrolle der Meßbedingungen

Triglyceride mit ungerader Acyl-c-Zahl (2n + 1) werden mit den Triglyceriden mit der jeweils nächstkleineren geraden Acyl-c-Zahl (2n) kombiniert. Die weniger gut wiederholbaren geringen C56-Gehalte werden nicht berücksichtigt. Die verbleibenden Triglyceride (Peakfläche) im Chromatogramm, einschließlich Cholesterol (Peak bei C24), werden mit den jeweiligen Response-Faktoren des Standard-Fetts (letzte Eichung) multipliziert und zusammen auf 100 geeicht. Außer dem freien Cholesterol werden daher die Triglyceride C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40 C42, C44, C46, C48, C50, C52 und C54 ausgewertet. Die Ergebnisse werden in Gewichtsprozenten (g/100 g) ausgedrückt. Die Auswertung der Chromatogrammpeaks sollte mit Hilfe eines Integrators erfolgen, bei dem die Basislinie aufgezeichnet werden kann. Eine Reintegration mit optimierten Integrationsparametern sollte möglich sein. Die Abbildungen 5 und 6 zeigen zwei Beispiele von Triglyceridchromatogrammen. Abbildung 5 zeigt ein gut auszuwertendes Chromatogramm, Abbildung 6 dagegen weist einen sporadischen Fehler im Bereich C50 und C54 auf, weil die Basislinie im Vergleich zu Abbildung 5 nicht korrekt verläuft. Nur mit Hilfe eines Integrators, mit dem die Basislinie aufgezeichnet werden kann, können solche Fehler mit hoher Gewißheit erkannt und vermieden werden. Zur Kontrolle der Meßbedingungen zeigt Tabelle 1 die Mittelwerte und Standardabweichungen (SD) eines typischen Wintermilchfetts für die verschiedenen Triglyceride aus 19 Analysen desselben Fetts:

Tabelle 1: Triglyceridzusammensetzung eines Milchfetts

Mittelwert und Standardabweichung aus 19 Analysen

(in g/100 g)
Triglycerid	Mittelwert	Standardabweichung
C24	0,04	0,004
C26	0,26	0,007
C28	0,66	0,020
C30	1,31	0,023
C32	2,92	0,030
C34	6,73	0,053
C36	12,12	0,030
C38	12,92	0,054
C40	9,70	0,019
C42	7,62	0,020
C44	7,35	0,025
C46	7,91	0,029
C48	9,09	0,048
C50	9,97	0,038
C52	7,76	0,042
C54	3,32	0,020

Bei größerer Standardabweichung als in Tabelle 1 angegeben sind die Chromatogramme nicht akzeptabel, und die Septa oder der Gasstrom sollten überprüft werden. Auch können sich kleine Septumkomponenten auf der Glaswolle am Säuleneintritt abgelagert haben, oder die Säule ist durch Abnutzung, Temperatureinfluß usw. unbrauchbar geworden (vgl. Abbildung 3).

8.

Qualitativer Fremdfettnachweis

Für den Fremdfett-Triglyceridnachweis wurden Formeln (Tabelle 2) mit Konfidenzgrenzen S (Tabelle 3) entwickelt, in denen die S-Werte von reinem Milchfett fluktuieren können. Werden diese Grenzen überschritten, so ist vermutlich Fremdfett enthalten. Die empfindlichste Formel für den Nachweis von Talgzusatz lautet z. B.:

6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 + 0,9892 · C54 = S

(1)

Anmerkung:

Mit 755 verschiedenen Milchfettproben wurde für Milchfettproben mit einer Standardabweichung für alle S-Werte SD = 0,39897 ein Konfidenzintervall von S = 97,96-102,04 ermittelt.

Soll die Triglyceridzusammensetzung einer unbekannten Fettprobe bestimmt werden, so gestattet diese Formel ohne Verwendung eines Computers zu prüfen, ob die Summe des hier auf diese Weise mit den entsprechenden Faktoren errechneten Triglyceridgehalts außerhalb des Bereichs 97,96-102,4 fällt und ob es höchstwahrscheinlich ein Fall von Fremdfettzusatz vorliegt. Tabelle 2 enthält andere Triglyceridformeln, mit denen verschiedene Fremdfette nachgewiesen werden können. Für den Nachweis von Sojaöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Rapsöl, Leinöl, Weizenkeimöl, Maiskeimöl, Baumwollöl und hydrogenisiertem Fischöl, Kokosnuß- und Palmkernfett sowie für Palmöl und Rindertalg kann jeweils eine gemeinsame Formel verwendet werden. Da die Triglyceridzusammensetzung von Fremdfett ebenfalls Schwankungen unterworfen ist, wurden bis zu vier verschiedene, experimentell gemessene Fremdfett-Triglyceriddaten desselben Typs verwendet. (Mit denselben Fremdfett-Typen wurde jeweils der unvorteilhafteste Grenzwert verwendet (vgl. Tabelle 4).) Mit der folgenden „Gesamtformel” wurden für alle Fremdfette gleichgute Ergebnisse erzielt:-2,7575 · C26 + 6,4077 · C28 + 5,5437 · C30 - 15,3247 · C32 + 6,2600 · C34 + 8,0108 · C40 - 5,0336 · C42 + 0,6356 · C44 + 6,0171 · C46 = S Berechnungen für den Nachweis beliebiger Fremdfettgemische in Milchfett haben gezeigt, daß z. B. trotz des mit der in Tabelle 2 genannten Formel für Rindertalg erzielten niedrigen Grenzwerts für dieses Fremdfett von 2,7 % andere Fette wie Kokosfett, Palmöl oder Palmkernöl mit Grenzwerten von 26,8, 12,5 bzw. 19,3 % anhand dieser Formel nur nachgewiesen werden können, wenn dem Milchfett extrem hohe Mengen davon beigemischt wurden. Dies gilt auch für die anderen Formeln in Tabelle 2.

Tabelle 2: Triglyceridformeln für den Nachweis von Fremdfett in Milchfett mit Angabe der Standardabweichungen SD für S

Formeln für Sojaöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Rapsöl, Leinöl, Weizenkeimöl, Maiskeimöl, Baumwollöl und Fischöl

2,0983 · C30 + 0,7288 · C34 + 0,6927 · C36 + 0,6353 · C38 + 3,7452 · C40 - 1,2929 · C42 + 1,3544 · C44 + 1,7013 · C46 + 2,5283 · C50 = S; SD = 0,38157

Formel für Kokosnuß- und Palmkernfett

3,7453 · C32 + 1,1134 · C36 + 1,3648 · C38 + 2,1544 · C42 + 0,4273 · C44 + 0,5809 · C46 + 1,2926 · C48 + 1,0306 · C50 + 0,9953 · C52 + 1,2396 · C54 = S; SD = 0,11323

Formel für Palmöl und Rindertalg

3,6644 · C28 + 5,2297 · C30 - 12,5073 · C32 + 4,4285 · C34 - 0,2010 · C36 + 1,2791 · C38 + 6,7433 · C40 - 4,2714 · C42 + 6,3739 · C46 = S; SD = 0,81094

Formel für Schmalz

6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 + 0,9892 · C54 = S; SD = 0,39897 Deshalb sind bei der Untersuchung einer unbekannten Fettprobe sämtliche Formeln der Tabelle 2 und die Gesamtformel 2 zu verwenden, wenn es sich bei der Probe um ein Gemisch aus Milchfett und einem der 14 verschiedenen Fremdfette oder einer Kombination dieser verschiedenen Fette handelt. Erhält man beim Einsetzen der Triglyceride einer zu analysierenden Fettprobe einen S-Wert, der bei auch nur einer einzigen der fünf Formeln außerhalb des Wertebereichs der Tabelle 3 zu liegen kommt, so handelt es sich bei der Probe höchstwahrscheinlich um ein modifiziertes Milchfett. Der Fremdfettnachweis in Milch anhand einer einzigen der vier Formeln gemäß Tabelle 2 erlaubt keine Schlußfolgerungen hinsichtlich der Art des Fremdfettgemischs.

Tabelle 3: Grenzwerte S für Milchfette

Formel für den Nachweis von	S-Wertebereich
Sojaöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Rapsöl, Leinöl, Weizenkeimöl, Maiskeimöl, Baumwollöl, Fischöl	98,05-101,95
Kokos- und Plamkernfett	99,42-100,58
Palmöl und Rindertalg	95,90-104,10
Schmalz	97,96-102,04
Gesamtformel	95,68-104,32

Tabelle 4 enthält die Nachweisgrenzen für die verschiedenen Fremdfette mit einer Konfidenzgrenze von 99 %. Die erste Spalte zeigt die Mindestnachweisgrenzen für die besten Milchfettformeln der Tabelle 2. Die zweite Spalte zeigt die Nachweisgrenzen für die Gesamtformel. Obwohl die Grenzwerte etwas höher liegen, reicht diese Formel für etwas höher liegende Fremdfettgehalte aus. Unter Verwendung aller Formeln können auch Kombinationen der verschiedenen Fremdfette nachgewiesen werden. Die Schwankungsbreiten der Triglyceride der verschiedenen Fremdfette eines Typs haben keinen nenneswerten Einfluß auf die Nachweisgrenzen.

Tabelle 4: 99 %ige Nachweisgrenzen durch Zusatz von Fremdfett zu Milch in %

Anwendung:

Die S-Wertebereiche werden derart berechnet, daß Fremdfettgehalt nur angenommen wird, wenn die Grenzwerte für die einzelnen Formeln überschritten werden (vgl. Tabelle 4).

	Einzelformel	Gesamtformel
Sojaöl	2,1	4,4
Sonnenblumenöl	2,3	4,8
Olivenöl	2,4	4,7
Kokosfett	3,5	4,3
Palmöl	4,4	4,7
Palmkernfett	4,6	5,9
Rapsöl	2,0	4,4
Leinöl	2,0	4,0
Weizenkeimöl	2,7	6,4
Maiskeimöl	2,2	4,5
Baumwollöl	3,3	4,4
Schmalz	2,7	4,7
Rindertalg	5,2	5,4
Hydrogenisiertes Fischöl	5,4	6,1

9.

Quantitative Fremdfettbestimmung

Zur quantitativen Bestimmung des Fremdfettgehalts eines Milchfetts ist folgende Formel zu verwenden

X (%) = 100 · | (100 - S) |/(100 - SF) |

(3)

Hierin bedeutet X die Menge eines unbekannten Fremdfetts oder Fremdfettgemischs in einem unbekannten Milchfett. S ist das Ergebnis der Addition eines unbekannten Fremdfetts durch Einsetzen der Triglyceride des Fremdfett/Milchfettgemischs in die vorstehende Triglyceridformel. Wurde dem Milchfett ein unbekanntes Fremdfett zugesetzt, so wird als S_F der S-Wert der verschiedenen Fremdfette in die Gesamtformel eingesetzt; dieser Mittelwert S wird errechnet durch Einsetzen der Triglyceriddaten der reinen Fremdfette in diese Formel und Ermittlung des Durchschnittswerts (S_F = 7,46). Gute quantitative Ergebnisse für Fremdfett werden auch anhand der Palmöl/Rindertalg-Formel (Tabelle 2) und mit einem Mittelwert für S_F von 10,57 erzielt. Bei bekannten Fremdfett-Typen sind folgende S_F-Werte in die vorstehende Formel einzusetzen, wobei die entsprechende Fremdfettformel gemäß S Tabelle 2 zu verwenden ist

Tabelle 5: S_F-Werte für verschiedene Fremdfette

Fremdfett	SF
Sojaöl	8,18
Sonnenblumenöl	9,43
Olivenöl	12,75
Kokosfett	118,13
Palmöl	7,55
Palmkernfett	112,32
Rapsöl	3,30
Leinöl	4,44
Weizenkeimöl	27,45
Maiskeimöl	9,29
Baumwollöl	41,18
Schmalz	177,55
Rindertalg	17,56
Fischöl	64,12

10.

Anwendungsbereich der Nachweismethode

Die beschriebene Methode ist anwendbar bei Sammelmilch und basiert auf der Repräsentativität der Milchfettproben. Ein sehr spezifischer Nachweis wäre möglich, wenn für eine repräsentative Anzahl von Milchfetten Formeln wie die vorstehenden für verschiedene Länder abgeleitet würden. Es könnten besonders geeignete Nachweismöglichkeiten erzielt werden, wenn in den einzelnen Ländern solche Formeln auf der Grundlage einer repräsentativen Zahl von Milchfetten aufgestellt würden. In diesem Fall benötigt man keine komplizierten Computerprogramme, wenn die Triglyceridkombinationen gemäß Tabelle 2 angewandt werden und die Faktoren unter Verwendung der Methode der kleinsten Quadrate neubestimmt werden. Durch Anwendung der S-Bereiche gemäß Tabelle 3 sind die Formeln bei Vorliegen bestimmter Fütterungsbedingungen wie Unterfütterung oder Verfütterung von Futterhefe oder Ca-Seifen an Kühe allgemein anwendbar. Nur im Fall extremer Fütterungsbedingungen (z. B. hohe Aufnahme von reinen Ölsaaten, Verfütterung großer Mengen von Ca-Seifen zusammen mit Futterfett usw.) ergibt sich aus der Formel teilweise ein modifiziertes Milchfett.

Anmerkung:

Fraktionierte Milchfette werden allgemein als unmodifiziertes Fett erkannt, wenn eine Modifizierung bei Überschreiten der Grenzwerte angenommen wird. Nur bei fraktioniertem Milchfett mit ungewöhnlicher Milchfettzusammensetzung, wie beispielsweise im Fall einer durch Fraktionierung mit physikalischen Methoden bei hoher Temperatur von ungefähr 30 °C und mit geringer Ausbeute von einigen Prozent oder mit überkritischen CO₂ erhaltenen harten Fraktion zeigt die Formel ein modifziertes Milchfett an.

Milchfettfraktioniemng kann jedoch durch andere Verfahren, z. B. Differential-Scanning-Kaloriemetrie nachgewiesen werden.

11.

Genauigkeit

Ermittelt unter Verwendung von Milchfetten auf der Grundlage der Formel aus Tafel 2 und der S-Werte aus Tafel 3.

11.1.

Wiederholbarkeit

Differenz der S-Werte zweier Untersuchungen, die nach demselben Verfahren mit identischem Untersuchungsmaterial unter denselben Bedingungen (derselbe Untersucher, dieselben Geräte, dasselbe Labor) unmittelbar nacheinander durchgeführt werden.

Tabelle 6: Wiederholbarkeitsgrenzwerte (r) für die verschiedenen Formeln

Formel für den Nachweis von	r
Sojaöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Rapsöl, Leinöl, Weizenkeimöl, Maiskeimöl, Baumwollöl, Fischöl	0,67
Kokos- und Palmkernfett	0,12
Palmöl und Rindertalg	1,20
Schmalz	0,58
Gesamtformel	1,49

11.2.

Vergleichbarkeit

Differenz der S-Werte zweier Untersuchungen, die nach demselben Verfahren mit identischem Untersuchungsmaterial unter verschiedenen Bedingungen (verschiedene Untersucher, verschiedene Geräte, verschiedene Labors) zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt werden.

Tabelle 7: Vergleichbarkeitsgrenzwert (R) für die verschiedenen Formeln

Formel für den Nachweis von	R
Sojaöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Rapsöl, Leinöl, Weizenkeimöl, Maiskeimöl, Baumwollöl, Fischöl	1,08
Kokos- und Palmkernfett	0,40
Palmöl und Rindertalg	1,81
Schmalz	0,60
Gesamtformel	2,07

11.3.

Kritische Differenz

Anhand der Wiederholbarkeits- (r) und der Vergleichbarkeitsgrenzwerte (R) können die kritischen Differenzen für alle S-Werte der Tabelle 3 errechnet werden (Doppelanalysen). Die betreffenden Werte sind in Tabelle 8 aufgeführt.

Tabelle 8: Kritische Differenzen für alle Triglyceridformeln

Formel für den Nachweis von	Bereich
Sojaöl, Sonnenblumenöl, Olienöl, Rapsöl, Leinöl, Weizenkeimöl, Maiskeimöl, Baumwollöl, Fischöl	97,43-102,57
Kokos- und Palmkernfett	99,14-100,86
Palmöl und Rindertalg	94,91-105,09
Schmalz	97,65-102,35
Gesamtformel	94,58-105,42

11.4.

Zuverlässigkeitsbedingungen

Alle geeichten, auf zwei Stellen hinter dem Komma gerundeten C24-, C26- und C28- bis C30-Triglyceridgehalte sowie Cholesterolgehalte sind exakt auf 100 zu normieren. Die Ergebnisse der Doppelanalyse werden zur Überprüfung der Wiederholbarkeit verwendet. Die Wiederholbarkeit gilt als erfüllt, wenn die absolute Differenz der S-Werte zweier Untersuchungen für alle 5 Triglyceridformeln die Wiederholbarkeitsgrenzwerte r gemäß Tabelle 6 nicht überschreitet. Zur Kontrolle der optimalen Gaschromatographiebedingungen und insbesondere der Säulengüte solle sichergestellt sein, daß bei zehn Durchlaufwiederholungen die Differenz zwischen dem größten und dem kleinsten S-Wert aller 5 Triglyceride innerhalb des Bereichs x · r liegt; hierin sind x = 1,58 (für 10 Durchläufe vgl. Literatur (16)) und r die Wiederholbarkeitsgrenzwerte für die verschiedenen Formeln gemäß Tabelle 6.

12.

Zitierte Normen

DIN 10336: 1994	Nachweis und Bestimmung von Fremdfetten in Milchfett anhand einer gaschromatographischen Triglyceridanalyse
IDF Standard 1C: 1987	Milk Determination of Fat Content — Röse Gottlieb Gravimetric Method
IDF Standard 16C: 1987	Cream Determination of Fat Content — Röse Gottlieb Gravimetric Method
IDF Standard 116A: 1987	Mild-Based Edible Ices and Ice Mixtures. Determination of Fat Content — Röse Gottlieb Gravimetric Method
IDF Standard 22B: 1987	Skimmed Milk, Whey & Buttermilk Determination of Fat Content — Röse Gottlieb Gravimetric Method

13.

Literatur

1.

Kommission der Europäischen Gemeinschaften: Nachweis von Fremdfett in Milchfett durch gaschromatographische Triglyceridanalyse, Dok. Nr. VI/5202/90-EN, VI/2645/91.

2.

Kommission der Europäischen Gemeinschaften: Kontrolle der Reinheit von Butterfett anhand von 100 verschiedenen Proben aus verschiedenen Fütterungszeiträumen aus 11 EG-Staaten, Dok. Nr. VI/4577/93.

3.

Kommission der Europäischen Gemeinschaften: Auswertung der Ergebnisse des ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten EG-Ringversuchs: Nachweis von Triglyceriden in Milchfett, Dok. Nr. VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92, VI/4604/93.

4.

Timms, R. E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47 295-303 (1980).

5.

Precht, D., Heiner. K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen 41 406-410 (1986).

6.

Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die Triglyceridanalyse. Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 20-35 (1987).

7.

Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 143-157 (1989).

8.

Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 119-128 (1990).

9.

Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 139-154 (1990).

10.

Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219-242 (1991).

11.

Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93 538-544 (1991).

12.

Precht, D.: Detection for foreign fat in milk fat. I. Qualitative detection by triacylglycerol formulae. II. Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. (1992).

13.

Precht, D.:  „Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids an packed columns” in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of Lipids, p. 123-138, Ed. K. D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).

14.

Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16-17 (1993).

15.

Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265-270 (1994).

16.

Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme, Springer-Verlag, Berlin, P. 378 (1970).