1.

Ziel

Bestimmung des Gehalts an Magermilchpulver in einem Mischfuttermittel über Parakasein nach enzymatischer Gerinnung.

2.

Anwendungsbereich

Diese Methode gilt für Mischfuttermittel mit einem Anteil an Magermilchpulver von mindestens 10 %; das Vorhandensein größerer Mengen von Buttermilch und/oder bestimmter Nichtmilchproteine kann Interferenzen zur Folge haben.

3.

Grundlagen der Methode

3.1.

Lösung des im Mischfuttermittel enthaltenen Kaseins durch Extraktion mit Natriumzitrat.

3.2.

Wiederherstellung der zur Ausfällung des Kaseins notwendigen Kalziumionenkonzentration; Umwandlung des Kaseins zu Parakasein durch Einwirkung von Lab.

3.3.

Bestimmung des Parakaseinstickstoffs nach Aufschluß nach dem Kjeldahl-Verfahren gemäß Der IDF 20 A 1986 Berechnung des Gehalts an Milchpulver aufgrund eines Kaseingehalts von mindestens 27,5 % (vgl. Nummer 9.1).

4.

Reagenzien

Die Reagenzien müssen den zu Analysezwecken erforderlichen Reinheitsgrad aufweisen. Als Wasser ist destilliertes Wasser oder Wasser von gleichem Reinheitsgrad zu verwenden. Mit Ausnahme des Labs (4.5) müssen alle verwendeten Reagenzien und Lösungen frei von stickstoffhaltigen Stoffen sein.

4.1.

Trinatriumzitrat als Dihydrat (Lösung zu 1 % G/V).

4.2.

Kalzuiumchlorid (2M-Lösung). 20,018 g CaCo₃ (analysenrein) in einem Porzellangefäß angemessener Größe (150 bis 200 ml) oder einem Becherglas abwiegen. Mit destilliertem Wasser bedecken und in ein siedendes Wasserbad setzen. Langsam 50 bis 60 ml einer HCl-Lösung (Konzentration HCl: Wasser = 1:1) zusetzen, um das Karbonat vollkommen aufzulösen. Bis zur Trocknung von CaCl₂ im siedenden Wasserbad halten, um das HCl auszutreiben, das nicht reagiert hat. Mit destilliertem Wasser in einen Meßkolben von 100 ml überführen und bis zum Eichstrich auffüllen. Den pH-Wert kontrollieren, der nicht unter 4,0 liegen darf. Die Lösung im Kühlschrank aufbewahren.

4.3.

Natriumhydroxid 0,1 N.

4.4.

Salzsäure 0,1 N.

4.5.

1:10000 standardisierte Lablösung (reines Kälbermangenlab); im Kühlschrank bei 4 bis 6 °C aufbewahren.

4.6.

Reagenzien für die Stickstoffbestimmung nach dem Kjeldahl-Verfahren nach der IDF 20 A 1986.

5.

Geräte

Übliche Laborgeräte, insbesondere:

5.1.

Mörser oder Homogenisierungsgerät (Homogenisator)

5.2.

Analysewaage

5.3.

Tischzentrifuge (2000 bis 3000 Umdrehungen/Minute) mit 50-ml-Zentrifugenröhren

5.4.

Magnetrührwerk mit Rührstäben von 10 bis 15 mm

5.5.

Bechergläser mit 150 bis 200 ml

5.6.

Destillierkolben 250 ml und 500 ml

5.7.

Glastrichter, Durchmesser 60 bis 80 mm

5.8.

Aschefreie Schnellfiltrier-Rundfilter, Durchmesser 150 mm (S.S. 589², S.S. 595 1/2)

5.9.

Pipetten verschiedener Größe

5.10.

Wasserbad thermostatisierbar auf 37 °C

5.11.

pH-Meßgerät

5.12.

Kjeldahl-Aufschluß- und Destillierkolben mit Zubehör

5.13.

Meßbürette 25 ml zum Titrieren

5.14.

Spritzflasche für destilliertes Wasser

5.15.

Rührspachtel aus Edelstahl (rostfreiem Stahl)

5.16.

Thermometer

5.17.

Thermostatisierbarer Trockenschrank.

6.

Verfahren

6.1.

Probenvorbereitung.

10 bis 20 g Probe in einem Mörser zerkleinern oder im Homogenisiergerät (Mischer) durchführen, um eine homogene Mischung zu erhalten.

6.2.

Milchpulver auflösen und nichtlöslichen Rückstand abtrennen.

6.2.1.

1,000 ± 0,002 g gut homogenisiertes Mischfutter (6.1) direkt in ein Zentrifugierrohr von 50 ml einwägen. 30 ml Trinatriumzitrat (4.1), das auf 45 °C erwärmt worden ist, hinzufügen. Pulver 5 Minuten durch Rühren mittels Magnetrührer auflösen.

6.2.2.

10 Minuten bei 500 g (2000 bis 3000 Umdrehungen/Minute) zentrifugieren und den Überstand in ein Becherglas von 150 bis 200 ml abgießen. Der Verlust an Niederschlag während des Abgießens ist zu vermeiden.

6.2.3.

Zwei weitere Extraktionen aus dem Rückstand werden nach dem gleichen Verfahren durchgeführt; die drei wäßrigen Extrakte mischen.

6.2.4.

Scheidet sich Fett ab, so kühle man bis zur Verfestigung der Fettphase ab und entferne diese mit einem Spachtel.

6.3.

Gerinnung des Kaseins durch Labenzyme.

6.3.1. Zum wäßrigen Gesamtextrakt (rund 100 ml) tropfenweise unter Umrühren 3,4 ml gesättigte Kalziumchloridlösung (4.2) hinzufügen. pH mit verdünnter NaOH (4.3) oder HCl (4.4) auf 6,4 bis 6,5 einstellen. Lösung 15 bis 20 Minuten in einem thermostatisierbaren Wasserbad von 37 °C lassen, bis sich das Salzgleichgewicht eingestellt hat. Dies äußert sich durch ein milchiges Aussehen.

6.3.2. Die Flüssigkeit in ein (oder zwei) Zentrifugenröhrchen umfüllen und 10 Minuten bei 2000 g zentrifugieren, um die Ausfällungen zu entfernen. Den Überstand ohne Waschen des Niederschlags in ein (oder zwei) Zentrifugenröhrchen abgießen.

6.3.3. Den Überstand wieder auf eine Temperatur von 37 °C bringen. Tropfenweise unter Umrühren 0,56 ml der Lablösung (4.5) hinzufügen. Die Gerinnung tritt nach 1 bis 2 Minuten ein.

6.3.4. Die Probe ins Wasserbad zurückstellen und 15 Minuten bei einer Temperatur von 37 °C stehen lassen. Aus dem Wasserbad nehmen und das Koagulum durch Umrühren aufbrechen. 10 Minuten bei 2000 g zentrifugieren. Den Überstand durch ein geeignetes Filterpapier⁽¹⁾ (Whatman Nr. 541 oder ähnliches) filtern. Das Filterpapier aufbewahren. Den Niederschlag in dem Zentrifugenröhrchen mit 50 ml Wasser und bei einer Temperatur von rund 35 °C durch Umrühren waschen. Nochmals 10 Minuten bei 2000 g zentrifugieren. Den Überstand durch das vorher aufbewahrte Filterpapier filtern.

6.4.

Bestimmung des Kaseinstickstoffs.

6.4.1.

Nach dem Waschen den Niederschlag unter Verwendung von destilliertem Wasser quantitativ auf das gemäß Nummer 6.3.4 aufbewahrte Filterpapier überführen. Das Filterpapier in den Kjeldahl-Kolben einbringen. Den Stickstoff nach dem in der IDF 20 A 1986 festgelegten Kjeldahl-Verfahren bestimmen.

7.

Blindversuch

7.1.

Ein Blindversuch mit einem aschenfreien Filter (5.8), der mit einer Mischung aus 90 ml einer Natriumzitratlösung (4.1), 1 ml einer gesättigten Kalziumchloridlösung (4.2), 0,5 ml flüssigem Lab (4.5) benetzt und vor der Mineralisierung nach dem Kjeldahl-Verfahren gemäß der IDF 20 A 1986 mit 3 × 15 ml gewaschen wird, ist systematisch durchzuführen.

7.2.

Das für den Blindversuch erforderliche Säurevolumen (4.4) von dem zur Titration der geprüften Musterprobe verbrauchten Volumen abziehen.

8.

Kontrollversuch

8.1. Zur Kontrolle des Analyseverfahrens und der oben erwähnten Reagenzien ist eine Bestimmung mit einem Mischfutter von standardisierter Zusammensetzung durchzuführen, dessen bekannter Gehalt an Magermilchpulver über eine Ringanalyse bestimmt worden ist. Das durchschnittliche Ergebnis einer Doppelbestimmung soll um nicht mehr als 1 % von dem durch die Ringanalyse erhaltenen Ergebnis abweichen.

9.

Darstellung der Ergebnisse

9.1. Der Gehalt an Magermilchpulver in einem Mischfuttermittel wird nach folgender Formel berechnet:% MMP = N × 6,3827,5 × 100 - 2,810,908 wobei N = Prozentsatz des Parakasein-Stickstoffes; 27,5 = Faktor zur Umrechnung des ermittelten Kaseins in Prozent Magermilchpulver; 2,81 und 0,908 die aus der Regressionsanalyse erhaltenen Berichtigungsfaktoren.

10.

Genauigkeit des Verfahrens

10.1.

Wiederholbarkeit

In mindestens 95 % der untersuchten Fälle darf der Unterschied zwischen zwei einzelnen mit der gleichen Probe im gleichen Labor vom gleichen Prüfer erhaltenen Ergebnissen 2,3 g Magermilchpulver auf 100 g geprüftes Mischfutter nicht übersteigen.

10.2.

Reproduzierbarkeit

In mindestens 95 % der untersuchten Fälle darf der Unterschied zwischen den von zwei Laboratorien mit einer gleichen Probe erhaltenen Ergebnissen 6,5 g Magermilchpulver auf 100 g untersuchtes Mischfutter nicht übersteigen.

11.

Toleranzgrenze

Der Cr-D₉₅-Wert (kritische Differenz; 95 %-Vertrauensbereich) wird anhand folgender Formel berechnet (ISO 5725):CrD95 = 122 2R2 - r2n - 1n (R: Reproduzierbarkeit; r: Wiederholbarkeit) Doppelbestimmung: CrD₉₅ = 4,5 g. Wenn die Differenz zwischen dem Ergebnis der chemischen Analyse (Doppelbestimmung) und dem deklarierten Magermilchpulvergehalt maximal 4,5 g beträgt, geht man davon aus, daß die Lieferung des Mischfuttermittels dieser Bestimmung der Verordnung entspricht.

12.

Bemerkungen

12.1.

Die Zugabe größerer Mengen bestimmter Nichtmilchproteine, insbesondere Sojaproteine, führt — wenn sie mit der Milch erwärmt worden sind — zu hohen Ergebnissen, da Coprezipitation dieser Stoffe gleichzeitig mit Milchparakasein erfolgt.

12.2.

Die Zugabe von Buttermilch kann gegebenenfalls zu niedrigen Werten führen, da bei der Bestimmung nur der fettfreie Anteil erfaßt wird. Die Zugabe bestimmter aus Sauerrahm gewonnener Buttermilcharten kann zu deutlich niedrigeren Werten führen, da sie in der Zitrat-Lösung nur unvollständig gelöst werden.

12.3.

Die Zugabe von mindestens 0,5 % Lezithin kann ebenfalls zu niedrige Ergebnisse zur Folge haben.

12.4.

Die Einbeziehung von auf hohe Temperaturen (high-heat) erwärmtem Milchpulver kann zu hohe Werte zur Folge haben, da bestimmte Molkenproteine mit dem Parakasein der Milch ausfällen.