1. Zweck: Nachweis des Zusatzes von Labmolkenpulver zu:

a)

Magermilchpulver im Sinne von Artikel 1 der Verordnung (EWG) Nr. 986/68 und

b)

Mischungen im Sinne von Artikel 1 Absatz 3 der Verordnung (EWG) Nr. 1725/79.

2.

Referenzverfahren: Internationale Norm ISO 707.

Milch und Milcherzeugnisse: Probenahmeverfahren gemäß den Leitlinien des Anhangs I Nummer 2 Buchstabe c) der Verordnung (EWG) Nr. 625/78.

3.

Begriff

Unter dem Gehalt an Labmolkenpulver wird der nach diesem Verfahren bestimmte Massenanteil in Prozent verstanden.

4.

Kurzbeschreibung

Bestimmung des Gehalts an Glycomakropeptid A gemäß Anhang V der Verordnung (EWG) Nr. 625/78. Proben mit positivem Ergebnis werden mit dem HPLC-Verfahren (Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie) auf Glycomakropeptid A untersucht. Das Ergebnis wird im Vergleich zu Standardproben aus molkefreiem und molkehaltigem Magermilchpulver mit bekanntem Gehalt ausgewertet. Labmolkenpulver gilt als nachgewiesen, wenn das Ergebnis größer ist als 1 % Massenanteil.

5.

Reagenzien

Alle Reagenzien müssen von anerkannt analysenreiner Qualität sein. Bei dem verwendeten Wasser handelt es sich um destilliertes Wasser oder Wasser eines mindestens gleichwertigen Reinheitsgrads. Die Reinheit von Acetonitril muß den Anforderungen der Spektroskopie bzw. der HPLC genügen. Die für das Verfahren nach der Verordnung (EWG) Nr. 625/78 erforderlichen Reagenzien sind im Anhang V der genannten Verordnung aufgeführt. Reagenzien für die Umkehrphasen-HPLC:

5.1.

Trichloressigsäurelösung

240 g Trichloressigsäure (CCl₃COOH) werden in Wasser gelöst und auf 1000 ml aufgefüllt.

5.2.

Elutionsmittel A und B

Elutionsmittel A: 150 ml Acetonitril (CH,CN), 20 ml Isopropanol (CH₃CHOHCH₃) und 1,00 ml Trifluoressigsäure (TFA, CF₃COOH) werden mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Elutionsmittel B: 550 ml Acetonitril, 20 ml Isopropanol und 1,00 ml Trifluoressigsäure (TFA) werden mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Vor der Verwendung wird die Elutionslösung durch ein Membranfilter mit 0,45 μm Porendurchmesser filtriert.

5.3.

Konservierung der Säule

Nach den Analysen wird die Säule mit Elutionsmittel B (über einen Gradienten) und danach mit Acetonitril (über einen Gradienten in 30 Minuten) gespült. Die Säule wird in Acetonitril aufbewahrt.

5.4.

Standardproben

5.4.1.

Magermilchpulver entsprechend den Anforderungen der Verordnung (EWG) Nr. 625/78 (d. h. [0]).

5.4.2.

Dasselbe Magermilchpulver versetzt mit 5 % Massenanteil Labmolkenpulver der Standardzusammensetzung (d. h. [5]).

5.4.3.

Dasselbe Magermilchpulver versetzt mit 50 % Massenanteil Labmolkenpulver der Standardzusammensetzung (d. h. [50])^(*).

6.

Geräte

Die für das Verfahren nach der Verordnung (EWG) Nr. 625/78 erforderlichen Geräte sind im Anhang V der genannten Verordnung aufgeführt. Geräte für die Umkehrphasen-HPLC:

6.1.

Analysenwaage;

6.2.

Zentrifuge zur Erzeugung einer Zentrifugalbeschleunigung von 2200 g, ausgerüstet mit verschließbaren Röhrchen mit ca. 50 ml Volumen;

6.3.

mechanisches Schüttelgerät zum Schütteln bei 50 °C;

6.4.

Magnetrührer;

6.5.

Glastrichter, ca. 7 cm Durchmesser;

6.6.

Filterpapier, mittlere Filtriergeschwindigkeit, ca. 12,5 cm Durchmesser;

6.7.

Filtriervorrichtung aus Glas mit Membranfilter, 0,45 μm Porendurchmesser;

6.8.

graduierte Pipetten, Nennvolumen 10 ml (lSO 648, Klasse A oder ISO/R 835) bzw. ein Pipettiersystem zum Überführen von 10,0 ml in 2 Minuten;

6.9.

thermostatisierbares Wasserbad, einstellbar auf 25°C ± 0,5 °C;

6.10.

HPLC-Ausrüstung, bestehend aus:

6.10.1.

Pumpensystem für binäre Gradienten,

6.10.2.

Injektionsventil, manuell oder automatisch, Nennvolumen 100 μm,

6.10.3.

Dupont-Protein-Plus-Säule (25 × 0,46 cm Innendurchmesser) oder gleichwertige großporige Umkehrphasen-Säule auf Silicagelbasis,

6.10.4.

thermostatisierbarer Säulenofen, einstellbar auf 35 °C ± 1 °C,

6.10.5.

UV-Detektor mit variabler Wellenlängeneinstellung zur Messung bei 210 nm mit einer Empfindlichkeit von 0,02 Å (bei Bedarf kann auch eine Wellenlänge von bis zu 220 nm verwendet werden),

6.10.6.

Integrator zur Messung der Peak-Höhe.

Hinweis:

Die Säule kann auch bei Raumtemperatur betrieben werden, sofern diese um höchstens 1 °C schwankt; andernfalls verändert sich die Retentionszeit für GMP_A zu stark.

7.

Probenahme

7.1. Internationale Norm ISO 707 — Milch und Milcherzeugnisse — Probenahmeverfahren, entsprechend den Leitlinien des Anhangs I Nummer 2 Buchstabe c) der Verordnung (EWG) Nr. 625/78.

7.2. Die Probe ist so aufzubewahren, daß sie unversehrt bleibt und ihre Zusammensetzung sich nicht ändert.

8.

Verfahren

8.1.

Vorbereitung der Probe

Das Pulver wird in einen ungefähr das doppelte Volumen fassenden Behälter mit luftdichtem Verschluß übergeführt. Der Behälter ist sofort zu verschließen. Das Milchpulver wird durch mehrmaliges Stürzen des Behälters vollständig durchmischt.

8.2.

Probeneinwaage

2000 g ± 0,001 g der Probe werden in ein Zentrifugenröhrchen (6.2) oder ein geeignetes verschließbares Gefäß (50 ml) eingewogen.

8.3.

Entfernen von Fett und Eiweiß

8.3.1. Die Probeneinwaage wird mit 20,0 g warmem Wasser (50 °C) versetzt. Zum Auflösen wird das Pulver mit Hilfe eines mechanischen Schüttelgerätes (6.3) 5 Minuten bzw. bei saurer Buttermilch 30 Minuten gerüttelt. Das Röhrchen wird in ein Wasserbad (6.9) übergeführt und bei 25 °C stehen gelassen.

8.3.2. 10,0 ml Trichloressigsäurelösung von 25 °C (5.l) werden gleichmäßig innerhalb von 2 Minuten unter kräftigem Rühren mit Hilfe des Magnetrührers (6.2) zugesetzt. Das Röhrchen wird in ein Wasserbad (6.9) gestellt und 60 Minuten stehen gelassen.

8.3.3. Die Probe wird 10 Minuten lang bei 2200 g zentrifugiert (6.2) oder durch Filterpapier (6.6) filtriert, wobei die ersten 5 ml des Filtrats zu verwerfen sind.

8.4.

Cbromatographische Bestimmung

8.4.1. Eine HPLC-Analyse gemäß Anhang V der Verordnung (EWG) Nr. 625/78 wird durchgeführt. Bei negativem Befund enthält die analysierte Probe keine nachweisbaren Mengen an Labmolkenpulver. Bei positivem Befund ist das nachstehend beschriebene Umkehrphasen-HPLC-Verfahren durchzuführen. Bei Anwesenheit von saurem Buttermilchpulver kann es zu falsch-positiven Ergebnissen kommen. Dies ist beim Umkehrphasen-HPLC-Verfahren ausgeschlossen.

8.4.2. Bevor das Umkehrphasen-HPLC-Verfahren durchgeführt wird, sind die Gradientenbedingungen zu optimieren. Eine GMP_A-Retentionszeit von 26 Minuten ± 2 Minuten ist optimal für Gradientensysteme mit einem Totvolumen von ca. 6 ml (Volumen ab der Stelle, an der die Lösungsmittel zusammentreffen, bis einschließlich Volumen der Probenschleife). Bei Gradientensystemen mit geringerem Totvolumen (z. B. 2 ml) ist eine Retentionszeit von 22 Minuten optimal. Zu analysieren sind Lösungen labmolkenfreier Standardproben (5.4) und von Standardproben mit 50 % Labmolkeanteil. 100 μl des Überstandes bzw. Filtrates (8.3.3) werden in die HPLC-Apparatur injiziert, die unter den in Tabelle 1 genannten Bedingungen (Testgradient) betrieben wird.

Tabelle 1 —

Testgradientenbedingungen für eine optimale chromatographische Bestimmung

Zeit (Minuten)	Fluß (ml/Minute)	% A	% B	Kurve
Start	1,0	90	10	*
27	1,0	60	40	lin
32	1,0	10	90	lin
37	1,0	10	90	lin
42	1,0	90	10	lin

Beim Vergleich beider Chromatogramme müßte die Lage des GMP_A-Peaks festzustellen sein. Die Zusammensetzung der Ausgangslösung für den Normalgradienten (8.4.3) ergibt sich aus der nachstehenden Formel:% B = 10 - 2,5 + (13,5 + RTgmpA - 26/6]*30/27% B = 7,5 13,5 + RTgmpA - 26/6*1,11). Hierin bedeuten:

RTgmpA:

GMP-Retentionszeit im Testgradienten,

10:

Ausgangs- % B des Testgradienten,

2,5:

% B zur halben Laufzeit minus % B beim Start im Normalgradienten,

13,5:

halbe Laufzeit des Testgradienten,

26:

erforderliche Retentionszeit für GMP_A,

6:

Verhältnis der Steigungen von Testgradient und Normalgradient,

30:

% B zu Beginn minus % B nach 27 Minuten im Testgradienten,

27:

Laufzeit des Testgradienten.

8.4.3. Analyse von Lösungen der Testproben Genau 100 μl des Überstandes bzw. Filtrates (8.3.3) werden in die HPLC-Apparatur injiziert, die bei einer Flußrate des Elutionsmittels (5.2) von 1,0 ml/Minute zu betreiben ist. Die Zusammensetzung des Elutionsmittels beim Start der Analyse ist 8.4.2 zu entnehmen. Normalerweise entspricht sie einem Verhältnis vonA: B = 76: 24 (5.2). Sofort nach der Injektion kommt es zur Ausbildung eines linearen Gradienten, der nach 27 Minuten einen um 5 % höheren prozentualen Anteil von B ergibt. Danach beginnt ein Gradient, bei dem sich die Zusammensetzung des Elutionsmittels in 5 Minuten auf 90 % B einstellt. Diese Zusammensetzung bleibt 5 Minuten konstant, um dann innerhalb von 5 Minuten mit einem linearen Gradienten wieder auf die Zusammensetzung beim Start abzufallen. Je nach Fassungsvermögen des Pumpensystems kann die nächste Injektion 15 Minuten nach Erreichen der Ausgangsbedingungen durchgeführt werden.

Hinweise:

1.

Die Retentionszeit für Glycomakropeptid sollte 26 Minuten ± 2 Minuten betragen. Dies kann durch Veränderung der Ausgangs- und Endbedingungen des ersten Gradienten erreicht werden. Die prozentuale Differenz von B am Anfang und Ende des ersten Gradienten muß jedoch in jedem Fall 5 % B betragen.

2.

Die Elutionsmittel müssen ausreichend entgast werden und in diesem Zustand gehalten werden. Dies ist für den einwandfreien Betrieb des Gradientenpumpsystems von wesentlicher Bedeutung. Die Standardabweichung der Retentionszeit für den GMP-Peak sollte kleiner sein als 0,1 Minute (n = 10).

3.

Bei jeder fünften Probe sind die Standardprobe (5] zu injizieren und ein neuer Kalibrierfaktor R (9.1.1) zu bestimmen.

8.4.4. Im Chromatogramm der Testprobe [E] hat der GMP-Peak eine Retentionszeit von ca. 26 Minuten. Der Integrator (6.10.6) errechnet automatisch die Peak-Höhe H des GMP-Peaks. Die Lage der Basislinie ist bei jedem Chromatogramm zu prüfen. Bei unrichtiger Lage der Basislinie ist die Analyse bzw. die Integration erneut durchzuführen. Vor der quantitativen Bestimmung sind die Chromatogramme unbedingt auf Unregelmäßigkeiten zu überprüfen, die sich durch Betriebsstörungen der Apparatur bzw. der Säule oder aufgrund von Herkunft oder Art der analysierten Probe ergeben können. Im Zweifelsfall ist die Analyse zu wiederholen.

8.5.

Kalibirierung

8.5.1. Die Standardproben (5.4.1 und 5.4.2) werden genau demselben Verfahren wie bei 8.2 bis 8.4.4 unterzogen. Dabei sind frisch angesetzte Lösungen zu verwenden, da GMP in achtprozentiger Trichloressigsäure bei Raumtemperatur abgebaut wird. Die Lösung ist bei 4 °C 24 Stunden haltbar. Bei langen Versuchsreihen empfiehlt es sich, im automatischen Aufgabensystem einen gekühlten Probenträger zu verwenden.

Hinweis:

8.4.2 kann entfallen, sofern der prozentuale Anteil von R beim Start der Analyse aus vorangehenden Analysen bekannt ist.

Das Chromatogramm der Referenzprobe [5] sollte wie in Abbildung 1 aussehen. Diese Abbildung zeigt zwei kleine Peaks vor dem GMP_A-Peak. Es ist unbedingt für eine analoge Trennung zu sorgen.

8.5.2. Vor der chromatographischen Bestimmung der Proben sind 100 μl der labmolkefreien [5] (5.4.1) Standardprobe zu injizieren. Das entsprechende Chromatogramm darf bei der Retentionszeit des GMP-_A-Peaks keinen Peak zeigen.

8.5.3. Der Kalibrierfaktor R ist nach Injektion des gleichen Filtratvolumens wie bei den Proben (8.5.1 ) zu bestimmen.

9.

Darstellung der Ergebnisse

9.1.

Berechnungsformel

9.1.1. Berechnung des Kalibrierfaktors RGMP-Peak: R = W/H Hierin bedeuten

R=

Kalibrierfaktor des GMP-Peaks,

H=

Höhe des GMP-Peaks,

W=

Labmolkegehalt der Standardprobe [5].

9.2.

Berechnung des Labmolkenpulvergehalts der Probe in Prozent

W[E] = R × H[E] Hierin bedeuten:

W[E]=

prozentualer Massenanteil an Labmolkenpulver in der Probe [E],

R=

Kalibrierfaktor des GMP-Peaks (9.1.1),

H[E]=

Höhe des GMP-Peaks der Probe [E].

Ist W[E] größer als 1 % und ist die Differenz zwischen der entsprechenden Retentionszeit und der der Standardprobe [5] kleiner als 0,2 Minuten, so enthält die Probe Labmolkenpulver.

9.3.

Genauigkeit der Methode

9.3.1.

Wiederholbarkeit:

Die Differenz der Ergebnisse zweier Untersuchungen, die mit identischem Untersuchungsmaterial unter denselben Versuchsbedingungen von demselben Untersucher gleichzeitig oder unmittelbar nacheinander durchgeführt werden, darf den Wert 0,2 % Massenanteil nicht überschreiten.

9.3.2.

Vergleichbarkeit

Nicht bekannt.

9.3.3.

Linearität

Im Bereich von 0 bis 16 % Labmolkenpulveranteil muß Linearität bei einem Korrelationskoeffizienten von > 0,99 gegeben sein.

9.4.

Auswertung

9.4.1. Labmolke gilt als nachgewiesen, wenn man gemäß Nummer 9.2 mehr als 1 % Massenanteil findet und die Retentionszeit des GMP-Peaks um weniger als 0,2 Minuten von der der Standardprobe [5] abweicht. Die 1-%-Grenze wurde gemäß den Vorschriften des Anhangs V Nummern 9.2 und 9.4.1 der Verordnung (EWG) Nr. 625/79 festgesetzt.