BESTIMMUNG DES VANILLIN-GEHALTS IN BUTTERFETT, BUTTER ODER RAHM DURCH HPLC

1.

GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH

Beschrieben wird ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Vanillin in Butter, Butterfett oder Rahm.

2.

KURZBESCHREIBUNG

Extraktion einer bekannten Probemenge mit Hilfe eines Isopropanol-Ethanol-Acetonitril-Gemisches (1:1:2); Abscheidung des Hauptteils des Fetts durch Kühlung bei –15 °C bis –20 °C und anschließendes Zentrifugieren. Nach Verdünnung mit Wasser Bestimmung des Vanillingehalts durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (HPLC).

3.

APPARATUR

Normale Laborausstattung und insbesondere:

3.1. Gefrierschrank zur Kühlung auf einen Temperaturbereich von –15 bis –20 °C;

3.2. Einwegspritzen mit einem Fassungsvermögen von 2 ml;

3.3. Membranmikrofilter (Porengröße 0,45 μm), beständig gegen eine Lösung mit 5 % Extraktionslösung (4.4);

3.4. Flüssigkeitschromatografie-System, bestehend aus einer Pumpe (Durchfluss von 1,0 ml/min), einem Injektor (20 μl Injektionsvolumen, automatisch oder manuell), einem UV-Detektor (306 nm, 0,01 Å gesamter Bereich), einem Aufzeichnungsgerät oder Integrator und einem Säulenthermostat für eine Betriebstemperatur von 25 °C;

3.5. Analysesäule (250 mm × 4,6 mm ID), gepackt mit LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) oder gleichwertigem Material;

3.6. Vorsäule (ca. 20 mm × 3 mm ID), trocken gepackt mit LiChrospher RP 18 (5 bis 10 μm) oder gleichwertigem Material;

3.7. Zentrifuge (2000 Umin^-1).

4.

REAGENZIEN

Alle verwendeten Reagenzien müssen analysenrein sein.

4.1. Isopropanol

4.2. Ethanol 96 % (v/v)

4.3. Acetonitril

4.4. Extraktionslösung Gemisch aus Isopropanol (4.1), Ethanol (4.2) und Acetonitril (4.3) im Verhältnis 1:1:2 (v/v)

4.5. Vanillin (4-Hydroxy-3-methoxy-benzaldehyd) ≥98 %

4.5.1.

Vanillin-Stammlösung (= 500 μg/ml)

Etwa 50 mg Vanillin (4.5) auf 0,1 mg (CM mg) werden genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen; anschließend werden 25 ml Extraktionslösung (4.4) hinzugefügt und mit Wasser aufgefüllt.

4.5.2.

Vanillin-Standardlösung (= 10 μg/ml)

5 ml der Vanillin-Stammlösung (4.5.1) werden in einen 250-ml-Messkolben pipettiert und mit Wasser aufgefüllt.

4.5.3. Methanol, HPLC-Qualität

4.5.4. Eisessigsäure

4.5.5. Wasser, HPLC-Qualität

4.5.6.

HPLC, mobile Phase

300 ml Methanol (4.5.3) werden mit etwa 500 ml Wasser (4.5.5) und 20 ml Essigsäure (4.5.4) in einem 1000-ml-Messkolben gemischt und mit Wasser (4.5.5) aufgefüllt. Dieses Gemisch wird durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 μm (3.3) gefiltert.

5.

VERFAHREN

5.1.

Vorbereitung der Probe

5.1.1.

Butter

Die Probe wird erhitzt, bis sie zu schmelzen beginnt. Eine Überhitzung auf etwa 30 °C ist zu vermeiden. Möglicherweise trennt sich die Butter nicht in zwei Phasen. Wenn die Probe ausreichend pastös ist, ist sie durch Schütteln zu homogenisieren. Nach 15-minütigem Rühren der Butter wird eine Probe genommen. Etwa 5 g (SM g) Butter werden auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen.

5.1.2.

Butterfett

Unmittelbar vor der Probenahme wird der Behälter mit dem Butterfett in einen Ofen mit einer Temperatur von 40 bis 50 °C gegeben und dort belassen, bis das Butterfett vollständig geschmolzen ist. Die Probe wird durch Schütteln oder Rühren vermischt; dabei ist die Bildung von Blasen durch zu starkes Rühren zu vermeiden. Etwa 4 g (SM g) Butterfett werden auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen.

5.1.3.

Rahm

Die Probe wird in einem Wasserbad oder einem Inkubator auf 35 bis 40 °C erwärmt. Anschließend wird das Fett durch Schütteln bzw. wenn nötig durch Rühren homogenisiert. Die Probe wird rasch auf 20 ±2 °C abgekühlt. Nun müsste die Probe homogen aussehen; ansonsten ist das Verfahren zu wiederholen. Etwa 10 g (SM g) Rahm werden auf 1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen.

5.2.

Vorbereitung der Versuchslösung

Zur Probe (5.1.1, 5.1.2 oder 5.1.3) werden etwa 75 ml der Extraktionslösung (4.4) hinzugefügt; anschließend wird ca. 15 Minuten umgerührt oder stark geschüttelt und mit Extraktionslösung (4.4) aufgefüllt. Etwa 10 ml dieses Extrakts werden in ein Reagenzglas mit Stopfen gegeben. Das Reagenzglas wird in den Gefrierschrank (3.1) gesetzt und ca. 30 Minuten stehen gelassen. Der kalte Extrakt wird 5 Minuten bei etwa 2000 min^-1 zentrifugiert und sofort abgegossen. Die abgegossene Lösung muss auf Zimmertemperatur abkühlen. 5 ml der abgegossenen Lösung werden in einen 100-ml-Messkolben pipettiert; danach wird mit Wasser aufgefüllt. Ein Aliquot wird mit einer Spritze (3.2) durch einen Membran-Mikrofilter (3.3) gefiltert. Das Filtrat ist nun für die HPLC bereit.

5.3.

Kalibrierung

5 ml der Vanillin-Standardlösung (4.5.2) werden in einen 100-ml-Messkolben pipettiert. 5 ml Extraktionslösung (4.4) werden hinzugefügt; anschließend wird bis zur Markierung mit Wasser aufgefüllt. Diese Lösung enthält 0,5 μg/ml Vanillin.

5.4.

Bestimmung durch HPLC

Das Chromatografiesystem wird zur Stabilisierung etwa 30 Minuten stehen gelassen. Die Standardlösung (5.3) wird eingespritzt. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis die Differenz der Peak-Flächen oder Peak-Höhen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Einspritzungen weniger als 2 % beträgt. Unter den beschriebenen Bedingungen beträgt die Retentionszeit von Vanillin etwa 9 Minuten. Die Kalibrierlösung (5.3) wird doppelt analysiert, indem 20 μl eingespritzt werden. 20 μl der Versuchslösungen (5.2) werden eingespritzt. Die Peak-Flächen oder -Höhen für Vanillin werden ermittelt. Nach 10 Einspritzungen der Testproben (5.2) wird erneut zweimal die Kalibrierlösung (5.3) eingespritzt.

6.

BERECHNUNG DER ERGEBNISSE

Für jede Partie Versuchslösungen wird die durchschnittliche Peak-Fläche (oder -Höhe) (AC) der Vanillin-Peaks in Zusammenhang mit den Doppeleinspritzungen der Kalibrierlösung jeweils vor und nach einer Probenreihe berechnet (insgesamt 4 Flächen oder Höhen). Der Kalibrierfaktor (R) wird wie folgt berechnet: Dabei ist CM die Masse des Vanillins in mg (4.5.1). Der Vanillin-Anteil (C) der Testprobe (in mg/kg) wird wie folgt berechnet: Dabei sind:

AS=

Peak-Fläche des Vanillin-Peaks der Testprobe

SM=

Masse der Testprobe in g (5.1.1, 5.1.2 oder 5.1.3)

Anmerkung: Bei der Untersuchung von Rahm auf Vanillin wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration als mg Kennzeichnungsmittel/kg Milchfett ausgedrückt. Dazu wird C mit 100/f multipliziert. Mit f wird der Fettgehalt von Rahm in Prozent (m/m) bezeichnet.

20=

Faktor zur Berücksichtigung der Verdünnung der Standard- und der Testprobe

0,96=

Korrekturfaktor für den Fettgehalt in der ersten Verdünnung der Testprobe

Anmerkung: Anstelle von Peak-Flächen können auch Peak-Höhen verwendet werden (siehe 8.3).

7.

GENAUIGKEIT DER METHODE

7.1.

Wiederholbarkeit (r)

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von demselben Analytiker mit denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nacheinander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 16 mg/kg voneinander abweichen.

7.2.

Vergleichbarkeit (R)

Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von Analytikern in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 27 mg/kg voneinander abweichen.

8.

TOLERANZGRENZEN

8.1. Dem gekennzeichneten Erzeugnis sind drei Proben zu entnehmen, um die Homogenität zu prüfen.

8.2. Das Kennzeichnungsmittel wird entweder aus Vanille oder aus synthetischem Vanillin gewonnen.

8.2.1. Die Beimischungsquote für 4-Hydroxy-3-methoxy-benzaldehyd beträgt 250 g je Tonne Butterfett oder Butter. Bei der Kennzeichnung von Rahm beträgt die Beimischungsquote 250 g je Tonne Milchfett.

8.2.2. Die Ergebnisse der drei in der Produktanalyse gewonnenen Proben werden verwendet, um die Quote und die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels zu bestimmen; das niedrigste ermittelte Ergebnis wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—

220,8 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote),

—

158,3 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 220,8 mg/kg und 158,3 mg/kg erhält.

8.3. Das Kennzeichnungsmittel wird ausschließlich aus Vanilleschoten oder deren vollständigen Auszügen gewonnen.

8.3.1. Die Beimischungsquote für 4-Hydroxy-3-methoxy-benzaldehyd beträgt 100 g je Tonne Butterfett oder Butter. Bei der Kennzeichnung von Rahm beträgt die Beimischungsquote 100 g je Tonne Milchfett.

8.3.2. Aufgrund der Ergebnisse der drei aus der Produktanalyse gewonnenen Proben werden die Quote und die Homogenität der Beimischung des Kennzeichnungsmittels geprüft; das niedrigste dieser Ergebnisse wird bezogen auf die folgenden Grenzwerte beurteilt:

—

78,3 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote),

—

53,3 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote).

Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem niedrigsten Ergebnis verwendet, das man durch Interpolierung zwischen 78,3 mg/kg und 53,3 mg/kg erhält.

9.

ANMERKUNGEN

9.1. Die Wiederfindung von Vanillinzusätzen liegt bei einer Menge von 250 mg/kg Butterschmalz zwischen 97 und 103,8 %. Durchschnittlich wurde ein Gehalt von 99,9 % mit einer Standardabweichung von 2,7 % ermittelt.

9.2. Die Standardlösung enthält 5 % Extraktionslösung, um die Peak-Erweiterung durch die in den Proben vorhandenen 5 % Extraktionslösung zu kompensieren. Dadurch wird eine Quantifizierung über die Peak-Höhen möglich.

9.3. Die Analyse basiert auf einer linearen Kalibrierungslinie mit Nullachsenabschnitt.

9.4. Die Linearität sollte bei der ersten Analyse und später in regelmäßigen Abständen sowie nach Änderungen oder Reparaturen der HPLC-Geräte durch Verwendung geeigneter Verdünnungen der Standardlösung (4.5.2) geprüft werden. Vanillin kann durch in unpasteurisiertem Rahm oder in Erzeugnissen aus unpasteurisiertem Rahm enthaltene Enzyme zu Vanillinsäure, Divanillin und sonstigen Verbindungen abgebaut werden.