LAKTOSENACHWEIS IN MISCHFUTTER

1.

GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH

Bestimmung des Laktosegehalts in Mischfutter

2.

HINWEIS

Unter dem Laktosegehalt wird der nach diesem Verfahren bestimmte Massenanteil in Prozent verstanden.

3.

BEGRIFFSBESTIMMUNG

Der Gehalt an wasserfreier Laktose wird in g/100 g ausgedrückt.

4.

KURZBESCHREIBUNG

Das Mischfutter wird in Wasser rekonstituiert. Eine „Biggs” -Lösung wird zu einem verdünnten abgewogenen Aliquot hinzugegeben, um das Fett und die Proteinfraktionen des Mischfutters auszufällen. Die Probe wird gefiltert (oder zentrifugiert), und das Filtrat (oder der Überstand) wird auf eine HPLC-Säule mit Kationenaustauscher (Blei) mit Wasser in HPLC-Qualität als mobiler Phase injiziert. Die eluierte Laktose wird mit einem Differenzrefraktometer bestimmt^(*).

5.

REAGENZIEN

5.1.

Kurzbeschreibung

Wenn nicht ausdrücklich anderweitig angegeben, sind ausschließlich Reagenzien von anerkannter Analysequalität und entgastes Wasser in HPLC-Qualität zu verwenden.

5.2.

Laktose

D-Laktose-Monohydrat ((C₁₂H₂₂)O₁₁H₂O) kann die erhöhte Feuchtigkeit aufnehmen. Vor Gebrauch ist der tatsächliche Wasseranteil nach der Karl-Fisher-Methode zu messen bzw. die erhöhte Feuchtigkeit zu verdampfen, indem die Laktose 8 Stunden in einen Ofen mit einer Temperatur von 105 °C gegeben wird. (Der Kristallwasseranteil der Laktose bleibt bei dieser Behandlung erhalten.)

5.3.

Konzentrierte Biggs/Szijarto-Lösung^(**)

9,10 g Zinkacetatdihydrat (Zn(CH₃COO)₂.2H₂O) und 5,46 g Phosphorwolframsäure-Monohydrat (H₃[P(W₃O₁₀)₄xH₂O]) werden in etwa 70 ml Wasser in HPLC-Qualität (6.8) in einem 100-ml-Messkolben aufgelöst. 5,81 ml Eisessigsäure (CH₃COOH) werden hinzugegeben. Anschließend wird die Lösung bis zur 100-ml-Marke mit Wasser in HPLC-Qualität (6.8) aufgefüllt und gemischt. Die Lösung kann bei Raumtemperatur 1 Jahr gelagert werden.

5.4.

Verdünnte Biggs/Szijarto-Lösung

25 ml konzentrierte Biggs/Szijarto-Lösung (5.3) werden mit Wasser in einem Messkolben bis auf 500 ml aufgefüllt. Die Lösung kann bei Raumtemperatur einen Monat gelagert werden.

5.5.

Vorbereitung des Wassers in HPLC-Qualität

Das ultrareine Wasser (6.8) wird einer Vakuumfiltration (6.9) unterzogen. Um die Pumpleistung zu verbessern und eine stabile Basislinie zu erhalten, ist die mobile Phase täglich durch eines der verfügbaren Verfahren (z. B. Heliumeinleitung, Ultraschallbehandlung, Vakuum- oder In-line-Entgasung) zu entgasen.

Anmerkung: Um die Lebensdauer der Säule zu verlängern, muss sichergestellt werden, dass der Kohlendioxidanteil des Elutionsmittels möglichst gering ist und dass eine erneute Aufnahme ausgeschlossen werden kann.

6.

APPARATUR

Normale Laborausstattung und insbesondere:

6.1.

HPLC-Ionenaustauscher-Harzsäule

Säulenpackung: 8 % quervernetztes Polystyrol-divinylbenzol-Copolymer funktionalisiert mit Kationenaustauschergruppen in der Bleiform; Säulenabmessungen: Länge 300 mm, Innendurchmesser ca. 8 mm. Andere Durchmesser können verwendet werden, wenn der Durchfluss entsprechend angepasst wird.

6.2.

Vorsäule

Die Vorsäule besteht aus einem getrennten Kationenaustauscher (H⁺) kombiniert mit einem Anionen-Austauscher (CO₃-), jeweils in Säulen von ca. 30 mm × 4,6 mm (H × ID) gepackt (z. B. Mikrovorsäulen in einem Mikrovorsäulenhalter); die Säulen sind in Reihen hintereinander oder in Form eines gemischten Betts mit AG 50W-X4, -400 mesh (H⁺) und AG3-X4A, 200-400 mesh (OH-) im Verhältnis 35:65 (m/m) angeordnet und werden von Hand in eine ca. 20 × 9 mm (L × ID) große Säule gepackt.

6.3.

Säulenofen

Mit dem Ofen muss eine gleich bleibende Temperatur von 85 °C ±1 °C hergestellt werden können.

6.4.

HPLC-Pumpe

Die Pumpe muss einen gleich bleibenden Durchfluss von 0,2-1,0 m/min (bei Schwankungen < 0,5 %) erzielen können.

6.5.

HPLC-Injektionssystem

Der Autosampler muss ein Volumen von 25 μl injizieren können; die Wiederholbarkeit muss < 0,5 % sein. Alternativ kann ein manuelles System eingesetzt werden, das die auch an den Autosampler gestellten Anforderungen erfüllt.

6.6.

HPLC-Detektor

Benötigt wird ein hoch empfindlicher Refraktionsindex-Detektor mit einem Rauschpegel von < 5,10^-9 RI.

6.7.

Integrator

Für die Datenerfassung sowie zum Erzeugen von Peak-Flächen und Peak-Höhen, die in Laktose-Konzentrationen umgerechnet werden können, wird eine Software oder ein eigener Integrator verwendet.

6.8.

Wasserreinigungssystem

Das System muss ultrareines Wasser (Typ 1) mit einem spezifischen Widerstand > 14 MΩ.cm herstellen können.

6.9.

Lösungsmittelfiltersystem

Das System muss das Wasser über einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtern können.

Anmerkung: Viele Wasserreinigungssysteme (6.8) besitzen einen integrierten 0,45- oder 0,2-μm-Filter. Eine weitere Filtration kann unterbleiben, wenn das Wasser sofort verwendet wird.

6.10.

Analysewaage

Waage mit einer Empfindlichkeit von 0,1 mg

6.11.

Wasserbad

Im Wasserbad muss eine Temperatur von 40 °C (±0,5 °C) aufrechterhalten werden können.

6.12.

Zentrifuge

Die Zentrifuge muss Eppendorf-Röhrchen oder gleichwertige bzw. größere Röhrchentypen mit mindestens 3000 g beschleunigen können.

6.13.

Messkolben 50 ml

Füllmenge 50 ml, Klasse A

Anmerkung: Bei Berücksichtigung des jeweiligen Volumenfaktors können Kolben mit sonstigen Füllmengen verwendet werden.

6.14.

Messkolben 100 ml

Fassungsvermögen 100 ml, Klasse A

6.15.

Messpipette

Messpipette, 10 ml

Anmerkung: Alternativ kann eine manuelle Pipettierhilfe mit einem Fassungsvermögen von 5 ml verwendet werden; in diesem Fall müssen zweimal 5 ml des Reagens verwendet werden (5.3).

7.

PROBENAHME

Wichtig ist, dass das Labor eine Probe erhält, die gemäß ISO 707IDF 50^(***) entnommen wurde, die tatsächlich repräsentativ ist und die bei Transport oder Lagerung nicht beschädigt wurde.

8.

VORBEREITUNG DER LAKTOSE-STANDARDLÖSUNG

8.1.

Standardprobe 1

Eine auf 0,1 mg genau abgewogene Menge von ca. 50 mg Laktose-Monohydrat (5.2) wird in einem 100-ml-Messkolben (6.14) aufgelöst; anschließend wird bis zur Füllmarke mit Wasser aufgefüllt.

8.2.

Standardprobe 2

Eine auf 0,1 mg genau abgewogene Menge von ca. 100 mg Laktose-Monohydrat (5.2) wird in einem 100-ml-Messkolben (6.14) aufgelöst; anschließend wird mit Wasser aufgefüllt.

Anmerkung: Die Standardlösungen können bei einer Temperatur von ca. 5 °C höchstens 1 Woche gelagert werden.

9.

VORBEREITUNG DER PROBE

9.1.

Rekonstituierung der Probe

Ca. 5 g des Pulvers werden in einen 50-ml-Kolben (6.13) eingewogen; das Gewicht wird auf 1 mg genau bestimmt (W₁ (11)). Nach Zugabe von 50 ml Wasser wird die Zunahme des Gewichts (W₂ (11)) auf 0,01 g genau ermittelt. Der verschlossene Kolben wird für 30 Minuten in das Wasserbad (6.11) gebracht und während dieser Zeit einige Male gestürzt. Anschließend muss der Kolben auf Raumtemperatur abkühlen.

9.2.

Probenbehandlung

Ca. 1 g dieser Lösung wird entnommen und in einen 50-ml-Messkolben (6.13) gegeben; anschließend wird das Gewicht (W₃ (11)) auf 1 mg genau bestimmt; danach werden zunächst 20 ml Wasser und dann 10 ml verdünnte Biggs/Szijarto-Lösung (5.4) hinzugefügt. Die Lösung wird mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Der Kolben wird in den ersten 30 Minuten fünfmal vorsichtig gestürzt. Nach 1 Stunde wird eine Aliquote entnommen und 10 Minuten mit 3000 g zentrifugiert (6.12). (Bei entsprechend kürzerer Zeit sind auch höhere Beschleunigungen möglich.) Eine Aliquote des Überstands wird für die HPLC-Analyse verwendet.

10.

HPLC-ANALYSE

10.1.

Vorläufige Vorbereitung für die HPLC

10.1.1.

Aufbau der Hauptsäule und der Vorsäule

Die Vorsäule (6.2) wird außerhalb des Säulenofens (6.3) angeordnet und die Hauptsäule (6.1) in den Ofen gebracht.

Anmerkung: Wenn der Ofen nicht mit Röhren zur Vorheizung des Elutionsmittels ausgestattet ist, muss das Elutionsmittel durch ein etwa 15 cm langes Edelstahlrohr in den Ofen geleitet werden, bevor es in die Säule gelangt. (Das Elutionsmittel muss vor dem Eintritt in die Säule erwärmt worden sein; ansonsten werden die Peaks unangemessen breit.)

10.1.2.

Detektor und Ausgangsdurchfluss

Um eine stabile Basislinie zu erhalten, wird der Detektor (6.6) mindestens 24 Stunden vor Beginn der Analyse eingeschaltet. Die Innentemperatur des Detektors wird auf 35 °C geregelt. Mindestens 20 Minuten wird ein Durchfluss von 0,2 ml/min (6.4) eingestellt; dabei wird der Säulenofen (6.3) auf Raumtemperatur geregelt.

10.1.3.

Säulenofen und endgültiger Durchfluss

Der Säulenofen (6.3) wird auf 85 °C eingestellt. Wenn diese Temperatur erreicht ist, wird nach 30 Minuten allmählich der Durchfluss von 0,2 ml/min auf 0,6 ml/min erhöht (6.4). Es wird gewartet, bis das Gerät sich bei diesem Durchfluss und bei einer Temperatur von 85 °C äquilibriert hat (2 Stunden bzw. bis zum Erreichen einer stabilen Basislinie).

10.1.4.

Integration

Die Parameter für Erfassung und Integration der Daten (6.7) (z. B. Datenrate, Empfindlichkeit, Zeitkonstante, Peak-Breite und Schwellenwert) sind sorgfältig auszuwählen. Die Retentionszeit beträgt bei Laktose etwa 11 Minuten.

Anmerkung: Viele Software-Programme zur Datenerfassung (6.7) ermöglichen die bequeme Messung der theoretischen Plattenzahl. Die theoretische Plattenzahl von Standardlösung 1 (8.1) ist regelmäßig zu messen; wenn die Plattenzahl den Ausgangswert einer neuen Säule um mindestens 25 % unterschreitet, ist die Säule (6.1) zu ersetzen.

10.1.5.

Vorsäulentest

Regelmäßig (d. h. in jeder Analysereihe mindestens einmal) muss geprüft werden, ob die Vorsäule (6.2) Salze aus der Probe abtrennen kann; dazu werden 25 μl einer 0,05 %igen Natriumchloridlösung injiziert. Wenn Peaks auftreten, sollte die Vorsäule ersetzt werden.

10.2.

Messen der Standardproben

Jeweils zu Beginn einer Analysereihe werden 25 μl (6.5) von Standardprobe 1 (8.1) und anschließend von Standardprobe 2 (8.2) injiziert. Diese Injektionen werden jeweils nach 10 bis 20 Proben sowie am Ende einer Analysereihe wiederholt.

10.3.

Messen der Proben

25 μl des Überstands (9.2) der Probe werden injiziert.

11.

BERECHNUNG UND DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

11.1.

Kalibrierung

Normalerweise werden die Ergebnisse aufgrund von Peak-Höhen berechnet; bei zu starkem Rauschpegel können auch die Peak-Flächen verwendet werden. (Bei der quantitativen Bestimmung anhand der Peak-Höhe bestehen geringere Beeinträchtigungen durch Peaks von in niedriger Konzentration vorliegenden Bestandteilen, die nur teilweise und nicht hinreichend von Laktose-Peak abgegrenzt werden können.) Die Software (6.7) muss eine lineare Kalibrierkurve berechnen, die durch das Ausgangsniveau führt. Die Kurve ist auf eine mögliche Linearitätsabweichung zu prüfen; (scheinbare Linearitätsabweichungen sind meist auf einen Fehler bei der Vorbereitung der Standardprobe 1 (8.1) oder 2 (8.2), auf eine schlechte Integration oder — seltener — auf einen defekten Injektor zurückzuführen.) Als Ausgangsdaten werden die berechneten Laktosekonzentrationen in mg/ml der Standardprobe 1 (8.1) und 2 (8.2) als wasserfreie Laktose angenommen. Die Steigung (RF) der Kalibrierungslinie hängt vom Verhältnis zwischen der Fläche und der Konzentration in mg/ml ab.

11.2.

Proben

Das Analyseergebnis wird in g/100 g ausgedrückt und mit der Software (6.7) bzw. mit der folgenden Formel berechnet: Dabei bedeuten:

C:

Laktosekonzentration in g/100 g Pulver

H:

Höhe der Laktose-Peaks der Proben

RF:

Kalibrierfaktor (oder Steigung) der Kalibrierkurve in mV/mg/ml

W₁:

Gewicht der Pulverprobe in g (9.1)

W₂:

Gewicht des zur Pulverprobe hinzugefügten Wassers in g (9.1)

W₃:

Gewicht der rekonstituierten Lösung des Probenpulvers in g (9.2)

50:

Volumen des verwendeten Messkolbens (9.2)

0,1:

Umrechnung des Ergebnisses in g/100 g

12.

PRÄZISION

Die in diesem Leistungstest ermittelten Werte sind möglicherweise nur auf die hier genannten Konzentrationsbereiche und Matrizen anwendbar. Die Werte für die Wiederholbarkeit und die Vergleichbarkeit stützen sich auf die Ergebnisse eines gemäß ISO 5725^(****) durchgeführten Leistungstests.

12.1.

Wiederholbarkeit

Der absolute Unterschied zwischen zwei einzelnen Testergebnissen, die nach derselben Methode bei identischem Testmaterial in verschiedenen Laboratorien von verschiedenen Analytikern und mit unterschiedlicher Ausrüstung ermittelt wurden, liegt in höchstens 5 % aller Fälle über xxx (durch gemeinsame Versuche zu überprüfen)^(*****).

12.2.

Vergleichbarkeit

Der absolute Unterschied zwischen zwei einzelnen Testergebnissen, die nach derselben Methode bei identischem Testmaterial in verschiedenen Laboratorien von verschiedenen Analytikern und mit unterschiedlicher Ausrüstung ermittelt wurden, liegt in höchstens 5 % aller Fälle über 0,5 g/100 g (durch gemeinsame Versuche zu überprüfen).

13.

LITERATUR