BESTIMMUNG VON LABMOLKE IN MAGERMILCHPULVER ZUR ÖFFENTLICHEN LAGERHALTUNG UNTER NACHWEIS VON KASEINMAKROPEPTIDEN DURCH HOCHLEISTUNGS-FLÜSSIGKEITSCHROMATOGRAFIE (HPLC)

1.

GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH

Durch die Bestimmung der Kaseinmakropeptide ermöglicht diese Methode den Nachweis von Labmolke in zur öffentlichen Lagerung bestimmtem Magermilchpulver.

2.

LITERATUR

Internationale Norm ISO 707 — Milch und Milcherzeugnisse — Probenahmetechniken, gemäß den Angaben in Anhang I Ziffer 2 Buchstabe c letzter Unterabsatz.

3.

BEGRIFFSBESTIMMUNG

Unter dem Gehalt an Labmolkepulver wird der unter Nachweis von Kaseinmakropeptiden nach diesem Verfahren bestimmte Massenanteil in Prozent verstanden.

4.

KURZBESCHREIBUNG

—

Rekonstitution des Magermilchpulvers in warmem Wasser, Entfernen des Fettanteils und der Proteine mit Trichloressigsäure und anschließende Zentrifugierung oder Filtrierung.

—

Bestimmung der im Überstand vorhandenen Kaseinmakropeptidmenge (CMP) durch Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC).

—

Beurteilung des Ergebnisses durch den Vergleich mit Standardproben aus Magermilchpulver, ohne oder mit Zusatz eines bekannten Anteils an Labmolkepulver.

5.

REAGENZIEN

Alle Reagenzien müssen analysenrein sein. Das verwendete Wasser muss destilliert sein oder einen mindestens gleichwertigen Reinheitsgrad aufweisen.

5.1.

Trichloressigsäure

240 g Trichloressigsäure (CCl₃COOH) werden in Wasser aufgelöst; anschließend wird die Lösung auf 1000 ml aufgefüllt. Die Lösung sollte klar und farblos sein.

5.2.

Elutionsmittel, pH 6,0

1,74 g Di-Kaliumphosphat (K₂HPO₄), 12,37 g Mono-Kaliumphosphat (KH₂PO₄) und 21,41 g Natriumsulfat (Na₂SO₄) werden in etwa 700 ml Wasser gelöst. Wenn erforderlich, ist der pH-Wert mit Phosphorsäure- oder Kaliumhydroxidlösung auf 6,0 zu korrigieren. Die Lösung wird mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt und gut durchmischt.

Anmerkung: Die Zusammensetzung des Elutionsmittels kann so geändert werden, dass die im Zertifikat der Standardlösungen vorgegebenen Anforderungen oder die Herstelleranweisungen bzw. die Anforderungen an das Packmaterial der Säule erfüllt werden.

Vor der Verwendung wird die Elutionslösung durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert.

5.3.

Waschlösung

Ein Teil Acetonitril (CH₃CN) wird mit 9 Teilen Wasser gemischt, und die Lösung vor Gebrauch durch einen Membranfilter mit 0,45 μm Porengröße filtriert.

Anmerkung: Es kann auch eine beliebige sonstige Waschlösung mit bakterizider Wirkung verwendet werden, die die Trennleistung der Säulen nicht beeinträchtigt.

5.4.

Standardproben

5.4.1. Magermilchpulver gemäß den Anforderungen dieser Verordnung d. h. [0].

5.4.2. Das gleiche Magermilchpulver, verfälscht durch Zugabe von 5 % (m/m) Labmolkepulver von durchschnittlicher Zusammensetzung, d. h. [5].

6.

APPARATUR

6.1. Analysewaage

6.2. (Fakultativ:) Zentrifuge, mit der eine Zentrifugalkraft von 2200 g erreicht werden kann, ausgerüstet mit Zentrifugenröhrchen mit Verschlussstopfen oder -kappe und einem Fassungsvermögen von 50 ml

6.3. Mechanische Schüttelvorrichtung

6.4. Magnetrührer

6.5. Glastrichter, ca. 7 cm Durchmesser

6.6. Filterpapier, mittlere Filtriergeschwindigkeit, ca. 12,5 cm Durchmesser

6.7. Filtriervorrichtung aus Glas mit Membranfilter, 0,45 μm Porendurchmesser

6.8. Messpipetten, Nennvolumen 10 ml (ISO 648, Klasse A oder ISO/R 835), bzw. ein Pipettiersystem, mit dem in 2 Minuten ein Volumen von 10,0 ml übertragen werden kann

6.9. Aufgabesystem zur Abgabe von 20,0 ml Wasser mit einer Temperatur von ca. 50 °C

6.10. Thermostatisierbares Wasserbad, eingestellt auf 25 ±0,5 °C

6.11. HPLC-Ausrüstung, bestehend aus:

6.11.1. einer Pumpe;

6.11.2. einem manuellem Injektor oder einem Autosampler mit 15 bis 30 μl Fassungsvermögen;

6.11.3. 2 TSK 2000-SW-Säulen in Reihe (Länge 30 cm, Innendurchmesser 0,75 cm) oder gleichwertige Säulen (z. B. einmal TSK 2000-SWXL, einmal Agilent Technologies Zorbax GF 250) und einer Vorsäule (3 cm × 0,3 cm) gepackt mit I 125 oder Material mit gleichwertiger Effizienz;

6.11.4. einem thermostatisierbarem Säulenofen, einstellbar auf 35 ±1 °C;

6.11.5. einem UV-Detektor mit variabler Wellenlänge für Messungen bei 205 nm mit einer Empfindlichkeit von 0,008 A und

6.11.6. einem Integrator zur Messung der Peak-Höhe.

Anmerkung: Die Säulen können auch bei Raumtemperatur eingesetzt werden. Allerdings ist die Trennleistung dann etwas geringer. In diesem Fall müssen die Temperaturschwankungen während einer Analysenreihe unter ±5 °C betragen.

7.

PROBENAHME

7.1. Die Probenahme erfolgt nach dem von der internationalen Norm ISO 707 vorgesehenen Verfahren. Die Mitgliedstaaten können jedoch ein anderes Probenahmeverfahren anwenden, wenn dieses die Anforderungen der genannten Norm erfüllt.

7.2. Die Probe ist so aufzubewahren, dass sie unversehrt bleibt und ihre Zusammensetzung sich nicht ändert.

8.

VERFAHREN

8.1.

Vorbereitung der Probe

Das Milchpulver wird in einen ungefähr das doppelte Volumen fassenden Behälter mit luftdichtem Verschluss gegeben und der Behälter sofort verschlossen. Das Milchpulver wird durch mehrmaliges Stürzen des Behälters vollständig durchmischt.

8.2.

Probeneinwaage

2,000 g ±0,001 g der Probe werden in ein Zentrifugenröhrchen (6.2) oder ein geeignetes verschließbares Gefäß (50 ml) eingewogen.

8.3.

Abtrennen von Fett und Eiweiß

8.3.1. Die Probeneinwaage wird mit 20,0 ml warmem Wasser (50 °C) versetzt. Das Pulver wird durch fünfminutiges Bewegen auf dem Schüttelgerät (6.3) rekonstituiert. Das Röhrchen wird in ein Wasserbad (6.10) gegeben und bei 25 °C stehen gelassen.

8.3.2. Innerhalb von 2 Minuten werden 10 ml Trichloressigsäure (5.1) unter ständigem Rühren mit dem Magnetrührer (6.4) hinzugegeben. Das Röhrchen wird in ein Wasserbad (6.10) gestellt und 60 Minuten stehen gelassen.

8.3.3. Danach wird die Probe bei 2200 g 10 Minuten zentrifugiert (6.2) oder durch Filterpapier (6.6) gefiltert. Die ersten 5 ml des Filtrats sind zu verwerfen.

8.4.

Chromatografische Bestimmung

8.4.1. Ein genau abgemessenes Volumen zwischen 15 und 30 μl vom Überstand oder Filtrat (8.3.3) wird in das HPLC-Gerät (6.10) injiziert; währenddessen wird das Elutionsmittel (5.2) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml pro Minute zugeführt.

Anmerkung 1: Abhängig vom Innendurchmesser der verwendeten Säulen bzw. den Anweisungen des Säulenherstellers kommen möglicherweise auch sonstige Durchflussgeschwindigkeiten in Betracht.

Anmerkung 2: Das Elutionsmittel (5.2) sollte während der gesamten chromatografischen Analyse eine Temperatur von 85 °C haben, um das Elutionsmittel gasfrei zu halten und unerwünschtes Bakterienwachstum zu verhindern. Ergänzend können auch sonstige Maßnahmen mit vergleichbarer Wirkung durchgeführt werden.

Anmerkung 3: Bei jeder Unterbrechung sind die Säulen mit Wasser zu spülen. Das Elutionsmittel darf niemals in den Säulen bleiben (5.2).

Vor jeder Unterbrechung von mehr als 24 Stunden sind die Säulen mit Wasser zu spülen und mindestens 3 Stunden lang bei einem Durchfluss von 0,2 ml pro Minute mit der in Ziffer 5.3 genannten Lösung zu waschen.

8.4.2. Die Ergebnisse der chromatogaphischen Analyse der Proben [E] werden in Form eines Chromatogramms gewonnen, in dem jeder Peak durch seine Retentionszeit RT identifiziert wird, d. h.:

Peak II:	Zweiter Peak des Chromatogramms mit RT etwa 12,5 Minuten.
Peak III:	Dritter Peak des Chromatogramms (entsprechend CMP) mit RT 15,5 Minuten.

Die Qualität der Säulen kann die Retentionszeit der verschiedenen Peaks beeinflussen. Der Integrator (6.11.6) berechnet automatisch die Fläche A der einzelnen Peaks, d. h.:

AII:	Fläche von Peak II
AIII:	Fläche von Peak III

Vor der quantitativen Interpretation muss das Aussehen des Chromatogramms untersucht werden, um gegebenenfalls Anomalien infolge einer Störung des Gerätes oder der Säulen oder infolge der Art und Herkunft der analysierten Probe feststellen zu können. Im Zweifelsfall ist die Analyse zu wiederholen.

8.5.

Kalibrierung

8.5.1. Für die Standardproben (5.4) ist das unter den Punkten 8.2 bis 8.4.2 beschriebene Verfahren genau einzuhalten. Es sind frisch zubereitete Lösungen zu verwenden, da die CMP im 8 %igen Trichloressigsäure-Milieu abgebaut werden. Der Verlust wird bei 30 °C auf 0,2 % pro Stunde geschätzt.

8.5.2. Vor jeder chromatografischen Bestimmung der Proben sind die Säulen durch wiederholte Injektionen der Lösung (8.5.1) der Standardproben (5.4.1) vorzubehandeln, bis die Fläche und die Retentionszeit des dem CMP entsprechenden Peaks konstant bleiben.

8.5.3. Die Kalibrierfaktoren R werden durch Injektion des auch bei den Proben verwendeten Filtratvolumens (8.5.1) bestimmt.

9.

DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

9.1.

Berechnungsformel

9.1.1.

Berechnung der Kalibrierfaktoren R:

Peak II:

RII = 100/(AII[0])

Dabei sind:

R_II=

Kalibrierfaktoren der Peaks II

A_II [0]=

Flächen der Peaks II der gemäß Absatz 8.5.3 hergestellten Standardprobe [0]

Peak III:

RIII = W/(AIII[5] – AIII[0])

Dabei sind:

R_III=

Kalibrierfaktor für Peak III

A_III [0] und A_III [5]=

Flächen von Peak III in den gemäß Absatz 8.5.3 hergestellten Standardproben [0] und [5]

W=

Menge der Labmolke in der Standardprobe [5], d. h. 5

9.1.2.

Berechnung der relativen Flächen der Peaks der Probe [E]:

S_II[E] = R_II × A_II[E] S_III[E] = R_III × A_III[E] S_IV[E] = R_IV × A_IV[E] Dabei sind:

S_II [E], S_III [E], S_IV [E]=

relative Flächen der Peaks II, III und IV der Probe [E]

A_II [E], A_III [E]=

Flächen der Peaks II und III der gemäß Absatz 8.4.2 hergestellten Probe [E]

R_II, R_III=

gemäß Absatz 9.1.1 berechnete Kalibrierfaktoren

9.1.3.

Berechnung der relativen Retentionszeit für Peak_III der Probe [E] RRT_III[E] = (RT_III[E])/(RT_III[5])

Dabei sind:

RRT_III [E]=

relative Retentionszeit von Peak III in Probe [E]

RT_III [E]=

Retentionszeit von Peak III in der gemäß Absatz 8.4.2 hergestellten Probe [E]

RT_III [5]=

Retentionszeit von Peak III der gemäß Absatz 8.5.3 hergestellten Kontrollprobe [5]

9.1.4.

In Versuchen ist nachgewiesen worden, dass zwischen der relativen Retentionszeit von Peak III, d. h. RRTIII [E], und der zugesetzten Menge an Labmolkepulver bis zu einer Konzentration von 10 % eine lineare Abhängigkeit besteht:

—

Die RRT_III [E] ist < 1,000, wenn der Gehalt an Labmolke > 5 % ist;

—

die RRT_III [E] ist ≥ 1,000, wenn der Gehalt an Labmolke ≤ 5 % ist.

Die zulässige Toleranz für die Werte von RRT_III liegt bei ± 0,002. In der Regel weicht der Wert für RRT_III [0] kaum von 1,034 ab. Je nach dem Zustand der Säulen kann sich dieser Wert 1,000 annähern, muss jedoch immer größer sein.

9.2.

Berechnung des Gehalts an Labmolkepulver in der Probe

W = S_III[E] – [1, 3 + (S_III[0] – 0, 9)] Dabei sind:

W=

Prozentanteil m/m der Labmolke in der Probe [E]

S_III [E]=

relative Fläche von Peak III der gemäß Absatz 9.1.2 hergestellten Testprobe

1,3=

relative durchschnittliche Fläche von Peak III in Gramm Labmolke pro 100 g ermittelt in unverfälschtem Magermilchpulver unterschiedlicher Herkunft. Der Wert wurde experimentell bestimmt

S_III [0]=

relative Fläche von Peak III; diese ist gleich R_III × A_III [0]; diese Werte wurden mit den in den Absätzen 9.1.1 und 8.5.3 beschriebenen Verfahren bestimmt

(S_III [0] – 0,9)=

an der relativen durchschnittlichen Fläche vorzunehmende Korrektur (1,3), wenn S_III [0] nicht gleich 0,9 ist; im Versuch wurde für die relative durchschnittliche Fläche von Peak III der Kontrollprobe [0] der Wert 0,9 ermittelt

9.3.

Genauigkeit des Verfahrens

9.3.1.

Wiederholbarkeit

Die Differenz der Ergebnisse zweier Untersuchungen, die mit identischem Untersuchungsmaterial unter denselben Versuchsbedingungen von demselben Untersucher gleichzeitig oder unmittelbar nacheinander durchgeführt werden, darf Massenanteil von 0,2 % nicht überschreiten.

9.3.2.

Vergleichbarkeit

Die Differenz zwischen zwei einzelnen unabhängigen Ergebnissen, die zwei Bearbeiter, welche in verschiedenen Labors arbeiten, an identischem Probenmaterial erhalten, darf 0,4 % (m/m) nicht überschreiten.

9.4.

Interpretation

9.4.1. Es muss darauf geschlossen werden, dass keine Labmolke enthalten ist, wenn die relative Fläche von Peak III, S_III [E], ausgedrückt in Gramm Labmolke pro 100 g des Erzeugnisses, ≤ 2,0 + (S_III[0] – 0,9) ist.

2,0=

in Anbetracht der relativen Fläche von Peak III (d. h. 1,3), der durch Schwankungen in der Zusammensetzung des Magermilchpulvers bedingten Unsicherheit und der Vergleichbarkeit der Methode (9.3.2) der höchstens zulässige Wert für die relative Fläche von Peak III

(S_III [0] – 0,9)=

vorzunehmende Korrektur, wenn die Fläche S_III [0] nicht gleich 0,9 ist (siehe Absatz 9.2)

9.4.2. Wenn die relative Fläche von Peak III S_III [E] > 2,0 + (S_III[0] – 0,9) und die relative Fläche von Peak II S_II [E] ≤ 160 ist, muss der Labmolkeanteil wie in Absatz 9.2 beschrieben bestimmt werden.

9.4.3. Ist die relative Fläche von Peak III S_III [E] > 2,0 + (S_III[0] – 0,9) und die relative Fläche von Peak II S_II [E] ≤ 160, wird der Gesamteiweißgehalt (P %) bestimmt; anschließend ist eine Bewertung aufgrund der Abbildungen 1 und 2 vorzunehmen.

9.4.3.1. Die nach Analyse von Proben von unverfälschtem Magermilchpulver gewonnenen Daten mit hohem Gesamteiweißgehalt sind in den Abbildungen 1 und 2 zusammengefasst. Die durchgezogene Gerade ist die Gerade der linearen Regression, deren Koeffizienten nach dem Verfahren der kleinsten Quadrate errechnet wurden. Die gestrichelte Gerade gibt die Obergrenze der relativen Oberfläche von Peak III mit einer Wahrscheinlichkeit an, die in 90 % der Fälle nicht überschritten wird. Die Formeln der gestrichelten Geraden der Abbildungen 1 und 2 lauten jeweils:

SIII = 0,376 P % – 10,7	(Abbildung 1)
SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93	(Abbildung 2)

dabei ist jeweils

S_III=

die relative Fläche von Peak III berechnet entweder aufgrund des Gesamteiweißgehalts oder aufgrund der relativen Fläche von Peak S_II [E]

P %=

der Gesamteiweißgehalt in Gewichtsprozent

S_II [E]=

die relative Fläche der gemäß Absatz 9.1.2 berechneten Probe

Die Gleichungen stimmen bei dem Wert 1,3 gemäß Punkt 9.2 überein. Der Abstand (T₁ und T₂) zwischen der gefundenen relativen Fläche S_III [E] und der relativen Oberfläche S_III ergibt sich aus folgenden Formeln: T₁ = S_III [E] – [(0,376 P% –10,7) + (S_III [0] – 0,9)]T₂ = S_III [E] – [(0,0123 S_II [E] + 0,93) + (S_III [0] – 0,9)]

9.4.3.2.

Wenn T₁ und/oder T₂

Null oder kleiner sind, kann ein Labmolke-Nachweis nicht geführt werden.

Sind T₁ und T₂

größer als Null, enthält die Probe Labmolke.

Der Gehalt an Labmolke wird mit der Formel W = T₂ + 0,91 berechnet. Dabei ist: 0,91 der Abstand zwischen der durchgezogenen Geraden und der gestrichelten Geraden auf der vertikalen Achse.

Magermilchpulver

Magermilchpulver