BESTIMMUNG VON LABMOLKEPULVER IN MAGERMILCHPULVER UND IN DEN IN DER VERORDNUNG (EG) NR. 2799/1999 GENANNTEN GEMISCHEN

1.

GEGENSTAND: NACHWEIS DES ZUSATZES VON LABMOLKEPULVER ZU:

a)

Magermilchpulver im Sinne von Artikel 2 der Verordnung (EG) Nr. 2799/1999 und

b)

Mischungen im Sinne von Artikel 4 der Verordnung (EG) Nr. 2799/1999.

2.

LITERATUR: INTERNATIONALE NORM ISO 707

3.

BEGRIFFSBESTIMMUNG

Unter dem Gehalt an Labmolkepulver wird der nach diesem Verfahren bestimmte Massenanteil an Kaseinmakropeptiden in Prozent verstanden.

4.

KURZBESCHREIBUNG

Der Gehalt an Kaseinmakropeptid wird gemäß Anhang XII bestimmt. Proben mit positivem Ergebnis werden mit dem HPLC-Verfahren (Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatografie) auf Kaseinmakropeptid A (CKP_A) untersucht. Alternativ können die Proben auch sofort durch Umkehrphasen-HPLC analysiert werden. Das Ergebnis wird im Vergleich zu Standardproben aus molkefreiem und molkehaltigem Magermilchpulver mit bekanntem Gehalt ausgewertet. Labmolkepulver gilt als nachgewiesen, wenn der Massenanteil größer als 1 % ist.

5.

REAGENZIEN

Alle Reagenzien müssen analysenrein sein. Das verwendete Wasser muss destilliert sein oder einen mindestens gleichwertigen Reinheitsgrad aufweisen. Die Reinheit von Acetonitril muss den Anforderungen der Spektroskopie bzw. der HPLC genügen. Die für das Verfahren erforderlichen Reagenzien sind in Anhang XII dieser Verordnung genannt. Reagenzien für die Umkehrphasen-HPLC:

5.1.

Trichloressigsäure-Lösung

240 g Trichloressigsäure (CCl₃COOH) werden in Wasser aufgelöst; anschließend wird die Lösung auf 1000 ml aufgefüllt. Die Lösung muss klar und farblos sein.

5.2.

Elutionsmittel A und B

Elutionsmittel A: 150 ml Acetonitril (CH₃CN), 20 ml Isopropanol (CH₃CHOHCH₃) und 1,00 ml Trifluoressigsäure (TFA, CF₃COOH) werden in einen 1000-ml-Messkolben gegeben und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Elutionsmittel B: 550 ml Acetonitril, 20 ml Isopropanol und 1,00 ml TFA werden in einen 1000-ml-Messkolben gegeben und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Vor der Verwendung wird die Elutionslösung durch einen Membranfilter mit 0,45 μm Porendurchmesser filtriert.

5.3.

Aufbewahrung der Säule

Nach den Analysen wird die Säule mit Elutionsmittel B (über einen Gradienten) und danach mit Acetonitril (30 Minuten, ebenfalls über einen Gradienten) gespült. Die Säule wird in Acetonitril aufbewahrt.

5.4.

Standardproben

5.4.1. Magermilchpulver entsprechend den Anforderungen für die öffentliche Lagerhaltung (d. h. [0]).

5.4.2. Das gleiche Magermilchpulver, verfälscht durch Zusatz von 5 % (m/m) Labmolkepulver von durchschnittlicher Zusammensetzung (d. h. [5]).

5.4.3. Das gleiche Magermilchpulver, verfälscht durch Zusatz von 50 % (m/m) Labmolkepulver von durchschnittlicher Zusammensetzung (d. h [50].)⁽¹⁾.

6.

APPARATUR

Die für das beschriebene Verfahren erforderliche Apparatur wird in Anhang XII dieser Verordnung spezifiziert.

6.1. Analysewaage

6.2. (Fakultativ:) Zentrifuge zur Herstellung einer Zentrifugalkraft von 2200 g, Zentrifugenröhrchen mit Stopfen oder Kappe und einem Fassungsvermögen von etwa 50 ml

6.3. Mechanische Schüttelvorrichtung

6.4. Magnetrührer

6.5. Glastrichter, ca. 7 cm Durchmesser

6.6. Filterpapier, mittlere Filtriergeschwindigkeit, ca. 12,5 cm Durchmesser

6.7. Filtriervorrichtung aus Glas mit Membranfilter, 0,45 μm Porendurchmesser

6.8. Messpipetten, Nennvolumen 10 ml (ISO 648, Klasse A oder ISO/R 835) bzw. ein Pipettiersystem zur Aufgabe von 10,0 ml in 2 Minuten

6.9. Aufgabesystem zur Übertragung von 20,0 ml Wasser bei einer Temperatur von ca. 50 °C

6.10. Thermostatisierbares Wasserbad, eingestellt auf 25 ± 0,5 °C

6.11. HPLC-Ausrüstung, bestehend aus:

6.11.1. einem Pumpensystem für binäre Gradienten;

6.11.2. einem manuellen Injektor oder einem Autosampler mit einem Nennvolumen 100 μl;

6.11.3. einer Säule (Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3, 25 cm × 0,46 cm (Höhe x Innendurchmesser)) oder einer gleichwertigen großporigen Umkehrphasen-Säule auf Silicagelbasis;

6.11.4. einem thermostatisierbaren Säulenofen, einstellbar auf 35 ± 1 °C;

6.11.5. einem UV-Detektor mit variabler Wellenlängeneinstellung zur Messung bei 210 nm mit einer Empfindlichkeit von 0,02 Å (ggf. auch Wellenlängen bis zu 220 nm) und

6.11.6. einem Integrator, mit dem eine Integration auf die allgemeine Basislinie oder von Tal zu Tal vorgenommen werden kann.

Anmerkung: Die Säule kann auch bei Raumtemperatur betrieben werden, sofern diese um höchstens 1 °C schwankt. (Ansonsten ändert sich die Retentionszeit für CMP_A zu stark.)

7.

PROBENAHME

7.1. Die Probenahme erfolgt nach dem von der internationalen Norm ISO 707 vorgesehenen Verfahren. Die Mitgliedstaaten können jedoch ein anderes Probenahmeverfahren anwenden, sofern es den Prinzipien der genannten Norm entspricht.

7.2. Die Probe ist so aufzubewahren, dass sie unversehrt bleibt und ihre Zusammensetzung sich nicht ändert.

8.

VERFAHREN

8.1.

Vorbereitung der Probe

Das Milchpulver wird in einen ungefähr das doppelte Volumen fassenden Behälter mit luftdichtem Verschluss gegeben und der Behälter sofort verschlossen. Das Milchpulver wird durch mehrmaliges Stürzen des Behälters vollständig durchmischt.

8.2.

Probeneinwaage

2,00 ± 0,001 g der Probe werden in ein Zentrifugenröhrchen (6.2) oder ein geeignetes verschließbares Gefäß (50 ml) eingewogen.

Anmerkung: Bei Gemischen ist die Testprobe in einer Menge einzuwiegen, bei der die entfettete Probeneinwaage einem Gewicht von 2,00 g entspricht.

8.3.

Abtrennen von Fett und Eiweiß

8.3.1. Die Probeneinwaage wird mit 20,0 ml warmem Wasser (50 °C) versetzt. Zum Auflösen wird das Pulver mit Hilfe eines mechanischen Schüttelgerätes (6.3) 5 Minuten bzw. bei saurer Buttermilch 30 Minuten gerüttelt. Das Röhrchen wird in ein Wasserbad (6.10) gegeben und bei 25 °C stehen gelassen.

8.3.2. 10,0 ml Trichloressigsäurelösung mit einer Temperatur von 25 °C (5.1) werden innerhalb von 2 Minuten unter kräftigem Rühren mit Hilfe des Magnetrührers (6.4) gleichmäßig zugesetzt. Das Röhrchen wird in ein Wasserbad (6,10) gestellt und 60 Minuten stehen gelassen.

8.3.3. Bei 2200 g wird 10 Minuten lang zentrifugiert (6.2) oder durch Filterpapier (6.6) filtriert, wobei die ersten 5 ml des Filtrats zu verwerfen sind.

8.4.

Chromatografische Bestimmung

8.4.1. Eine HPLC-Analyse wird gemäß Anhang XII durchgeführt. Bei negativem Befund enthält die analysierte Probe keine nachweisbaren Mengen an Labmolkepulver. Bei positivem Befund ist die im Folgenden beschriebene Umkehrphasen-HPLC durchzuführen. Alternativ kann auch sofort eine Umkehrphasen-HPLC vorgenommen werden. Anteile an saurem Buttermilchpulver können bei Anwendung der in Anhang XII beschriebenen Methode falsch-positive Ergebnisse zur Folge haben. Dies ist bei der Umkehrphasen-HPLC ausgeschlossen.

8.4.2. Bevor die Umkehrphasen-HPLC durchgeführt wird, sind die Gradientenbedingungen zu optimieren. Eine CMP_A-Retentionszeit von 26 Minuten ±2 Minuten ist optimal für Gradientensysteme mit einem Totvolumen von ca. 6 ml (Volumen ab der Stelle, an der die Lösungsmittel zusammentreffen, bis einschließlich Volumen der Probenschleife). Bei Gradientensystemen mit geringerem Totvolumen (z. B. 2 ml) ist eine Retentionszeit von 22 Minuten optimal. Zu analysieren sind Lösungen labmolkefreier Standardproben (5.4) und von Standardproben mit 50 % Labmolkeanteil. 100 μl des Überstandes bzw. des Filtrates (8.3.3) werden in die HPLC-Apparatur injiziert, die unter den in Tabelle 1 genannten Bedingungen (Testgradient) betrieben wird.

Tabelle 1

Testgradientenbedingungen für eine optimale chromatografische Bestimmung

Zeit (min)	Durchfluss (ml/min)	% A	% B	Kurve
Anfänglich	1,0	90	10	*
27	1,0	60	40	linear
32	1,0	10	90	linear
37	1,0	10	90	linear
42	1,0	90	10	linear

Beim Vergleich beider Chromatogramme müsste die Lage des CMP_A-Peaks festzustellen sein. Mit der folgenden Formel kann die anfängliche Zusammensetzung des für den Normalgradienten zu verwendenden Lösungsmittels (siehe Absatz 8.4.3) berechnet werden: % B = 10-2,5 + (13,5 + (RT_cmpA – 26) / 6) × 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RT_cmpA – 26) / 6) × 1,11 Dabei bedeuten:

RT_cmpA:

CMP-Retentionszeit im Testgradienten

10:

Ausgangs-% B des Testgradienten

2,5:

2,5 % B zur halben Laufzeit abzüglich % B beim Start im Normalgradienten

13,5:

halbe Laufzeit des Testgradienten

26:

erforderliche Retentionszeit für CMP_A

6:

Verhältnis der Steigungen von Testgradient und Normalgradient

30:

% B zu Beginn abzüglich % B nach 27 Minuten im Testgradienten

27:

Laufzeit des Testgradienten

8.4.3. Analyse von Lösungen der Testproben Genau 100 μl des Überstandes bzw. Filtrates (8.3.3) werden in die HPLC-Apparatur injiziert, in die das Elutionsmittel (5.2) mit 1,0 ml/Minute geleitet wird. Die Zusammensetzung des Elutionsmittels beim Beginn der Analyse wurde in Absatz 8.4.2 beschrieben. Normalerweise entspricht sie einem Verhältnis von A:B = 76:24 (5.2). Sofort nach der Injektion kommt es zur Ausbildung eines linearen Gradienten, der nach 27 Minuten einen um 5 % höheren prozentualen Anteil von B ergibt. Danach beginnt ein Gradient, bei dem sich die Zusammensetzung des Elutionsmittels in 5 Minuten auf 90 % B einstellt. Diese Zusammensetzung bleibt 5 Minuten konstant, um dann innerhalb von 5 Minuten mit einem linearen Gradienten wieder auf die Zusammensetzung beim Start abzufallen. Je nach Fassungsvermögen des Pumpensystems kann die nächste Injektion 15 Minuten nach Erreichen der Ausgangsbedingungen durchgeführt werden.

Anmerkung 1: Die Retentionszeit des CMP_A muss 26 ± 2 Minuten betragen. Dies kann durch Veränderung der Ausgangs- und Endbedingungen des ersten Gradienten erreicht werden. Die prozentuale Differenz von B am Anfang und Ende des ersten Gradienten muss jedoch in jedem Fall 5 % B betragen.

Anmerkung 2: Die Elutionsmittel müssen ausreichend entgast werden und in diesem Zustand gehalten werden. Dies ist für den einwandfreien Betrieb des Gradientenpumpsystems von wesentlicher Bedeutung. Die Standardabweichung der Retentionszeit für den CMP_A-Peak sollte <0,1 Minute (n = 10) sein.

Anmerkung 3: Bei jeder fünften Probe ist die Standardprobe [5] zu injizieren und erneut der Kalibrierfaktor R (9.1.1) zu bestimmen.

8.4.4. Im Chromatogramm der Testprobe [E] hat der CMP_A-Peak eine Retentionszeit von ca. 26 Minuten. Der Integrator (6.11.6) errechnet automatisch die Höhe H des CMP_A-Peaks. Die Lage der Basislinie ist bei jedem Chromatogramm zu prüfen. Bei unrichtiger Lage der Basislinie ist die Analyse bzw. die Integration erneut durchzuführen.

Anmerkung: Wenn der CMP_A-Peak hinreichend von anderen Peaks abgegrenzt ist, sollte eine Zuordnung gemäß der Basislinie von Tal zu Tal erfolgen; ansonsten sind Senkrechten auf einer gemeinsamen Basislinie einzuzeichnen, die in der Nähe des CMP_A-Peak (und somit nicht bei t = 0 min!) beginnen sollte. Für die Standardlösung und die Probenlösungen ist derselbe Integrationstyp zu verwenden; bei gemeinsamer Basislinie muss die Konsistenz für die einzelnen Proben und für die Standardlösung geprüft werden.

Vor der quantitativen Bestimmung sind die Chromatogramme unbedingt auf Unregelmäßigkeiten zu überprüfen, die sich durch Betriebsstörungen der Apparatur bzw. der Säule oder aufgrund von Herkunft oder Art der analysierten Probe ergeben können. Im Zweifelsfall ist die Analyse zu wiederholen.

8.5.

Kalibrierung

8.5.1. Die Standardproben (5.4.1 und 5.4.2) werden dem in den Absätzen 8.2 bis 8.4.4 beschriebenen Verfahren unterzogen. Dabei sind frisch angesetzte Lösungen zu verwenden, da CMP in 8 %iger Trichloressigsäure bei Raumtemperatur abgebaut wird. Die Lösung ist bei 4 °C 24 Stunden haltbar. Bei langen Versuchsreihen ist die Verwendung einer gekühlten Probenschale im Autosampler zu empfehlen.

Anmerkung: 8.4.2 kann entfallen, sofern der prozentuale Anteil von B beim Beginn der Analyse aus vorangehenden Analysen bekannt ist.

Das Chromatogramm der Referenzprobe [5] sollte wie in Abbildung 1 aussehen. Diese Abbildung zeigt zwei kleine Peaks vor dem CMP_A-Peak. Es ist unbedingt für eine analoge Trennung zu sorgen.

8.5.2. Vor der chromatografischen Bestimmung der Proben sind 100 μl der labmolkefreien Standardprobe [0] (5.4.1) zu injizieren. Das entsprechende Chromatogramm darf bei der Retentionszeit des CMP_A-Peaks keinen Peak aufweisen.

8.5.3. Der Kalibrierfaktor R ist nach Injektion des gleichen Filtratvolumens wie bei den Proben (8.5.1) zu bestimmen.

9.

DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

9.1.

Methode und Berechnungsformel

9.1.1.

Berechnung des Kalibrierfaktors R

CMP_A-Peak: R = W/H Dabei bedeuten:

R=

Kalibrierfaktor des CMP_A-Peaks

H=

Höhe des CMP_A-Peaks

W=

Labmolkegehalt der Standardprobe [5]

9.2.

Berechnung des Labmolkepulvergehalts der Probe in Prozent

W[E] = R × H[E] Dabei bedeuten:

W[E]=

prozentualer Massenanteil an Labmolkepulver in der Probe [E]

R=

Kalibrierfaktor des CMP_A-Peaks (9.1.1)

H[E]=

Höhe des CMP_A-Peaks der Probe (E)

Ist W[E] größer als 1 % und ist die Differenz zwischen der entsprechenden Retentionszeit und der der Standardprobe [5] kleiner als 0,2 Minuten, enthält die Probe Labmolkepulver.

9.3.

Genauigkeit des Verfahrens

9.3.1.

Wiederholbarkeit

Die Differenz der Ergebnisse zweier Untersuchungen, die mit identischem Untersuchungsmaterial unter denselben Versuchsbedingungen von demselben Analytiker gleichzeitig oder unmittelbar nacheinander durchgeführt werden, darf einen Massenanteil von 0,2 % nicht überschreiten.

9.3.2.

Vergleichbarkeit

Nicht bestimmt.

9.3.3.

Linearität

Im Bereich von 0 bis 16 % Labmolkepulveranteil muss Linearität bei einem Korrelationskoeffizienten von > 0,99 gegeben sein.

9.4.

Interpretation

Die 1-%-Grenze wurde gemäß den Vorschriften des Anhangs XIX Absätze 9.2 und 9.4.1 der Verordnung (EG) Nr. 214/2001 festgesetzt und beinhaltet die durch die Vergleichbarkeit bedingte Unsicherheit.

Table 1