GEHALT AN MAGERMILCHPULVER: QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON PHOSPHATIDYLSERIN UND PHOSPHATIDYLETHANOLAMIN

Methode: Umkehrphasen-HPLC

1.

GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH

Diese Methode beschreibt ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) in Magermilchpulver (MMP) und ist auch für den Nachweis von Buttermilch-Feststoffen in Magermilchpulver geeignet.

2.

BEGRIFFSBESTIMMUNG

Gehalt an PS + PE: Massenfraktion der mit dieser Methode festgestellten Substanz; das Ergebnis wird in mg Phosphatidylethanolamin-Dipalmitoyl (PEDP) je 100 g Pulver ausgedrückt.

3.

KURZBESCHREIBUNG

Extraktion von Aminophosholipiden aus dem rekonstituierten Milchpulver mit Hilfe von Methanol; Bestimmung von PS und PE als o-Phthaldialdehyd (OPA)-Derivat durch Umkehrphasen(RP)-HPLC und Fluoreszenzdetektion; Quantifizierung des PS- und PE-Gehalts der Testprobe anhand einer Referenzstandardprobe mit einem bekannten PEDP-Gehalt.

4.

REAGENZIEN

Alle Reagenzien müssen analysenrein sein. Wasser muss destilliert oder von mindestens gleicher Reinheit sein, wenn nicht anderweitig angegeben.

4.1.

Standardmaterial: PEDP, Reinheit mindestens 99 %.

Anmerkung: Das Standardmaterial ist bei –18 °C zu lagern.

4.2.

Reagenzien zur Vorbereitung der Standard- und der Testproben

4.2.1. Methanol in HPLC-Qualität

4.2.2. Chloroform in HPLC-Qualität

4.2.3. Tryptaminmonohydrochlorid

4.3.

Reagenzien für die Derivatisierung des o-Phthaldialdehyds

4.3.1. Natriumhydroxid, 12 M wässrige Lösung

4.3.2. Borsäure, 0,4 M wässrige Lösung, mit Natriumhydroxyd (4.3.1) auf pH 10,0 eingestellt

4.3.3. 2-Mercaptoethanol

4.3.4. o-Phthaldialdehyd (OPA)

4.4.

HPLC-Elutionsmittel

4.4.1. Die Elutionsmittel müssen mit Reagenzien in HPLC-Qualität zubereitet werden.

4.4.2. Wasser in HPLC-Qualität

4.4.3. Methanol für die fluorimetrische Reinheitsmessung

4.4.4. Tetrahydrofuran

4.4.5. Natriumdihydrogenphosphat

4.4.6. Natriumacetat

4.4.7. Essigsäure

5.

APPARATUR

5.1. Analysewaage, Messgenauigkeit 1 mg, Teilung 0,1 mg

5.2. Bechergläser, 25 und 100 ml

5.3. Pipetten, Aufgabemengen 1 und 10 ml

5.4. Magnetrührer

5.5. Messpipetten, Aufgabemengen 0,2, 0,5 und 5 ml

5.6. Messkolben, 10, 50 und 100 ml

5.7. Spritzen, 20 und 100 μl

5.8. Ultraschallbad

5.9. Zentrifuge, Zentrifugalkraft 27000 × g

5.10. Glasfläschchen, etwa 5 ml

5.11. Messzylinder, 25 ml

5.12. pH-Messgerät, Genauigkeit 0,1 pH

5.13. HPLC-Ausrüstung

5.13.1. Gradientenpumpe, Pumpleistung 1,0 ml/min bei 200 bar

5.13.2. Autosampler mit Derivatisierungsfunktion

5.13.3. Säulenheizung zur Regelung einer Säulentemperatur von 30 °C ±1 °C

5.13.4. Fluoreszenz-Messgerät, Messbereich 330 nm, Emissionsbereich 440 nm

5.13.5. Integrator oder Datenverarbeitungs-Software zur Messung von Peak-Flächen

5.13.6. Lichrosphere-100-Säule (250 × 4,6 mm) oder gleichwertige mit Octadecylsilan (C 18) gepackte Säule, Partikelgröße 5 μm

6.

PROBENAHME

Die Probenahme ist nach der ISO-Norm 707 durchzuführen.

7.

VERFAHREN

7.1.

Zubereitung der internen Standardlösung

7.1.1. 30,0 mg (± 0,1 mg) Tryptamin-monohydrochlorid (4.2.3) werden in einen 100-ml-Messkolben (5.6) eingewogen und bis zur Marke mit Methanol (4.2.1) aufgefüllt.

7.1.2. Von dieser Lösung wird 1 ml in einen 10-ml-Messkolben (5.6) einpipettiert (5.3) und bis zur Marke mit Methanol (4.2.1) aufgefüllt, um eine Tryptaminkonzentration von 0,15 mM zu erhalten.

7.2.

Zubereitung der Testprobenlösung

7.2.1. 1,000 ±0,001 g der Magermilchpulver-Probe werden in ein 25-ml-Becherglas (5.2) eingewogen. 10 ml destilliertes Wasser mit einer Temperatur von 40 °C ± 1 °C werden mit einer Pipette (5.3) hinzugegeben und mit einem Magnetrührer (5.4) 30 Minuten gerührt, um ggf. vorhandene Klumpen aufzulösen.

7.2.2. Danach werden 0,2 ml der rekonstituierten Milch (5.5) in einen 10-ml-Messkolben (5.6) einpipettiert und 100 μl der 0,15 mM-Tryptaminlösung (7.1) mit einer Spritze (5.7) zugegeben und mit Methanol (4.2.1) bis zur Marke aufgefüllt. Die Lösung wird durch Stürzen sorgfältig gemischt und 15 Minuten mit Ultraschall (5.8) behandelt.

7.2.3. Danach ist die Lösung 10 Minuten mit einer Zentrifuge (5.9) bei 27000 g zu beschleunigen und der Überstand in einem Glasfläschchen (5.10) aufzunehmen.

Anmerkung: Die Testprobenlösung wird bis zur HPLC-Analyse bei 4 °C aufbewahrt.

7.3.

Zubereitung der externen Standardlösung

7.3.1. 55,4 mg PEDP (4.1) werden in einen 50-ml-Messkolben (5.6) eingewogen und etwa 25 ml Chloroform (4.2.2) mit einem Messzylinder (5.11) zugegeben. Der verschlossene Kolben wird auf 50 °C erhitzt und der Inhalt sorgfältig gemischt, bis sich das PEDP aufgelöst hat. Danach wird der Kolben auf 20 °C gekühlt, mit Methanol (4.2.1) bis zur Marke aufgefüllt und durch Stürzen des Kolbens gemischt.

7.3.2. 1 ml dieser Lösung wird in einen 100-ml-Messkolben (5.6) einpipettiert (5.3) und bis zur Marke mit Methanol (4.2.1) aufgefüllt. Von dieser Lösung wird 1 ml in einen 10-ml-Messkolben (5.6) einpipettiert (5.3), mit 100 μl (5.7) der 0,15 mM Tryptaminlösung (7.1) versetzt und bis zur Marke mit Methanol (4.2.1) aufgefüllt. Die Lösung wird durch Stürzen des Kolbens gemischt.

Anmerkung: Die Standardprobenlösung ist bis zur HPLC-Analyse bei 4 °C aufzubewahren.

7.4.

Vorbereitung des Derivatisierungsreagens

25,0 mg (±0,1 mg) OPA (4.3.4) werden in einen 10-ml-Messkolben (5.6) gegeben, mit 0,5 ml (5.5) Methanol (4.2.1) versetzt und sorgfältig gemischt, bis sich das OPA gelöst hat. Danach wird bis zur Marke mit der Borsäurelösung (4.3.2) aufgefüllt; mit einer Spritze (5.7) werden 20 μl 2-Mercaptoethanol (4.3.3) zugegeben.

Anmerkung: Das Derivatisierungsreagens kann ohne Stabilitätsverlust eine Woche bei 4 °C in einer braunen Glasflasche aufbewahrt werden.

7.5.

Bestimmung durch HPLC

7.5.1.

Elutionslösungen (4.4)

Lösungsmittel A: 0,3 mM Natriumdihydrogenphosphat und 3 mM Natriumacetatlösung (mit Essigsäure auf pH 6,5 ±0,1 eingestellt): Methanol: Tetrahydrofuran = 558:440:2 (v/v/v) Lösungsmittel B: Methanol

7.5.2.

Empfohlener Elutionsgradient:

Zeit (min)	Lösungsmittel A (%)	Lösungsmittel B (%)	Durchfluss (ml/min)
Anfänglich	40	60	0
0,1	40	60	0,1
5,0	40	60	0,1
6,0	40	60	1,0
6,5	40	60	1,0
9,0	36	64	1,0
10,0	20	80	1,0
11,5	16	84	1,0
12,0	16	84	1,0
16,0	10	90	1,0
19,0	0	100	1,0
20,0	0	100	1,0
21,0	40	60	1,0
29,0	40	60	1,0
30,0	40	60	0

Anmerkung: Der Elutionsgradient muss unter Umständen geringfügig verändert werden, damit die in Abbildung 1 gezeigte Auflösung erreicht wird.

Säulentemperatur: 30 °C

7.5.3. Einspritzvolumen: 50 μl Derivatisierungsmittel und 50 μl Probelösung.

7.5.4.

Säulenäquilibrierung

Wird die Säule täglich neu gestartet, muss sie 15 Minuten lang mit Lösungsmittel B (100 %) gespült, dann bei einem Verhältnis A:B von 40:60 eingestellt und mit einem Durchfluss von 1 ml/min 15 Minuten lang äquilibriert werden. Danach wird ein Blindlauf unter Einspritzung von Methanol (4.2.1) durchgeführt.

Anmerkung: Bevor die Säule für längere Zeit gelagert wird, sollte sie 30 Minuten mit einer Mischung von Methanol und Chloroform im Verhältnis 80:20 (v/v) gespült werden.

7.5.5. Bestimmung des PS- und des PE-Gehalts des Testprobe

7.5.6.

Die chromatografischen Analysen werden in der entsprechenden Reihenfolge durchgeführt, wobei die Intervalle zwischen den Durchläufen konstant bleiben müssen, um konstante Retentionszeiten zu erhalten. Die externe Standardlösung (7.3) wird in alle 5-10 Testproben eingespritzt, damit der Kalibrierfaktor bewertet werden kann.

Anmerkung: Die Säule ist nach ungefähr 20-25 Durchläufen 30 Minuten mit 100 %iger Lösung B (7.5.1) zu spülen.

7.6.

Integrationsbetrieb

7.6.1.

PEDP-Peak

Das PEDP wird als einzelner Peak eluiert. Die Peak-Fläche wird durch Integration von Tal zu Tal ermittelt.

7.6.2.

Tryptamin-Peak

Das Tryptamin wird als einzelner Peak (siehe Abbildung 1) eluiert. Die Peak-Fläche wird durch Integration von Tal zu Tal ermittelt.

7.6.3.

PS- und PE-Peak-Gruppen

Unter den beschriebenen Bedingungen (Abbildung 1) ergibt PS zwei teilweise getrennte Haupt-Peaks, denen ein kleinerer Peak vorausgeht. PE ergibt drei teilweise getrennte Haupt-Peaks. Die Gesamtfläche des jeweiligen Peak-Bündels wird ermittelt, indem die Basislinie wie in Abbildung 1 zu sehen gezogen wird.

8.

BERECHNUNG UND DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

Der PS- und PE-Gehalt der Testprobe wird wie folgt berechnet: C = 55,36 × ((A₂)/(A₁)) × ((T₁)/(T₂)) Dabei sind:

C=

PS- oder PE-Gehalt (mg/100 g Pulver in der Testprobe)

A₁=

Peak-Fläche PEDP der Standard-Probenlösung (7.3)

A₂=

Peak-Fläche PS oder PE der Testprobe (7.2)

T₁=

Peak-Fläche Tryptamin der Standard-Probenlösung (7.3)

T₂=

Peak-Fläche Tryptamin der Testprobe (7.2)

9.

GENAUIGKEIT DER METHODE

Anmerkung: Die Werte für die Wiederholbarkeit wurden nach der Internationalen IDF-Norm berechnet⁽¹⁾. Der vorläufige Vergleichbarkeitsgrenzwert wurde gemäß Anhang III Buchstabe b berechnet.

9.1.

Wiederholbarkeit

Die relative Wiederholstandardabweichung beschreibt die Variabilität der Ergebnisse, die von dem gleichen Analytiker mit den gleichen Geräten unter den gleichen Bedingungen mit der gleichen Probe in kurzen Zeitabständen unabhängig voneinander erzielt wurden; ein Relativwert von 2 % sollte nicht überschritten werden. Werden zwei Bestimmungen unter diesen Bedingungen durchgeführt, sollte der relative Unterschied zwischen den beiden Ergebnissen nicht mehr als 6 % des arithmetischen Mittels der Ergebnisse betragen.

9.2.

Vergleichbarkeit

Werden zwei Bestimmungen von Analytikern in unterschiedlichen Laboratorien mit unterschiedlichen Geräten unter unterschiedlichen Bedingungen mit der gleichen Testprobe durchgeführt, sollte der relative Unterschied zwischen den beiden Ergebnissen nicht mehr als 11 % des arithmetischen Mittels der Ergebnisse betragen.

10.

LITERATUR

10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., „Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids.” Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).

Abbildung 1