BESTIMMUNG DES GEHALTS AN MAGERMILCHPULVER IN EINEM MISCHFUTTERMITTEL ÜBER PARAKASEIN NACH ENZYMATISCHER GERINNUNG

1.

GEGENSTAND

Bestimmung des Gehalts an Magermilchpulver in einem Mischfuttermittel durch enzymatische Parakasein-Gerinnung

2.

ANWENDUNGSBEREICH

Diese Methode gilt für Mischfuttermittel mit einem Anteil an Magermilchpulver von mindestens 10 %; das Vorhandensein größerer Mengen von Buttermilch und/oder bestimmter Nichtmilchproteine kann Interferenzen zur Folge haben.

3.

KURZBESCHREIBUNG

3.1. Lösung des im Mischfuttermittel enthaltenen Kaseins durch Extraktion mit einer Natriumcitrat-Lösung

3.2. Anpassung der zur Ausfällung des Kaseins notwendigen Kalziumionenkonzentration unter Zugabe von Lab

3.3. Der Stickstoffgehalt des ausgefällten Parakaseins wird nach der Kjeldahl-Methode bestimmt, wie in der ISO-Norm 8968-2:2001IDF 20-2:2001 beschrieben; der Gehalt an Magermilchpulver wird aufgrund eines Kaseingehalts von mindestens 27,5 % (siehe Absatz 8.1) berechnet.

4.

REAGENZIEN

Die Reagenzien müssen den zu Analysezwecken erforderlichen Reinheitsgrad aufweisen. Das verwendete Wasser muss destilliert sein oder einen mindestens gleichwertigen Reinheitsgrad aufweisen. Mit Ausnahme des Labs (4.5) müssen alle verwendeten Reagenzien und Lösungen frei von stickstoffhaltigen Stoffen sein.

4.1. Trinatriumcitrat als Dihydrat (Lösung zu 1 % w/v)

4.2. Calciumchlorid (Lösung etwa 5 M) 75 g CaCl₂ . 2H₂O werden in 100 ml destilliertem Wasser unter Schütteln aufgelöst (Vorsicht: exotherme Reaktion). Die Lösung bleibt über Nacht stehen und wird dann gefiltert. Die Lösung muss im Kühlschrank gelagert werden.

4.3. 0,1 n Natriumhydroxid

4.4. 0,1 n Chlorwasserstoffsäure

4.5. Flüssiges Kälberlab (Stärke etwa 100 IMCU/ml gemäß ISO-Norm 11815IDF 157); die Lösung ist im Kühlschrank bei 4 bis 6 °C zu lagern.

4.6. Reagenzien für die quantitative Stickstoffbestimmung nach der Kjeldahl-Methode, wie in ISO 8968-2:2001IDF 20-2:2001 erläutert.

5.

APPARATUR

Übliche Laborgeräte, insbesondere:

5.1. Reibschale oder Homogenisiergerät

5.2. Analysewaage mit einer Genauigkeit von 1 mg mit 0,1-mg-Teilung

5.3. Tischzentrifuge (500 g bzw. 2000 bis 3000 Umin^–1) mit 50-m-Röhrchen, Zentrifugalkraft 2000 g

5.4. Magnetrührer mit Rührstäben von 10 bis 15 mm

5.5. Bechergläser 150 bis 200 ml

5.6. 250- und 500-ml-Kolben

5.7. Glastrichter, Durchmesser 60 bis 80 mm

5.8. Aschefreie Schnellfilter mit einem Durchmesser von 150 mm (Whatman Nr. 41 oder gleichwertig)

5.9. Pipetten verschiedener Größe

5.10. Thermostatisierbares Wasserbad, einstellbar auf 37 °C ±1 °C

5.11. pH-Messgerät, Genauigkeit 0,1 pH

5.12. Thermometer, Genauigkeit 1 °C

6.

VERFAHREN

6.1.

Vorbereitung der Probe

10 bis 20 g Probe werden in einer Reibschale zerkleinert oder im Homogenisiergerät behandelt, um eine homogene Mischung herzustellen.

6.2.

Das Milchpulver wird aufgelöst und der nichtlösliche Rückstand abgetrennt.

6.2.1. 1,000 ± 0,002 g gut homogenisiertes Mischfutter (6.1) werden direkt in ein Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 50 ml eingewogen. 30 ml Trinatriumcitrat-Lösung (4.1) werden auf 45 °C ±2 °C erwärmt und hinzugegeben. Die Lösung wird mit dem Magnetrührer mindestens fünf Minuten gemischt oder kräftig von Hand geschüttelt.

6.2.2. Die Probe wird 10 Minuten bei 500 g (2000 bis 3000 Umin^–1) zentrifugiert und der Überstand in ein Becherglas mit einem Fassungsvermögen von 150 bis 200 ml abgegossen. Beim Abgießen ist darauf zu achten, dass kein Material verloren geht.

6.2.3. Nach dem gleichen Verfahren werden zwei weitere Extraktionen aus dem Rückstand durchgeführt; die beiden neuen Extrakte werden zum ersten Extrakt hinzugegeben.

6.2.4. Scheidet sich Fett ab, ist die Probe bis zur Verfestigung der Fettphase abzukühlen und das verfestigte Fett mit einem Spatel zu entfernen.

6.3.

Gerinnung des Kaseins durch Labenzyme

6.3.1. Unter ständigem Rühren werden tropfenweise 2 ml Calciumchlorid (4.2) zum gesamten wässerigen Extrakt (etwa 100 ml) hinzugegeben. Der pH-Wert wird mit NaOH- (4.3) oder HCl-Lösung (4.4) auf 6,4-6,5 eingestellt. Die Lösung wird 15 bis 20 Minuten in einem auf 37 °C ±1 °C eingestellten thermostatisierbaren Wasserbad gelassen, bis sich das Salzgleichgewicht eingestellt hat. Wenn die Lösung ein milchiges Aussehen angenommen hat, ist das Gleichgewicht erreicht.

6.3.2. Die Flüssigkeit wird in ein (oder zwei) Zentrifugenröhrchen umgefüllt und 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert, um die Ausfällungen zu entfernen. Der Überstand wird in ein (oder zwei) Zentrifugenröhrchen abgegossen, ohne den Niederschlag auszuwaschen.

6.3.3. Der Überstand wird wieder auf 37 °C ±1 °C erwärmt. Unter Rühren werden tropfenweise 0,5 ml des flüssigen Labs (4.5) zum Extrakt gegeben. Die Koagulierung erfolgt binnen zwei Minuten.

6.3.4. Die Probe wird ins Wasserbad zurückgestellt und 15 Minuten bei einer Temperatur von 37 °C ±1 °C stehen gelassen. Danach wird die Probe aus dem Wasserbad genommen und das Koagulum durch Umrühren aufgebrochen. 10 Minuten wird die Probe bei 2000 g zentrifugiert. Der Überstand wird durch ein geeignetes Filterpapier (5.8) gefiltert und das Filterpapier aufbewahrt. Der Niederschlag wird im Zentrifugenröhrchen mit 50 ml Wasser bei einer Temperatur von etwa 35 °C durch Umrühren gewaschen. Anschließend erfolgt nochmals eine Zentrifugierung über 10 Minuten mit 2000 g. Der Überstand wird durch das aufbewahrte Filterpapier gefiltert.

6.4.

Bestimmung des Kaseinstickstoffs

6.4.1. Nach dem Waschen wird der Niederschlag unter Verwendung von destilliertem Wasser quantitativ auf das gemäß Absatz 6.3.4 aufbewahrte Filterpapier gebracht. Das Filterpapier wird in den Kjeldahl-Kolben gegeben. Der Stickstoffgehalt wird nach der Kjeldahl-Methode bestimmt, wie in ISO-Norm 8968-2:2001IDF 20-2:2001 beschrieben.

7.

BLINDVERSUCH

7.1. Regelmäßig wird ein Blindversuch durchgeführt, indem die Probe nach der Kjeldahl-Methode wie in ISO-Norm 8968-2:2001IDF 20-2:2001 beschrieben mineralisiert wird. Ein aschefreies Filterpapier (5.8) wird mit einem Gemisch aus 90 ml Natriumcitrat (4.1), 2 ml Calciumchlorid-Lösung (4.2) und 0,5 ml flüssigem Lab (4.5) befeuchtet und dreimal mit 15 ml destilliertem Wasser gewaschen.

7.2. Das für den Blindversuch erforderliche Säurevolumen (4.4) ist von dem zur Titration der Probe verbrauchten Volumen abzuziehen.

8.

DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

8.1. Der Gehalt an Magermilchpulver in einem Mischfuttermittel wird nach folgender Formel berechnet: wobei gilt: N = Prozentsatz des Parakasein-Stickstoffes; 27,5 = Faktor zur Umrechnung des ermittelten Kaseins in Prozent Magermilchpulver; 2,81 und 0,908 = aus der Regressionsanalyse erhaltene Berichtigungsfaktoren.

9.

GENAUIGKEIT DER METHODE

9.1.

Wiederholbarkeit

In mindestens 95 % der untersuchten Fälle darf der Unterschied zwischen zwei einzelnen mit der gleichen Probe im gleichen Labor vom gleichen Analytiker erhaltenen Ergebnissen 2,3 g Magermilchpulver auf 100 g geprüftes Mischfutter nicht übersteigen.

9.2.

Vergleichbarkeit

In mindestens 95 % der untersuchten Fälle darf der Unterschied zwischen den von zwei Laboratorien mit einer gleichen Probe erhaltenen Ergebnissen 6,5 g Magermilchpulver auf 100 g untersuchtes Mischfutter nicht übersteigen.

10.

BEOBACHTUNGEN

10.1. Die Zugabe größerer Mengen bestimmter Fremdproteine, insbesondere Sojaproteine, kann — wenn sie mit der Milch erwärmt worden sind — erhöhte Werte zur Folge haben, da diese Stoffe gleichzeitig mit Milchparakasein ausgefällt werden.

10.2. Die Zugabe von Buttermilch kann zu niedrigen Werten führen, da bei der Bestimmung nur der fettfreie Anteil erfasst wird. Die Zugabe bestimmter aus Sauerrahm gewonnener Buttermilcharten kann zu deutlich niedrigeren Werten führen, da sie in der Citrat-Lösung nur unvollständig gelöst werden.

10.3. Die Zugabe von mindestens 0,5 % Lecithin kann ebenfalls zu niedrige Ergebnisse zur Folge haben.

10.4. Die Einbeziehung von auf hohe Temperaturen erwärmtem Magermilchpulver (high-heat) kann überhöhte Werte zur Folge haben, da bestimmte Molkeproteine mit dem Parakasein der Milch ausfällen.