1.

ZWECK

Bestimmung von Stigmastadienen in pflanzlichen Ölen, die diese Kohlenwasserstoffe nur in geringer Konzentration enthalten, insbesondere in nativen Olivenölen und rohem Oliventresteröl.

2.

ANWENDUNGSBEREICH

Das Verfahren läßt sich auf alle pflanzlichen Öle anwenden. Die Bestimmungen sind allerdings nur zuverlässig bei einer Konzentration dieses Kohlenwasserstoffs von 0,01 bis 4,0 mg/kg. Die Methode eignet sich besonders zum Nachweis von raffinierten pflanzlichen Ölen (Olivenöl, Oliventresteröl, Sonnenblumenöl, Palmöl usw.) in nativem Olivenöl, da raffinierte Öle im Gegensatz zu nativen Ölen Stigmastadien enthalten.

3.

PRINZIP

Isolierung der unverseifbaren Bestandteile. Abtrennung der Steroid-Fraktion durch Säulenchromatographie an Kieselgel und Analyse durch Kapillargaschromatographie.

4.

GERÄTE

4.1. 250-ml-Stehkolben, zur Verwendung mit Rückflußkühler geeignet.

4.2. 200-ml-Scheidetrichter.

4.3. 100-ml-Rundkolben.

4.4. Rotationsverdampfer.

4.5. Chromatographiesäule aus Glas (innerer Durchmesser 1,5 bis 2,0 cm, Länge 50 cm) mit Teflonhahn und Glaswattebausch oder Sinterglasscheibe am unteren Ende. Zur Vorbereitung der Kieselgelsäule mit Chromatographiesäule bis zu einer Höhe von etwa 5 cm mit Hexan füllen und dann eine Suspension von 15 g Kieselgel in 40 ml Hexan mit Hilfe von mehreren Anteilen Hexan einschlämmen und unter leichtem Klopfen vollständig absetzen lassen. Anschließend wasserfreies Natriumsulfat bis zu einer Höhe von rund 0,5 cm zugeben und das überschüssige Hexan ablaufen lassen.

4.6. Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor, Split- oder cold On-column-Injektor und Ofen mit einer Einstellgenauigkeit von ± 1 °C.

4.7. Fused-Silica-Kapillarsäule für Gaschromatographie (0,25 oder 0,32 mm Innendurchmesser und 25 m Länge), belegt mit 5 % Phenylmethylsilicon, Filmdicke 0,25 μm.

Anmerkung 1:

Andere Säulen mit vergleichbarer oder geringerer Polarität können ebenfalls verwendet werden.

4.8. Aufzeichnungsgerät mit Integrator mit Möglichkeit der Integration zwischen zwei Minima.

4.9. 5-10-μl-Mikrospritze für Gaschromatographie mit fester Nadel.

4.10. Pilzheizhaube oder Heizplatte.

5.

REAGENZIEN

Alle Reagenzien müssen, sofern nicht anders angegeben, von Analysequalität sein. Es ist destilliertes Wasser oder Wasser von mindestens gleichem Reinheitsgrad zu verwenden.

5.1. Hexan oder Alkanmischung mit einem Siedebereich von 65-70 °C, destilliert in einer Rektifiziersäule. Hexan kann durch Isooctan (2,2,4-Trimethylpentan für die Chromatografie) ersetzt werden, sofern vergleichbare Präzisionswerte erreicht werden. Der Rückstand nach der Verdunstung von 100 ml Lösungsmittel kann kontrolliert werden. Lösungsmittel mit einem höheren Siedepunkt als n-Hexan verdunsten langsamer. Allerdings sind sie aufgrund der Toxizität von Hexan zu bevorzugen.

5.2. Ethanol, 6 %ig (v/v).

5.3. Wasserfreies Natriumsulfat.

5.4. Ethanolische Kalilauge, 10 %ige Lösung. 10 ml Wasser zu 50 g Kaliumhydroxid geben, umrühren und die Mischung durch Zugabe von Ethanol lösen und mit Ethanol auf 500 ml auffüllen.

Anmerkung 3:

Ethanolische Kalilauge wird beim Stehen braun. Sie sollte täglich frisch zubereitet und in dunklen Glasflaschen gut verschlossen aufbewahrt werden.

5.5. Kieselgel 60 für Säulenchromatographie, 70-230 mesh (Merck, Art. Nr. 7734 o. ä.).

Anmerkung 4:

Gewöhnlich kann Kieselgel direkt aus dem Behälter ohne Vorbehandlung verwendet werden. Manche Kieselgelpartien weisen jedoch eine geringe Aktivität auf, was zu unbefriedigenden chromatographischen Trennungen führt. In solchen Fällen ist wie folgt vorzugehen: das Kieselgel durch mindestens vierstündiges Erhitzen auf 550 °C aktivieren, nach dem Erhitzen in einen Exsikkator stellen und nach dem Abkühlen in einen verschließbaren Kolben überführen; 2 % Wasser zugeben und schütteln, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind und das Pulver frei rieselt.

Kieselgelpartien, die Chromatogramme mit sich überlappenden Peaks ergeben, sind wie oben beschrieben zu behandeln. Eine Alternative ist die Verwendung von extrareinem Kieselgel 60 (Merck, Art. Nr. 7754).

5.6. Stammlösung (200 ppm) von Cholesta-3,5-dien (Sigma, 99 % rein) in Hexan (10 mg in 50 ml).

5.7. Standardlösung von Cholesta-3,5-dien in Hexan in einer Konzentration von 20 ppm. Dazu die obengenannte Lösung verdünnen.

Anmerkung 5:

Bei Temperaturen unter 4 °C halten sich die Lösungen 5.6 und 5.7 mindestens vier Monate lang.

5.8. Lösung aus n-Nonacosan in Hexan mit einer Konzentration von rund 100 ppm.

5.9. Trägergas für die Gaschromatographie: Helium oder Wasserstoff (99,9990 % rein).

5.10. Brenngase für den Flammenionisationsdetektor: Wasserstoff (99,9990 % rein) und gereinigte Luft.

6.

VERFAHREN

6.1.

Herstellung des Unverseifbaren:

6.1.1. 20 ± 0,1 g Öl in einen 250-ml-Kolben (4.1) einwiegen, 1 ml der Standardlösung von Cholesta-3,5-dien (20 μg) und 75 ml 10 %ige ethanolische Kalilauge zugeben, Rückflußkühler anschließen und 30 Minuten köcheln lassen. Den Kolben mit der Probe von der Hitzequelle nehmen und leicht abkühlen lassen (nicht vollständig abkühlen lassen, da die Probe sonst fest wird). 100 ml Wasser zugeben und die Lösung mit Hilfe von 100 ml Hexan in einen Scheidetrichter (4.2) geben. Die Mischung 30 Sekunden kräftig schütteln und zur Phasentrennung stehen lassen.

Anmerkung 6:

Bei Bildung einer Emulsion, die nicht gleich wieder verschwindet, kleine Mengen Ethanol zugeben.

6.1.2. Die untere, wäßrige Phase in einen zweiten Scheidetrichter überführen und wiederum mit 100 ml Hexan extrahieren. Die untere Phase erneut ablaufen lassen und die Hexanextrakte zusammen in einem weiteren Scheidetrichter dreimal mit je 100 ml einer Ethanol-Wassermischung (1: 1) waschen, bis diese pH-neutral reagiert.

6.1.3. Die Hexanlösung durch wasserfreies Natriumsulfat (50 g) laufen lassen, mit 20 ml Hexan waschen und in einem Rotationsverdampfer bei 30 °C im leichten Vakuum vollständig eindampfen.

6.2.

Abtrennung der Steroid-Fraktion:

6.2.1. Den Rückstand mit Hilfe von zwei Volumenanteilen Hexan (jeweils 1 ml) auf die Trennsäule aufgeben und soweit einziehen lassen, bis sich die Flüssigkeitsoberfläche bis über die Natriumsulfatschicht abgesenkt hat. Dann die Elution mit Hexan mit einer Flußrate von 1 ml/Minute beginnen. Die ersten 25 bis 30 ml des Eluats verwerfen, die folgenden 40 ml auffangen. Diese Fraktion in einen 100-ml-Rundkolben (4.3) überführen.

Anmerkung 7:

Die erste Fraktion enthält gesättigte Kohlenwasserstoffe (Abbildung 1a), die zweite Steroide. Danach werden Squalen und verwandte Verbindungen eluiert. Für eine gute Trennung zwischen den gesättigten Kohlenwasserstoffen und den Steroiden müssen die Fraktionsvolumina optimiert werden. Hierzu ist das Volumen der ersten Fraktion so zu regulieren, daß bei der Analyse der zweiten Fraktion nur kleine Peaks für gesättigte Kohlenwasserstoffe auftreten (siehe Abbildung 1c). Treten keine solchen Peaks auf und hat der Standardpeak gleichzeitig nur eine geringe Größe, so ist das Volumen der ersten Fraktion zu reduzieren. Im übrigen ist eine vollständige Trennung zwischen den Komponenten der ersten und zweiten Fraktion nicht erforderlich, da während der GC-Analyse unter den in Punkt 6.3.1 beschriebenen Arbeitsbedingungen eine Überlappung der Peaks nicht vorkommt. Eine Optimierung des Volumens der zweiten Fraktion ist in der Regel nicht notwendig, da sich die weiteren Komponenten gut abtrennen lassen. Ein großer Peak mit einer Retentionszeit von rund 1,5 Minuten unter dem des Standards ist jedoch auf das Vorhandensein von Squalen zurückzuführen und zeigt eine schlechte Trennung an.

6.2.2. Die zweite Fraktion im Rotationsverdampfer bei 30 °C im leichten Vakuum vollständig eindampfen und den Rückstand sofort in 0,2 ml Hexan auflösen. Die Lösung bis zur Analyse im Kühlschrank aufbewahren.

Anmerkung 8:

Die Rückstände 6.1.3 und 6.2.2 sollten nicht trocken und nicht bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden. Nach Gewinnung des Rückstands sofort das Lösungsmittel zugeben und die Lösung im Kühlschrank aufbewahren.

6.3.

Gaschromatographie

6.3.1. Arbeitsbedingungen für Split-Injektion:

—

Injektortemperatur: 300 °C,

—

Detektortemperatur: 320 °C,

—

Integrator: (Die Parameter für die Integration sind so zu wählen, daß die Peakflächen richtig beurteilt werden können. Empfohlen wird die Integration zwischen zwei Minima),

—

Empfindlichkeit: rund das 16-fache der Mindestdämpfung,

—

Einspritzvolumen: 1 μm Lösung,

—

Temperaturprogramm: 6 Minuten isotherm bei 235 °C, dann mit 2 °C/min auf 285 °C,

—

Injektor mit Stromteilventil (Splitverhältnis 1: 15),

—

Trägergasvordruck: ca. 120 kPa Helium oder Wasserstoff.

Diese Bedingungen können entsprechend den Kenndaten des Chromatographen und der Säule derart geändert werden, daß die damit aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen: Der Peak des internen Standards muß innerhalb von 5 Minuten vor oder nach der unter 6.3.2 genannten Zeit erscheinen und mindestens 80 % Vollausschlag erreichen. Das GC-System ist durch Einspritzen einer Mischung aus der Cholestadien-Stammlösung (5.6) und der n-Nonacosan-Lösung (5.8) zu überprüfen. Der Cholesta-3,5-dien-Peak muß vor dem n-Nonacosan-Peak erscheinen (Abbildung 1c). Ist dies nicht der Fall, so kann die ursprüngliche Ofentemperatur verringert und/oder die GC-Säule durch eine weniger polare Säule ersetzt werden.

6.3.2. Identifizierung der Peaks Der Peak der internen Standards erscheint nach rund 19 Minuten, derjenige von Stigmastadienen nach einer relativen Retentionszeit von rund 1,29 (Abbildung 1b). Das Stigmasta-3,5-dien tritt zusammen mit geringen Mengen eines Isomers auf; beide ergeben normalerweise aber nur einen Peak. Ist die Säule jedoch zu polar, oder hat sie eine große Trennleistung, kann das Isomer als kleiner Peak dicht vor dem des Stigmasta-3,5-dien erscheinen (Abbildung 2). Um sicherzugehen, daß die Stigmastadiene als ein Peak eluiert werden, empfiehlt es sich, die Säule durch eine weniger polare Säule oder eine Säule mit größerem Innendruchmesser zu ersetzen.

Anmerkung 9:

Ein Referenzchromatogramm für Stigmastadien erhält man durch die Analyse eines raffinierten pflanzlichen Öls mit einer kleineren Probe. Stigmastadiene rufen einen signifikanten, leicht identifizierbaren Peak hervor.

6.3.3. Quantitative Analyse Der Gehalt an Stigmastadienen wird nach folgender Formel berechnet: mg/kg Stigmastadienen = As McAc Mo

Hierin bedeuten:

As= Peakfläche von Stigmastadienen (wenn der Peak geteilt ist, Summe der Flächen beider Isomere), Ac= Peakfläche des internen Standards (Cholestadien), Mc= Masse des zugesetzten Standards in Mikrogramm, Mo= Masse des eingewogenen Öls in Gramm.

Nachweisgrenze: rund 0,01 mg/kg. Anmerkung 10: Wenn Stigmastadiene in einer Konzentration von über 4 mg/kg auftreten und eine Quantifizierung erforderlich ist, muss das Verfahren des Internationalen Olivenölrates für die Bestimmung von Sterenen in raffinierten Ölen angewendet werden.

Abb. 1:

Gaschromatogramme von Olivenölproben, analysiert auf einer Fused-Silica-Kapillarsäule (0,25 mm Innendurchmesser und 25 m Länge), belegt mit 5 % Phenylmethylsilicon (Filmdicke 0,25 μm).

a)

Erste Fraktion (30 ml) eines nativen Olivenöls, mit dem Standard versetzt.

b)

Zweite Fraktion (40 ml) eines Olivenöls mit 0,10 mg/kg Stigmastadienen.

c)

Zweite Fraktion (40 ml) mit einem kleinen Anteil der ersten Fraktion.

Gaschromatogramm einer Probe raffinierten Olivenöls, analysiert auf einer DB-5-Säule, auf dem das Isomer von Stigmasta-3,5-dien zu erkennen ist.