1.

ZWECK

Die vorliegende Norm beschreibt ein Verfahren zur Trennung und quantitativen Bestimmung der Zusammensetzung von Triglyceriden in Abhängigkeit von Molekulargewicht und Grad der Ungesättigtheit, ausgedrückt in „äquivalenten Kohlenstoffzahlen” (siehe Anmerkung 1).

2.

ANWENDUNGSBEREICH

Diese Norm gilt für alle pflanzlichen Öle, die Triglyceride langkettiger Fettsäuren enthalten. Das Verfahren eignet sich insbesondere zum Nachweis von kleinen Mengen linolsäurereicher halbtrocknender Öle in den Ölen, die überwiegend Ölsäure als ungesättigte Fettsäure enthalten, wie z. B. Olivenöl.

3.

PRINZIP

Trennung der Triglyceride durch Umkehrphasenchromatographie in Abhängigkeit von ihren äquivalenten Kohlenstoffzahlen und Auswertung der Chromatogramme.

4.

GERÄTE

4.1. Flüssigchromatograph, der so ausgestattet ist, daß die Temperatur der Säule über einen Thermostaten kontrolliert werden kann.

4.2. Einspritzsystem mit einer 10-μl-Probenschleife.

4.3. Detektor: Differentialrefraktometer. Im Bereich der höchsten Empfindlichkeit sollten wenigstens 10 ^-4 Einheiten des Brechungsindexes erreicht werden.

4.4. Säule: Säule aus rostfreiem Stahl von 250 mm Länge und 4,5 mm Durchmesser, gefüllt mit Kieselgelpartikeln, die mit Oktadecylsilan belegt sind (Durchmesser 5 μm). Die durchschnittliche Kohlenstoffbelegung sollte bei etwa 22—23 % liegen (siehe Anmerkung 2).

4.5. Schreiber und/oder Integrator.

5.

REAGENZIEN

Die Reagenzien müssen analytisch rein sein. Die Fließmittel sollten entgast sein. Sie können mehrere Male wiederverwendet werden, ohne daß dadurch die Trennleistungen beeinflußt werden.

5.1. Chloroform.

5.2. Aceton.

5.3. Acetonitril.

5.4. Fließmittel: Aceton/Acetonitril. Das Mischungsverhältnis ist so einzustellen, daß damit die gewünschte Trennung erzielt wird. Man geht zunächst von einem Mischungsverhältnis von 1:1 aus.

5.5. Lösungsmittel: Aceton oder eine Mischung von Aceton/Chloroform im Verhältnis 1:1.

5.6. Triglyceride als Referenzsubstanzen. Entweder mit Hilfe der im Handel verfügbaren Triglyceride (Tripalmitin, Triolein usw.) ein Diagramm aus den Retentionszeiten und den äquivalenten Kohlenstoffzahlen aufzeichnen oder ein Referenzchromatogramm des Sojaöls verwenden (siehe Anmerkungen 3 und 4 sowie Abbildungen 1 und 2).

6.

VORBEREITUNG DER PROBEN

Von der zu analysierenden Probe wird eine 5 %ige Lösung hergestellt, indem genau 0,5 g ± 0,001 g der Probe in einen 10-ml-Meßkolben eingewogen und mit dem Lösungsmittel (5.5) auf 10 ml aufgefüllt werden.

7.

VERFAHREN

7.1. Das HPLC-Gerät in Betrieb setzen. Das Fließmittel (5.4) wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/min durch die Säule gepumpt, um das gesamte System zu reinigen. Es wird so lange gewartet, bis eine stabile Grundlinie erreicht ist. Anschließend werden 10 μl der gemäß Ziffer 6 hergestellten Probe eingespritzt.

8.

BERECHNUNG UND ABFASSUNG DER ERGEBNISSE

Es wird die Methode der inneren Standardisierung angewandt, d. h. man geht davon aus, daß die Summe der Peakflächen, die den verschiedenen Triglyceriden entsprechen, 100 % darstellen. Der relative prozentuale Anteil eines jeden Triglycerids wird berechnet nach der Formel % TriglyceridPeakflächeSumme der Peakflächen100 Das Ergebnis ist auf eine Stelle nach dem Komma anzugeben.

Anmerkung 1:

Die Reihenfolge der Elution kann durch die Berechnung der „äquivalenten Kohlenstoffzahlen” (NCE) ermittelt werden. Diese sind wie folgt definiert:

NCE = NC - 2n.

Dabei ist NC die Zahl der Kohlenstoffatome und n die Zahl der Doppelbindungen.

Wenn n_o, n₁ und n_1n die Zahlen der Doppelbindungen sind, die von der Öl- bzw. der Linol- und Linolensäure stammen, so kann die äquivalente Kohlenstoffzahl berechnet werden nach der Formel

NCE = NC - d_on_o - d₁n₁ - d_1nn_1n.

Die Koeffizienten d_o, d₁ und d_1n können mit Hilfe der Triglyceride, die als Referenzsubstanzen benutzt wurden, berechnet werden. Unter den in dieser Methode beschriebenen Bedingungen gilt etwa folgende Beziehung

NCE = NC - 2,60 n_o - 2,35 n₁ - 2,17 n_1n.

Anmerkung 2: Beispiele:

Lichrosorb RP 18 (Merck) Art 50333,

Lichrospher 100 CH-18 (Merck) Art 50377 oder ähnliches Füllmaterial.

Anmerkung 3:

Man kann ebenfalls mit mehreren Triglyceriden als Referenzsubstanzen und mit Hilfe der korrigierten Retentionszeit TR′ = TR - TR_{Lösungsmittel} die Selektivität in bezug auf Triolein wie folgt berechnen:

αTR′TR′Olein

Die graphische Darstellung von log α = f (Zahl der Doppelbindungen) ermöglicht es, die Retention von allen Triglyceriden zu bestimmen, die die Fettsäuren enthalten, die in den als Referenzsubstanzen verwendeten Triglyceriden vorkommen (siehe Abbildung 2).

Anmerkung 4:

Die Trennfähigkeit der Säule muß eine klare Trennung des Trilinolein-Peaks (LLL) auch von den Peaks der Triglyceride ermöglichen, die eine nur wenig unterschiedliche Retentionszeit besitzen.

Anmerkung 5:

Rohes naturreines Olivenlampantöl und rohes Oliventresteröl müssen zur Erzielung einer sauberen Trennung des Trilinoleinpeaks vom linken und rechten Nachbarpeak oder von den Peaks etwaiger Verunreinigungen zunächst gemäß folgendem Verfahren gereinigt werden:

200 μl Öl werden unverdünnt auf eine Fest-Flüssig-Extraktions-Kieselgelsäule (Type SEP PAK silica cartridge-waters part. Nr. 51900) aufgegeben.

Die Triglyzeride werden innerhalb von höchstens 20 Sekunden mit 20 ml wasserfreiem Hexan für die HPLC eluiert.

Das Eluat wird im Stickstoffstrom abgeblasen und in Isopropanol oder Aceton (5 ml) gelöst. 10 bis 20 μl davon werden der HPLC-Säule aufgegeben. Es ist darauf zu achten, daß die Zusammensetzung der Fettsäuren vor und nach der Reinigung gleich ist, wobei der Fehlergrenze des verwendeten Analyseverfahrens Rechnung getragen wird.

Anmerkung:

P = Palmitinsäure; St = Stearinsäure; O = Ölsäure; L = Linolsäure; Ln = Linolensäure.

Anmerkung:

La = Laurinsäure; My = Myristinsäure; P = Palmitinsäure; St = Stearinsäure; O = Ölsäure; L = Linolsäure; Ln = Linolensäure.